施曉露 ，車鑫鋒 ，吳健美 ，狄 斌 ，喬宏偉 *，王優(yōu)美 **

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；2國家禁毒委員會辦公室中國藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心，毒品監(jiān)測管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

與常用檢材血液、尿液相比，毛發(fā)中的毒品檢測具有取樣簡便、易于存貯、檢測窗口期長、生長速度穩(wěn)定等特點(diǎn)［1-3］。通過毛發(fā)檢測技術(shù)可獲取更長時(shí)程的攝毒信息，推測藥物攝入時(shí)間，分析用藥行為［4-6］。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于公安機(jī)關(guān)的禁毒工作中，檢測結(jié)果在吸毒案件認(rèn)定中具有重要意義［7-8］。

2018年10月，公安部發(fā)布的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》（以下簡稱《規(guī)范》）中，根據(jù)毛發(fā)檢測協(xié)會（Society of Hair Testing，SoHT）提供的推薦閾值，規(guī)定了甲基苯丙胺（MA）、苯丙胺（AM）、6-單乙酰嗎啡（6-MAM）、嗎啡（MOR）的檢測閾值為0.2 ng/mg［9］。根據(jù)《規(guī)范》的相關(guān)規(guī)定，當(dāng)毛發(fā)中相關(guān)物質(zhì)的檢測含量在閾值以上時(shí)，即表明被檢測人員在最近6個(gè)月內(nèi)攝入過毒品。

然而，在實(shí)際案件中，存在吸毒人員承認(rèn)吸毒行為但毛發(fā)檢測含量低于《規(guī)范》規(guī)定的閾值的情況。一方面，可能是由于各地實(shí)驗(yàn)室的前處理方法提取不充分；另一方面，可能是吸毒人員吸食量較低，或者近年來吸毒人員毛發(fā)中毒品含量發(fā)生較大變化所致。該情況的發(fā)生會導(dǎo)致禁毒部門的執(zhí)法力度無法得到保證。由此可以合理推斷，毛發(fā)前處理技術(shù)應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，毛發(fā)檢測閾值應(yīng)適當(dāng)下調(diào)。但毛發(fā)檢測閾值也不能過低，因?yàn)榉巧娑救藛T（如毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員、濫用環(huán)境中未吸食人員等）若長期暴露于毒品環(huán)境當(dāng)中，毒品及其代謝物也會存在于毛發(fā)中［10］，可能造成假陽性的結(jié)果。因此，在閾值評估時(shí)需要考慮兩者之間的平衡，以免造成誤判，增加執(zhí)法成本，影響公安機(jī)關(guān)的執(zhí)法公信力。

目前，國內(nèi)針對如何區(qū)分吸毒人群和被動污染人群的閾值研究未見報(bào)道。國外相關(guān)研究常采用污染實(shí)驗(yàn)來制備受污染樣品，但這似乎無法反映被動暴露期間實(shí)際發(fā)生的情況［11-12］。基于以上背景，本研究首先利用UPLC-MS/MS建立了針對甲基苯丙胺、6-單乙酰嗎啡及其代謝物快速高效前處理方法，對真實(shí)吸毒人員毛發(fā)樣品和被動接觸毒品人員毛發(fā)樣品分別進(jìn)行檢測分析。通過接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）、Youden 指數(shù)并結(jié)合實(shí)際應(yīng)用涉及的影響因素進(jìn)行閾值評估，同時(shí)還分析了兩種毒品與代謝物之間的比率關(guān)系，旨在探討一種更加符合我國國情的研判標(biāo)準(zhǔn)，以區(qū)分被動污染與主動吸食毒品的人群，為公安部今后修訂毛發(fā)檢測閾值奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

MA、AM、6-MAM、MOR 對照品（公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心，國家毒品實(shí)驗(yàn)室）；氘代內(nèi)標(biāo)儲備液MA-D5、AM-D5、6-MAM-D3、MOR-D3（公安部第三研究所）；甲酸銨（質(zhì)譜純，美國Sigma-Aldrich 公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國Honeywell 公司）；十二烷基磺酸鈉（化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

ACQUITY UPLC?Xevo TQ-XS 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Waters 公司）；CPA224S 萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；研磨儀（北京萬孚智能科技有限公司）；KQ-600DE 超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MIX-2500 渦旋儀（杭州佑寧儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7μm）；流動相：A 相為5mmol/L甲酸銨-0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫程序：0.0~0.5 min，5%B；0.5~1.0 min，5%~10%B；1.0~5.0 min，10%~15%B；5.1~6.0 min，15%~100%B；6.0~6.1 min，100%~5%B；6.1~7.0 min，5%B。流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1μL；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：4 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 掃描方式：電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：1 000 V；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：150 ℃；碰撞氣流量：0.15 mL/min；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；氣簾氣流量：150 L/h；各目標(biāo)物MRM參數(shù)見表1。

Table 1 MRM parameters of four target compounds with their internal standards

2.2 對照品溶液配制

一級儲備液：將4 種目標(biāo)物用甲醇分別配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取0.5 mL 于10 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋成含各目標(biāo)物50 μg/mL的一級儲備液；分別取4 種氘代內(nèi)標(biāo)的1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL 于20 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成含4 種氘代內(nèi)標(biāo)的1μg/mL 的一級儲備液。

工作內(nèi)標(biāo)溶液：取氘代內(nèi)標(biāo)一級儲備液1 mL于50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得20 ng/mL氘代內(nèi)標(biāo)混合溶液。取適量，按甲醇與水體積比7∶3配制成14 ng/mL工作內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 樣品前處理

取適量毛發(fā)于15 mL塑料離心管中，依次加入0.1% SDS 溶液、純水、丙酮各5 mL 振蕩洗滌后置于通風(fēng)櫥中晾干。稱取毛發(fā)樣品約20 mg 于5 mL具蓋研磨管中，分別加入甲醇-水（7∶3）溶液和工作內(nèi)標(biāo)溶液500μL。在研磨儀中以3 000 r/min 研磨提取100 s。提取完成后，用1 mL 一次性注射器移取液體并過0.2μm GHP 微孔濾膜于2 mL 離心管中。取適量過濾后的提取液與甲醇-水（3∶7）溶液按體積比1∶1混合至進(jìn)樣小瓶中，渦旋儀混勻后使用 UPLC-MS/MS分析［13］。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 選擇性 將不同來源的空白毛發(fā)、加標(biāo)空白毛發(fā)及同時(shí)加入混合對照品與內(nèi)標(biāo)的空白毛發(fā)，經(jīng)“2.3”項(xiàng)下前處理后檢測?？疾炜瞻酌l(fā)基質(zhì)與工作內(nèi)標(biāo)溶液是否影響對目標(biāo)分析物的測定。圖1 顯示空白毛發(fā)基質(zhì)和工作內(nèi)標(biāo)溶液對各目標(biāo)物的檢測無明顯干擾，該分析方法可以區(qū)分目標(biāo)分析物與基質(zhì)中的其他組分。

Figure 1 Chromatograms of four target compoundsA: Blank hair samples containing 20 ng/mL working solution of 4 target compounds;B: Blank hair samples with internal standards of 4 target compounds;C:Blank hair matrix of 4 target compounds

2.4.2 線性范圍、檢出限及定量下限 取適量4種目標(biāo)物的一級儲備液用甲醇-水（7∶3）溶液配制成系列濃度梯度的混合工作溶液，各取500 μL 加入空白毛發(fā)中，再加入工作內(nèi)標(biāo)溶液500μL，按照“2.3”項(xiàng)前處理后得到質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，4，5 ng/mg 的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品毛發(fā)樣本，進(jìn)行分析。以目標(biāo)物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，與之對應(yīng)的濃度（x）為橫坐標(biāo)作線性回歸（權(quán)重：1/x）。同法將一級儲備液加入到空白毛發(fā)中，配制成最終質(zhì)量濃度為0.001，0.002，0.004，0.005，0.008 ng/mg 的毛發(fā)樣本進(jìn)樣分析，以離子對豐度比符合規(guī)定范圍且信噪比S/N=3為檢出限（LOD），S/N=10為定量下限（LLOQ）。AM在0.01~4 ng/mg 的范圍內(nèi)線性良好，其他目標(biāo)物在0.01 ~5 ng/mg 范圍內(nèi)線性良好。LOD 在0.001 ~ 0.008 ng/mg，LLOQ 均為0.01 ng/mg。決定系數(shù)（R2）均大于0.999 6，結(jié)果見表2。

Table 2 Linear ranges,determination coefficients,lower limit of detection(LLOQ)and limit of detection(LOD)of four target compounds

2.4.3 準(zhǔn)確度和精密度 將4種目標(biāo)物的一級儲備液用甲醇-水（7∶3）溶液逐級稀釋為一系列混合工作溶液，按照“2.3”項(xiàng)下各取500μL加入空白毛發(fā)中，再加入工作內(nèi)標(biāo)溶液500μL經(jīng)前處理后，配制為低（0.02 ng/mg）、中（0.5 ng/mg）、高（4 ng/mg）3 個(gè)濃度的對照品毛發(fā)樣本，每一濃度點(diǎn)各制備6個(gè)平行質(zhì)控樣品，于“2.1”項(xiàng)下分析方法進(jìn)行分析，連續(xù)測定3 d，計(jì)算準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度，各分析物準(zhǔn)確度和精密度見表3。

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 將4種目標(biāo)物溶液使用甲醇-水（7∶3）溶液作為稀釋劑配制成低（0.4 ng/mL）、中（10 ng/mL）、高（80 ng/mL）3 個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行配置6 份，與等體積工作內(nèi)標(biāo)溶液一同加入裝有空白毛發(fā)的研磨管中，經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，記錄峰面積為（Ab）；同法配制上述3 組目標(biāo)物溶液，加入內(nèi)標(biāo)后調(diào)節(jié)甲醇與水體積比為1∶1 后進(jìn)樣分析，記錄峰面積為（Aa）；使用毛發(fā)基質(zhì)溶液作為稀釋劑配制3 組目標(biāo)物溶液，加入內(nèi)標(biāo)后調(diào)節(jié)甲醇水比例為1∶1 進(jìn)樣分析，記錄檢測峰面積記為（Ac）?；|(zhì)效應(yīng)=Ac/Aa；提取回收率= Ab/Ac。由表3 可知，基質(zhì)效應(yīng)為99.19% ~109%，說明毛發(fā)基質(zhì)對檢測無明顯干擾。各待測物的提取回收率均在85%~115%以內(nèi)。

2.5 方法應(yīng)用

2.5.1 樣本信息 2020 年采集社區(qū)戒毒社區(qū)康復(fù)人員毛發(fā)281 份和各地公安機(jī)關(guān)毒品實(shí)驗(yàn)室收集的吸毒人員毛發(fā)242 份，共計(jì)523 份。采集自各地毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的毛發(fā)共430 份，毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的樣本作為易被動污染樣本，用于代表社會層面有可能因?yàn)楸粍游廴径徽`判的人群，同時(shí)也能較好地模擬實(shí)際暴露污染的情況。

2.5.2 檢測結(jié)果 表4匯總了兩組分析對象毛發(fā)中4種目標(biāo)物的檢測統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

吸毒人員組：在高于定量限的443 份MA 樣本中，有133 份（30.0%）樣本未同時(shí)檢測到AM，這133 份樣本中檢測到的 MA 含量有101 份（75.9%）低于0.1 ng/mg。在高于定量限的198份6-MAM 樣本中，有19份（9.6%）樣本未同時(shí)檢測到MOR。

毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員組：在檢測到高于定量限的 67 份MA 樣本中，有 57 份（85.1%）樣本未同時(shí)檢測到AM，這57 份樣本中檢測到的MA 含量有53份（93.0%）低于0.1 ng/mg。在高于定量限的24份6-MAM 樣本中，有20 份（83.3%）樣本未同時(shí)檢測到MOR。

Table 4 Detection of four target compounds in drug intaking group and contamination group

表5 統(tǒng)計(jì)了吸毒人員毛發(fā)中代謝物與原形藥物的比率。吸毒人員組：310 份（70%）同時(shí)檢測到高于定量限的 MA 和 AM 樣本中，AM 與 MA 的比率為0.000 5~0.359 7。179 份（90.4%）同時(shí)檢測到高于定量限的 6-MAM 和MOR 樣本中，MOR 與6-MAM 的比率為0.048 4~7.929 8。毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員組：10 份（14.9%）同時(shí)檢測到高于定量限的 MA 和 AM 樣本中，AM 與 MA 的比率為 0.008 ~0.159。4 份（16.7%）同時(shí)檢測到高于定量限的6-MAM 和 MOR 樣 本 中 ，MOR 與 6-MAM 的 比 率 為0.13~0.22。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

金標(biāo)準(zhǔn)：吸毒人員組中承認(rèn)吸食毒品的人員相應(yīng)的毛發(fā)檢測含量為陽性樣本，毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員作為易接觸毒品人群，相應(yīng)的目標(biāo)物毛發(fā)檢測含量為陰性樣本。吸毒人員組承認(rèn)吸食甲基苯丙胺的受試者有379 名、承認(rèn)吸食海洛因的有216名。

Table 5 Metabolite-to-parent drug ratio of drug users

Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)和 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，甲基苯丙胺379 份陽性樣本和430 份陰性樣本、海洛因216 份陽性樣本和430 份陰性樣本之間有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

4 種目標(biāo)物繪制的ROC 曲線如圖3 所示。MA、AM、6-MAM、MOR 的 AUC 分 別 為 0.948，0.927，0.840，0.863。根據(jù)評價(jià)指標(biāo)，當(dāng)ROC 曲線的曲線下面積AUC =［0.85，0.95］，說明此分類器性能很好。通過本檢測方法的定量限制約及最高Youden 指數(shù)所對應(yīng)的閾值，得到理論最佳判定閾值分別為：MA ≥0.018 ng/mg，特異性和靈敏度為90.5%、91.6%；AM ≥ 0.010 ng/mg，特異性和靈敏度為90.5%、91.6%；6-MAM ≥ 0.036 ng/mg，特異性和靈敏度為97.4%、67.6%；MOR ≥ 0.011 ng/mg，特異性和靈敏度為99.3%、72.1%。該閾值要遠(yuǎn)低于現(xiàn)行《規(guī)范》中規(guī)定的閾值。具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)詳見表6。

Figure 3 Receiver operating characteristic (ROC) curves of four target compoundsA:MA;B:AM;C:MOR;D:6-MAM

3 討 論

3.1 前處理方法優(yōu)化

提取溶劑的優(yōu)化：對甲醇、乙腈、超純水、甲醇-水（1∶1）和乙腈-水（1∶1）5 種提取溶劑的提取效果進(jìn)行考察［14］。結(jié)果顯示，甲醇-水和乙腈-水較好，但由于乙腈-水會使MOR 在色譜檢測中裂峰，而甲醇-水與乙腈-水的提取效果相當(dāng)，因此最后選擇甲醇-水作進(jìn)一步的優(yōu)化。分別考察了甲醇-水體積比為1∶9~9∶1的提取效果，體積比為7∶3時(shí)即提取效果最優(yōu)。因此選擇甲醇-水（7∶3）作為提取溶劑。

同時(shí)，對進(jìn)樣溶劑比例、研磨轉(zhuǎn)速、研磨時(shí)間、超聲時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化。以甲醇-水（7∶3）的溶劑比例直接進(jìn)樣檢測會導(dǎo)致MOR 裂峰，故經(jīng)試驗(yàn)后調(diào)節(jié)溶劑最終進(jìn)樣比例為5∶5 以優(yōu)化MOR 峰型；磨儀轉(zhuǎn)速的增加會使研磨更充分，但高轉(zhuǎn)速下會使提取劑升溫、膨脹導(dǎo)致研磨管損壞，根據(jù)結(jié)果綜合考慮最終選擇3 000 r/min；由于各目標(biāo)物濃度基本在100 s 時(shí)達(dá)到峰值，故最終選擇研磨時(shí)間為100 s；超聲處理能夠有效地降低毛發(fā)的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，提高提取效率，但結(jié)果顯示超聲處理的增效作用并不明顯，因此，為了縮短前處理時(shí)間選擇不進(jìn)行超聲處理。

3.2 閾值評估

閾值評估的目標(biāo)是使真陽性率（靈敏度）盡可能高，以識別到更多的吸毒人員，同時(shí)要使假陽性率盡可能低，以免造成誤判。因此引入了Youden指數(shù)計(jì)算理論最佳閾值。美國濫用物質(zhì)和精神健康服務(wù)管理局（Substance Abuse and Mental Health Services Admission，SAMHSA）規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有在閾值的40%濃度時(shí)的定量分析能力［15］。受限于目前檢測技術(shù)的水平，除6-MAM 的理論最佳閾值0.036 ng/mg 能夠滿足SAMHSA對實(shí)驗(yàn)室的定量要求外，MA、AM、MOR的閾值暫時(shí)都無法直接應(yīng)用。

理論最佳閾值是以假設(shè)其假陰性和假陽性的危害性具有同等意義為前提下Youden指數(shù)最大時(shí)所對應(yīng)的值，但由于毒品檢測的特殊性，在實(shí)戰(zhàn)應(yīng)用時(shí)兩者危害性并不相等。不能單純以理論最佳閾值作為這4種目標(biāo)物的判定閾值，除了參考AUC與Youden 指數(shù)外，還需要對執(zhí)法成本和執(zhí)法力度進(jìn)行抉擇，針對當(dāng)下情況選擇一個(gè)更加符合實(shí)際的閾值。表7 給出了不同閾值下的真陽性率和假陽性率作為參考。根據(jù)表7，MA 在以0.1 ng/mg 作為閾值時(shí)，AM 在以0.025 ng/mg 作為閾值時(shí)，MOR在以0.05 ng/mg 作為閾值時(shí)，真陽性率有較大提升，假陽性率也維持在較低水平，而6-MAM 的閾值在0.025與0.05之間真陽性率變化不大，但假陽性率變化明顯，因此將閾值定為0.05 ng/mg，故最終推薦閾值為：MA ≥ 0.1 ng/mg，AM ≥ 0.025 ng/mg，6-MAM ≥ 0.05 ng/mg，MOR ≥ 0.05 ng/mg。但受限于陰性組樣本量、儀器檢測水平和執(zhí)法成本與力度之間的取舍問題，本研究給出的建議閾值，在未來研究中仍有較大的可優(yōu)化空間。

Table 6 Statistical results of ROC curve analysis of four target compounds

Table 7 Reference ranges for four target compounds cut-off value

代謝物與原形藥物比率在判斷被動污染與主動吸食時(shí)也具有一定意義［16-17］。但由于個(gè)體差異、吸毒習(xí)慣等不確定性因素的影響，該比率范圍較寬且不唯一，可作為區(qū)分主動吸食與被動污染的輔助參考指標(biāo)，不充當(dāng)必要條件。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，陰性組的比率范圍要明顯低于陽性組，并且陽性組與文獻(xiàn)中報(bào)道的比率范圍相符［18-19］。

4 總 結(jié)

基于公安禁毒部門在執(zhí)行《規(guī)范》過程中發(fā)現(xiàn)的實(shí)際問題，本研究首先優(yōu)化了毛發(fā)中AM、MA、6-MAM、MOR 的前處理方法，該方法符合生物樣本分析的各項(xiàng)要求，且能夠穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速，可靠地運(yùn)用于實(shí)際涉毒案件中。

應(yīng)用本研究優(yōu)化的前處理方法，對收集自全國各地吸毒人員與毒品實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員毛發(fā)樣品進(jìn)行分析?；诜治鼋Y(jié)果得出的理論最佳閾值低于《規(guī)范》中建議的閾值。經(jīng)過與實(shí)際相結(jié)合重新評估，本研究提出的推薦閾值，能為公安系統(tǒng)對閾值的合理評估提供參考。