傅秋黎 姚克

浙江大學(xué)眼科醫(yī)院 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院眼科中心，杭州 310009

白內(nèi)障是由老化、遺傳、外傷等各種原因引起的晶狀體蛋白變性聚集、晶狀體混濁而導(dǎo)致視力障礙的眼科疾病，也是全球首要的致盲眼病。目前，利用人類晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)構(gòu)建的二維模型是研究白內(nèi)障最常用的體外模型。近年來隨著干細(xì)胞技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)的突飛猛進(jìn)，利用干細(xì)胞培養(yǎng)類器官進(jìn)而構(gòu)建疾病模型已成為兼具科研價(jià)值與臨床前景的研究熱點(diǎn)，在2021年類器官更是被列為“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)。類器官是在體外培養(yǎng)構(gòu)建的與人體組織器官具有一致的宏觀及微觀三維結(jié)構(gòu)，甚至具備相應(yīng)生理功能的簡化版器官，其可以模擬體內(nèi)真實(shí)器官的結(jié)構(gòu)與功能，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了全新的研究方法與治療手段。類器官的培養(yǎng)一般來源于組織中的成體干細(xì)胞，或是具有廣泛分化潛能的多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells，PSCs)，PSCs又包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。這些具備自我更新和定向分化能力的細(xì)胞可以在特定的培養(yǎng)條件下自我生長并組裝成具有精密排列規(guī)律和空間結(jié)構(gòu)的類器官。長期以來，研究者在不斷探索的過程中已通過不同細(xì)胞來源和培養(yǎng)方法成功于體外構(gòu)建出多種再生晶狀體，也稱為晶狀體小體(lentoid bodies，LBs)。

1 干細(xì)胞在晶狀體再生中的作用

研究者們最早觀察到的晶狀體再生現(xiàn)象來自于以蠑螈為代表的低等兩棲動物。蠑螈可以在晶狀體摘除后通過背側(cè)虹膜色素上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化實(shí)現(xiàn)晶狀體的再生，這一過程也可以通過體外培養(yǎng)蠑螈虹膜色素上皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。不同于具備強(qiáng)大再生能力的兩棲動物，目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物中晶狀體的再生現(xiàn)象均依賴于結(jié)構(gòu)相對健全、完整、無粘連折疊的晶狀體囊膜，這是由于晶狀體的前囊膜及赤道部囊膜上排布的LECs中夾雜有可以定向分化為LECs的成體干細(xì)胞，即晶狀體干細(xì)胞。早期研究發(fā)現(xiàn)在摘除兔、小鼠和大鼠的晶狀體后，囊膜上殘留的晶狀體干細(xì)胞均可生長出晶狀體樣組織，但其完整性和透明性欠佳。而在體外培養(yǎng)兔、小鼠以及人類LECs的過程中也可通過與晶狀體囊膜、玻璃體、睫狀體中成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)得到具有三維結(jié)構(gòu)的晶狀體樣組織，并且其中一些已經(jīng)擁有一定的透明性及光學(xué)特性，且可從中檢測到包括αA、αB、β和γ-crystallin在內(nèi)的多種晶狀體特異性標(biāo)志物。此后我國中山眼科中心研究團(tuán)隊(duì)為了盡可能保存晶狀體囊膜上具有再生潛力的干細(xì)胞，縮小了撕囊口并將其移至囊膜周邊部，采用該術(shù)式吸除晶狀體的兔、食蟹猴甚至是兒童白內(nèi)障患者均實(shí)現(xiàn)了術(shù)后透明晶狀體組織的再生，雖然該方法并不適用于細(xì)胞增生水平較弱的成年個(gè)體以及存在遺傳突變的先天性白內(nèi)障患兒，距離臨床應(yīng)用還有很多亟待解決的問題，但其有力地印證了存在大量具備強(qiáng)大增生潛能的干細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)晶狀體再生的首要生物學(xué)基礎(chǔ)。

2 利用PSCs體外構(gòu)建LBs

相較于只能定向分化且難以從體內(nèi)分離獲取的晶狀體干細(xì)胞，人源性ESCs和iPSCs具有在體外無限增生、可分化為三胚層中不同組織細(xì)胞的能力，目前被廣泛應(yīng)用于各發(fā)育時(shí)期各類細(xì)胞的分化培養(yǎng)以及三維類器官的體外構(gòu)建。在眼科領(lǐng)域，利用PSCs在體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜類器官和角膜類器官已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)，其中角膜類器官具有角膜發(fā)育中同樣的特征并表現(xiàn)為上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮3層結(jié)構(gòu)；視網(wǎng)膜類器官在誘導(dǎo)分化過程中經(jīng)歷了胚胎眼發(fā)育的各階段，擁有視網(wǎng)膜組織中所有細(xì)胞類型并可呈現(xiàn)分層結(jié)構(gòu)。2010年，Yang等通過調(diào)控在晶狀體發(fā)育過程中極為重要的成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Wnt通路，創(chuàng)建了三階段培養(yǎng)法，開創(chuàng)性地將人ESCs分化培養(yǎng)為具有三維結(jié)構(gòu)的LBs，該方法也成為未來晶狀體體外培養(yǎng)新方法衍生迭代的技術(shù)基礎(chǔ)。隨后Qiu等于2012年將年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的LECs重編程去分化為iPSCs，并在體外經(jīng)過三階段培養(yǎng)將其誘導(dǎo)為LBs，為人類自體來源的iPSCs體外誘導(dǎo)LBs開創(chuàng)了先河。本研究團(tuán)隊(duì)于2017年探索出一種晶狀體類器官構(gòu)建新方法——“荷包蛋法”，將人尿源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(urinary human induced pluripotent stem cells，UiPSCs)通過三階段培養(yǎng)，早期機(jī)械篩選，在分化過程中出現(xiàn)“荷包蛋樣”細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最終在第25天時(shí)發(fā)育為成熟透明的LBs。該再生晶狀體直徑已達(dá)到目前已知最大的3 mm，包含正常晶狀體擁有的所有結(jié)構(gòu)，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)1.73倍左右的放大率。而Murphy等在分化過程中通過識別LECs的特異性抗原對細(xì)胞進(jìn)行篩選，為LBs的體外大規(guī)模構(gòu)建提供了一種簡單有效的方法。2020年，Ali等借助“荷包蛋法”將人外周血單核細(xì)胞來源的iPSCs培養(yǎng)成LBs，并通過對人ESCs和iPSCs來源的LBs轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)譜系高度重疊且與正常晶狀體一致，證明2種干細(xì)胞來源的再生晶狀體誘導(dǎo)方法等效且可靠，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

3 利用晶狀體類器官構(gòu)建體外研究模型

人晶狀體類器官的體外誘導(dǎo)過程模擬了人胚胎晶狀體的發(fā)育歷程，在分化過程中相應(yīng)時(shí)間可檢測到與發(fā)育過程一致的特異性晶狀體基板標(biāo)志物、早期晶狀體標(biāo)志物和纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。本研究團(tuán)隊(duì)在通過“荷包蛋法”誘導(dǎo)LBs的過程中發(fā)現(xiàn)一長鏈非編碼RNA：lncRNA ALB，它可以通過調(diào)節(jié)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B活化而調(diào)控自噬過程，影響細(xì)胞核、細(xì)胞器的退化及代謝廢物的及時(shí)清除，從而在人晶狀體正常發(fā)育過程及透明性維持中發(fā)揮作用。考慮到LBs誘導(dǎo)分化的過程本身即可作為一個(gè)發(fā)育學(xué)模型，我們相信未來大量關(guān)于晶狀體發(fā)育機(jī)制的基礎(chǔ)研究可以借助于該體外模型相對便捷而直觀地開展。

穩(wěn)定可靠的疾病模型是研究白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制、病理生理特點(diǎn)及治療手段的必要基礎(chǔ)。本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)利用UiPSCs來源的LBs構(gòu)建出包括年齡相關(guān)性白內(nèi)障和先天性白內(nèi)障在內(nèi)的體外疾病模型。本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)LBs培養(yǎng)成熟后會隨著時(shí)間推移逐漸喪失透明性，并且這一混濁過程會因過氧化氫暴露而加速，同時(shí)還從中檢測到了白內(nèi)障進(jìn)展過程中至關(guān)重要的晶狀體蛋白聚集以及自噬活性的改變，這表明本研究團(tuán)隊(duì)借助過氧化氫氧化處理LBs，在世界上首次體外構(gòu)建了人源性年齡相關(guān)性白內(nèi)障疾病模型。同時(shí)為了構(gòu)建先天性白內(nèi)障體外模型，本研究團(tuán)隊(duì)將2個(gè)帶有不同先天性白內(nèi)障基因突變遺傳家系的UiPSCs誘導(dǎo)分化成LBs，發(fā)現(xiàn)患者來源的LBs均出現(xiàn)明顯混濁，且其混濁程度和形態(tài)特征與患者白內(nèi)障的外觀和分型高度一致，LBs分化過程也與患者的病程特征十分相似，這表明本研究團(tuán)隊(duì)首次構(gòu)建出了可高度反映患者遺傳背景與疾病特征的先天性白內(nèi)障體外模型。

體外疾病模型的建立不僅會推動白內(nèi)障病理機(jī)制研究的進(jìn)一步發(fā)展，還可以為白內(nèi)障的藥物研發(fā)和篩選提供可靠的實(shí)驗(yàn)平臺。目前包括羊毛甾醇在內(nèi)的化合物已被報(bào)道可以在二維細(xì)胞模型和動物模型上通過阻止晶狀體蛋白異常聚集發(fā)揮療效；但這些藥物的穩(wěn)定性和有效性仍需更可靠的人源性疾病模型驗(yàn)證，研究者若能借助LBs白內(nèi)障體外模型篩選出具有明確療效的白內(nèi)障新藥，將大大有助于降低診療費(fèi)用、提供早期治療機(jī)會、避免手術(shù)創(chuàng)傷和并發(fā)癥，切實(shí)地造福于患者。

將LBs作為白內(nèi)障致病機(jī)制研究和候選藥物評估的體外模型，相對于以往傳統(tǒng)的細(xì)胞和動物模型而言具有不可替代的優(yōu)勢：相較于氧化性藥物和紫外線輻照誘導(dǎo)的白內(nèi)障動物模型可以避免全身毒性的干擾以及物種異質(zhì)性的影響；相較于人LECs細(xì)胞模型可以模擬人類晶狀體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和微環(huán)境中各組分的相互作用，從而獲得更真實(shí)、更接近在體狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們期待更多的中國研究者可以借助先進(jìn)的LBs模型開展實(shí)驗(yàn)，以期進(jìn)一步探明白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及藥物靶點(diǎn)。

4 展望

白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，藥物研發(fā)也仍存在很大的空白，未來，我國的眼科研究者需要在加深對人晶狀體發(fā)育和再生的分子機(jī)制認(rèn)識的基礎(chǔ)上不懈推進(jìn)LBs構(gòu)建方法的演進(jìn)和迭代。正常成年人類晶狀體的直徑為9 mm，目前培養(yǎng)出最大的LBs的直徑僅為3 mm。因此提升LBs相對于正常晶狀體形態(tài)和功能的一致性仍是下一階段研究的重要任務(wù)。另一方面，隨著再生醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞療法的飛速進(jìn)步，人PSCs來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移植治療年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床試驗(yàn)已經(jīng)開展，而利用PSCs誘導(dǎo)LBs植入眼內(nèi)替代混濁的晶狀體，作為一種值得探索的白內(nèi)障新療法，其可行性目前仍有諸多難點(diǎn)需要解決，這或許需要借助多學(xué)科交叉融合，利用生物材料和組織工程技術(shù)研發(fā)細(xì)胞支架和載體，從而支撐并引導(dǎo)干細(xì)胞增生分化為理想的三維結(jié)構(gòu)；同時(shí)也需要眼科研究者對調(diào)控晶狀體再生的信號通路和干細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)行更加深入細(xì)致的探索，培養(yǎng)出標(biāo)準(zhǔn)化且具備屈光性能的再生晶狀體，推進(jìn)晶狀體類器官治療白內(nèi)障早日實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

利益沖突