王海燕，邵小光，王美仙，黃杰，陶仕英，史艷彬，王磊，牛建昭，李健*（. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，北京 040；. 大連市婦女兒童醫(yī)療中心（集團），大連 遼寧 6000）

近年來，體外受精-胚胎移植（IVF/ICSI-ET）應(yīng)用于不孕不育患者使眾多婦女成功妊娠。但卵巢功能是否正常對體外受精（IVF）妊娠率的影響較大。很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)卵巢儲備功能低下（DOR）的患者，其妊娠率低，周期取消率高。DOR指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長發(fā)育并形成可受精卵母細(xì)胞的能力，此能力取決于原始卵泡的數(shù)量和質(zhì)量。若卵巢內(nèi)可募集的卵泡數(shù)量減少或卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，配子生成功能下降，可致生育能力下降，稱作卵巢儲備功能減退，也叫卵巢儲備功能下降。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DOR患者容易發(fā)生卵巢低反應(yīng)性（POR），而且胚胎質(zhì)量差，影響臨床妊娠率，如何改善DOR患者的胚胎質(zhì)量是如今研究的熱點。

中醫(yī)認(rèn)為，DOR的主要病機是腎精不足、腎虛血瘀。中藥坤靈丸是臨床常用中成藥，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血、逐瘀生新的作用，用于月經(jīng)不調(diào)、宮寒、久不受孕、習(xí)慣性流產(chǎn)等的治療。現(xiàn)代研究表明，坤靈丸其活血化瘀成分對于改善子宮動脈血流有一定的作用。子宮動脈的卵巢支供血卵巢，因此推測坤靈丸改善卵巢血供對提高卵巢功能可能有益。

本文采用隨機對照方法，觀察了坤靈丸對DOR患者IVF/ICSI-ET后胚胎質(zhì)量的影響，探索針對DOR患者開展人工輔助生殖的預(yù)處理策略，為坤靈丸在臨床的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 DOR患者的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡25～42歲（包括25及42歲）；符合博洛尼亞DOR診斷標(biāo)準(zhǔn)[自然周期雙側(cè)卵巢竇卵泡（AFC）＜7個和/或抗苗勒氏管激素（AMH）＜1.1 ng·mL]，且治療前3個月均未使用任何改善卵巢儲備功能的藥物治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除染色體核型異常、生殖器官畸形、手術(shù)切除單側(cè)卵巢、腫瘤放療化療術(shù)后患者；排除早發(fā)型卵巢儲備功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）患者。

1.2 研究對象

本研究經(jīng)大連市婦女兒童醫(yī)療中心倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文件號：2020010）。納入2020年1月至2021年4月于本中心就診行IVF/ICSI-ET助孕的DOR患者，共100例，隨機分為兩組：坤靈丸組和對照組，各50例，對DOR患者IVFET治療后的采卵后各項指標(biāo)情況進(jìn)行觀察。坤靈丸組脫落4例（不能按時服藥3例，發(fā)熱未采卵1例），對照組脫落1例（發(fā)熱未采卵）。坤靈丸組和對照組分別含46例和49例DOR患者，采集靜脈血及進(jìn)行超聲AFC監(jiān)測。坤靈丸組口服坤靈丸15丸Bid，用藥兩個月經(jīng)周期后來月經(jīng)第3～5日進(jìn)行拮抗劑促排，并繼續(xù)口服坤靈丸至采卵日。對照組應(yīng)用拮抗劑方案促排卵。分析坤靈丸組及對照組DOR患者的激素水平變化、獲卵數(shù)目、2個原核（2PN）受精數(shù)目，2PN受精率、可利用胚胎數(shù)目、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目、優(yōu)質(zhì)胚胎率及注射絨毛膜促性腺激素日（hCG日）E濃度。

1.3 試藥和儀器

三維彩超（美國Voluson E8，GE）。三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Labotect C200），所有胚胎使用一步培養(yǎng)液（美國globaltotal LP）培養(yǎng)，2PN胚胎培養(yǎng)至第3日（D3，采卵日為D0）移植或冷凍。Leica DM 2500顯微鏡（德國徠卡公司）。BCS196低溫冷臺（Linkam Scientic Instruments，英國）。

坤靈丸[天津天士力（遼寧）制藥有限責(zé)任公司，濃縮丸，規(guī)格：0.125 g/丸]。尿促性素（hMG，75 U/支，麗珠集團麗珠制藥廠），果納芬注射液（450 U/支，默克雪蘭諾），西曲瑞克（0.25 mg/支，默克雪蘭諾），醋酸加尼瑞克（0.25 mg/支，默沙東公司）。絨毛膜促性腺激素（hCG，麗珠集團麗珠制藥廠），醋酸曲普瑞林注射液（德國輝凌制藥有限公司，0.1 mg/支）。

1.4 促排方案

來月經(jīng)第2～4日開始應(yīng)用hMG或果納芬注射液150～300 U促排，卵泡在12～14 mm時根據(jù)黃體生成素水平應(yīng)用拮抗劑注射用西曲瑞克0.25 mg或注射用醋酸加尼瑞克0.25 mg。優(yōu)勢卵泡至17～20 mm時，應(yīng)用注射用hCG 10 000 U或醋酸曲普瑞林注射液0.2 mg扳機，34～36 h采卵。采卵后第1日（D1）觀察是否受精，D3觀察胚胎質(zhì)量。視情況選擇胚胎冷凍或新鮮移植，移植后12～14 d觀察是否受孕。

1.5 優(yōu)質(zhì)胚胎診斷標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)質(zhì)胚胎：D3 評估6細(xì)胞以上1～2級的優(yōu)質(zhì)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎（來源于2PN），碎片小于30%的胚胎為可利用胚胎，可以進(jìn)行移植或冷凍?？捎门咛ィ?細(xì)胞3級以上的胚胎，可以移植或冷凍。1級胚胎，卵裂球大小均等，透亮，無碎片；2級胚胎，卵裂球大小不均等和/或碎片率小于10%；3級胚胎，碎片率10%～50%；4級胚胎：碎片率＞50%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)（四位間距）[M（P，P）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±

s

）表示，組間比較采用獨立樣本

t

檢驗，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者的年齡、基礎(chǔ)雌二醇（E）、基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）、基礎(chǔ)黃體生成素（LH）、抗苗勒氏管激素（AMH）以及體質(zhì)量指數(shù)（BMI）均無顯著差異（

P

＞0.05）（見表1）。AFC、促性腺激素（Gn）使用天數(shù)、Gn用量、受精方式、同型半胱氨酸差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 兩組患者一般資料比較[M(P，P)]
Tab 1 General data between the two groups [M (P，P)]

特征 坤靈丸組（n＝46） 對照組（n＝49） Z/χ2 P年齡/歲 女 36.5（32，39） 36（32，38） －0.665 0.506男37（33，39.5） 35（32，38） －1.57 0.116 BMI/（kg·m—2） 22.2（20.15，23.9） 20.85（19.38，25.5） －0.782 0.434不孕年限/年 2（1，4） 2.5（2，5） －1.258 0.208原發(fā)或繼發(fā)不孕/例 原發(fā) 27 27 0.125 0.724繼發(fā) 19 22受精方式/例 IVF 27 32 0.441 0.507 ICSI 19 17 AFC/個 4（3，5） 4（3，5.5） －0.782 0.434 AMH/（ng·L－1） 0.6（0.49，0.78） 0.69（0.47，0.95） －1.367 0.172基礎(chǔ)E2/（pg·mL—1） 40.00（29.48，48.07） 47（33.59，63.93） －1.780 0.075基礎(chǔ)FSH/（IU·L—1） 8.85（6.89，11.92） 8.48（6.98，11.67） －0.045 0.964基礎(chǔ)LH/（IU·L—1） 4.34（3.18，7.16） 4.59（3.45，5.7） －0.424 0.671 PRL/（ng·mL—1） 13.54（10.86，20.83） 15.36（11.9，19.31） 0.385 0.700 CA125/（U·mL—1） 14.32（9.21，22.40） 18.11（14.14，26.31） －1.664 0.096同型半胱氨酸 7.35（6.13，9.05） 8（7，9.83） －1.654 0.098 Gn起始量/U 300（281.25，300） 300（225，300） －0.237 －0.813 Gn使用天數(shù)/d 9（8，10） 8.5（7，10） －0.928 0.354 Gn用量/U 2475（2006.25，3000） 2400（1968.75，3000） －0.636 0.524

2.2 坤靈丸組用藥前后激素水平和AFC比較

坤靈丸組用藥后 FSH、LH水平低于用藥前（Z＝－3.202、－3.116，

P

＝0.001、0.002）。坤靈丸預(yù)處理前后E、AFC無明顯區(qū)別（Z＝－0.551，－1.073，

P

＝0.582、0.283）。結(jié)果見表2。

表2 坤靈丸組用藥前后激素水平和AFC比較
Tab 2 Hormone level and AFC in Kunling pill group before and after the treatment

注（Note）：與坤靈丸組用藥后比較，＜0.05（Compared with the Kunling pill group after the treatment，＜0.05）。

時間 E2/（pg·mL－1） FSH /（IU·L－1） LH/（IU·L－1） AFC/個用藥前 40.00（29.48，48.07） 8.85（6.89，11.91）* 4.34（3.18，7.16）* 4（3，5）用藥后 36.35（32.82，45.85） 6.61（5.66，8.69） 3.23（2.34，4.38） 4（3，5）

2.3 兩組實驗室及臨床結(jié)局分析

兩組比較，獲卵數(shù)目、2PN受精受精數(shù)目、可利用胚胎數(shù)目、2PN受精率、新鮮周期著床率、妊娠率、HCG日E差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。坤靈丸組優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目和優(yōu)質(zhì)胚胎率大于對照組（

P

＜0.05），移植一次妊娠率（56.25%）略高于對照組（50%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表3 兩組患者實驗室及臨床結(jié)局比較[M(P，P)，(%)]
Tab 3 Laboratory and clinical outcomes of the two groups [M(P25，P75)，(%)]

項目 坤靈丸組（n＝46） 對照組（n＝49） Z/χ2 P獲卵數(shù)目/個 4（2.75，5） 3（2，5） －0.751 0.453 2PN受精數(shù)目/個 2.5（2，4） 3（2，3） －0.498 0.619可利用胚胎數(shù)目/個 2.5（2，3.25） 2（1，3） －0.903 0.367優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目/個 1（0.75，2） 0（0，1） －2.936 0.003 2PN受精率 72.32%（128/177） 69.66%（124/178） 0.303 0.582優(yōu)質(zhì)胚胎率 45.24%（57/126） 30.43%（35/115） 5.583 0.018新鮮周期著床率 29.82%（17/57） 29.41%（15/51） 0.192 0.661移植一次妊娠率 56.25%（18/32） 50%（14/28） 0.234 0.628 HCG日E2濃度/（pg·mL－1） 873.2（622.5，1103） 918.4（607.65，1396.00） －0.284 0.776

3 討論

3.1 DOR西醫(yī)治療進(jìn)展

DOR處于POI早期，無臨床癥狀，只有生化水平的異常表現(xiàn)，是育齡期女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾病，DOR患者所占比例在門診不孕女性中占約10%。妊娠需要優(yōu)質(zhì)的胚胎和良好的子宮內(nèi)膜容受性，優(yōu)質(zhì)胚胎是妊娠發(fā)生的首要條件。由于DOR患者的異質(zhì)性較高，有一部分患者因為沒有高質(zhì)量的胚胎而被迫取消移植周期。因此如何獲得優(yōu)質(zhì)胚胎和良好的妊娠結(jié)局是研究的重點。輕度的卵巢儲備功能減退可以通過增加Gn用量改善其臨床妊娠結(jié)局；真正的POR或重度DOR，應(yīng)用大劑量的Gn，即使加大Gn用量可募集到的卵子不僅數(shù)量少且質(zhì)量較差，可移植胚胎數(shù)減少，妊娠率顯著下降，卵巢強力刺激并不能改善重度DOR患者的結(jié)局。如何改善DOR患者的妊娠結(jié)局，成為了眾多學(xué)者研究的熱點。有學(xué)者研究了生長激素或抗氧化制劑輔酶Q10及硫酸脫氫表雄酮在DOR或POR患者IVF中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其可以提高DOR患者的胚胎種植率及臨床妊娠率，改善其IVF-ET結(jié)局。但缺乏大樣本的臨床對照研究，結(jié)果需進(jìn)一步證實。也有學(xué)者研究雌激素、孕激素在POI和POF中的應(yīng)用，有一定短期療效，但會影響肝腎代謝能力，增加患癌風(fēng)險及血栓風(fēng)險等，長期應(yīng)用具有諸多弊端。

3.2 坤靈丸用于IVF前預(yù)處理機制

當(dāng)前西醫(yī)試管嬰兒技術(shù)的應(yīng)用，為DOR患者帶來了希望，但不同于卵巢儲備功能良好的患者，DOR患者基礎(chǔ)卵泡數(shù)目少，胚胎獲得數(shù)目少，優(yōu)質(zhì)胚胎相對少。有時需要反復(fù)的控制性卵巢刺激（COS）以追求更多的獲卵數(shù)和更多的胚胎，需多次采卵才能最大機會受孕。但這一治療方案價格高昂，可控的個體化 COS 方案有限。拮抗劑（GnRH-A）方案近年被臨床廣泛應(yīng)用，在POR患者中，GnRH-A和GnRH-a長方案對于IVF臨床結(jié)局的影響無顯著差異，GnRH-A方案可減少Gn用量，縮短Gn用藥時間。因此本文DOR患者統(tǒng)一選用GnRH-A方案，對患者有益且能排除促排方案不均一的影響。在西醫(yī)促排治療的基礎(chǔ)上用坤靈丸預(yù)處理，調(diào)節(jié) H-P-O 軸以改善卵巢儲備功能、提高卵巢反應(yīng)性、減少激素藥物的應(yīng)用、從而增加妊娠率，臨床效果好，不良反應(yīng)少。坤靈丸由31味中藥材組成，其中肉蓯蓉、鹿角膠、地黃、龜甲膠、五味子起到補肝腎、益精血的作用。主要用于腎虛、氣滯血瘀，但基本涵蓋了不孕癥的基本證型，可改善卵巢功能，提高子宮內(nèi)膜容受性并具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血、逐瘀生新的功效，在臨床上用于促排卵、子宮內(nèi)膜增生、卵巢早衰、降低IVF-ET流產(chǎn)率等。但尚無對DOR患者的IVF臨床對照研究。

3.3 本文研究結(jié)果及文獻(xiàn)回顧

本研究為前瞻性研究，結(jié)果顯示兩組基礎(chǔ)內(nèi)分泌情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。坤靈丸組用藥后FSH和LH水平低于用藥前，提示坤靈丸能夠調(diào)節(jié)激素水平，降低DOR患者FSH和LH水平。高FSH對胚胎質(zhì)量有負(fù)面影響，降低基礎(chǔ)FSH水平，預(yù)防卵泡早期發(fā)育，能使促排時卵泡更加同步。研究表明，基礎(chǔ)FSH水平增高與獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)和移植胚胎數(shù)下降顯著相關(guān)，與受精率和流產(chǎn)率無明顯相關(guān)性?；A(chǔ)LH升高對促排過程及結(jié)局也有負(fù)面影響。外周血基礎(chǔ)LH升高（≥10 U·L）主要見于兩類患者，一類是臨床常見的多囊卵巢綜合征（PCOS）患者，另一類是卵巢功能低下或者衰竭的患者，以高齡或圍絕經(jīng)期女性多見。從分析的數(shù)據(jù)來看，對于基礎(chǔ)LH水平過高（≥10 U·L）的患者，嘗試使用全程拮抗劑平穩(wěn)控制LH水平是可行的，可能有助于降低高危患者早發(fā)LH峰的風(fēng)險，改善助孕結(jié)局。研究結(jié)果顯示坤靈丸組獲卵數(shù)目、2PN受精數(shù)、可利用胚胎數(shù)目、移植一次妊娠率略高于對照組，而優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目和優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著優(yōu)于對照組（

P

＜0.05）。有研究表明在補腎疏肝法的基礎(chǔ)上適當(dāng)加用活血藥，可以改善血循環(huán)，增加卵巢血流量，還可以升高E、降低FSH及抑制顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成，在增加卵巢指數(shù)方面均有明顯的優(yōu)勢。尤昭玲等將 IVF-ET過程進(jìn)行分期，并根據(jù)各期的臨床特點，應(yīng)用中醫(yī)分期輔助治療，發(fā)現(xiàn)采用相應(yīng)的中藥口服，能收集到足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)卵細(xì)胞，提高胚胎的質(zhì)量，提高子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性，達(dá)到提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率的目的。張寧發(fā)現(xiàn)在 IVF-ET 治療前3個月，口服補腎化痰中藥能提高優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率，降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生率。動物實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中藥方劑對DOR大鼠的卵巢功能具有保護(hù)作用。坤靈丸在大鼠胚胎-胎仔發(fā)育的藥理毒性實驗研究表明，相當(dāng)于人類口服劑量43.2倍的劑量對大鼠母體及胎仔無明顯影響。因此，坤靈丸應(yīng)用于臨床安全可靠。

綜上所述，坤靈丸對于提高優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目及優(yōu)質(zhì)胚胎率有幫助。在IVF應(yīng)用拮抗劑的基礎(chǔ)上預(yù)先應(yīng)用坤靈丸，盡管沒有提高獲卵數(shù)目，妊娠率無顯著性差異，但是能顯著提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，而且安全性高。下一步將增大樣本量，統(tǒng)計累計妊娠率和活產(chǎn)率，對坤靈丸提高DOR患者優(yōu)質(zhì)胚胎質(zhì)量的分子機制進(jìn)行深入探討。