程金鳳 王倩倩 甄萌萌 程艷麗

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濱州 256600

晝夜節(jié)律是生物體在生理和行為上約24 h為周期的生理性節(jié)律，控制晝夜節(jié)律的系統(tǒng)稱為生物鐘（circadian clock）［1］。生物鐘是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的一種內(nèi)源性適應(yīng)機(jī)制，通過周期性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)許多行為和生理功能，如睡眠-覺醒調(diào)節(jié)、血壓、脂質(zhì)代謝以及激素的分泌［2-3］。生物鐘是由基因控制的，我們稱之為生物鐘基因（clock genes）［4］。Cry1作為其中一種主要的生物鐘基因，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞周期具有重要的作用，其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致生物體晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂。Cry1的表達(dá)紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生和發(fā)展具有一定關(guān)系。本綜述結(jié)合最新研究進(jìn)展闡述生物鐘基因Cry1在AS中的作用，并探討其可能的機(jī)制。

生物鐘節(jié)律的分子機(jī)制

生物鐘可分為中樞生物鐘和外周生物鐘，哺乳動(dòng)物的中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（SCN），外周生物鐘存在于機(jī)體各組織細(xì)胞內(nèi)。中樞生物鐘將內(nèi)源性的晝夜節(jié)律與外部太陽日同步，隨后向外周生物鐘發(fā)送同步信號(hào)，使機(jī)體在組織水平上保持一致的節(jié)奏［5］。核心鐘基因和鐘控基因統(tǒng)稱為生物鐘基因，核心鐘基因主要有Clock和Bmal1（又稱arnt1）、Per1/2/3、Cry1/2。鐘控基因主要有Npas2、Rev-erbα、Hlf、Dbp、Tef、E4bp4、Stral3/dec1、Rorα、Ck1?等。

生物鐘作用的分子基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路，驅(qū)動(dòng)時(shí)鐘組件有節(jié)奏的表達(dá)。此環(huán)路由2個(gè)激活因子（Clock和Bmal1）和2個(gè)抑制因子（Per和Cry）驅(qū)動(dòng)，還包括調(diào)節(jié)磷酸化的激酶和磷酸酶，從而定位和穩(wěn)定這些時(shí)鐘蛋白［1］。Clock與Bmal1的基因表達(dá)產(chǎn)物是具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）-PAS結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，二者結(jié)合形成異源二聚體Clock/Bmal1，在轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核后，異源二聚體激活含有E-box順式調(diào)控增強(qiáng)子序列的靶基因Per和Cry的轉(zhuǎn)錄，并在細(xì)胞質(zhì)中翻譯成Per和Cry蛋白，當(dāng)Per和Cry蛋白積累達(dá)到一定濃度后，會(huì)形成穩(wěn)定的Per/Cry異源二聚體從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，這些異源二聚體通過作用于Clock/Bmal1復(fù)合體抑制自身的轉(zhuǎn)錄，形成主要的負(fù)反饋回路。當(dāng)Cry、Per mRNA和蛋白質(zhì)的濃度降低，一旦Cry-Per復(fù)合物的核水平不足以實(shí)現(xiàn)自抑制，新的Per和Cry轉(zhuǎn)錄周期就會(huì)開始。此外，異源二聚體Clock/Bmal1也可激活Rev-erbα的轉(zhuǎn)錄，Rev-erbα蛋白通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合維甲酸相關(guān)孤兒受體反應(yīng)元件（ROREs）的啟動(dòng)子，抑制Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄，也可抑制Clock和Cry1基因的轉(zhuǎn)錄。因此，Bmal1可通過參與Rev-erbα的轉(zhuǎn)錄激活抑制自身轉(zhuǎn)錄。與Cry/Per復(fù)合物通過直接作用于Clock/Bmal1異源二聚體來抑制自身的表達(dá)不同，Rev-erbα通過抑制至少一種激活因子的轉(zhuǎn)錄來間接抑制自身的轉(zhuǎn)錄［6-8］。

生物鐘基因Cry1與AS

AS是以脂質(zhì)代謝障礙為基礎(chǔ)的血管炎癥性疾病，是大多數(shù)心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）的潛在病理。雖然最近在治療方面取得了一定的進(jìn)展，但是AS及其并發(fā)癥依然是老年人死亡最常見的原因［9］。血脂異常、肥胖、糖尿病、高血壓和吸煙是已被證實(shí)的心血管危險(xiǎn)因素，越來越多的研究表明晝夜節(jié)律的紊亂與CVD之間存在著顯著關(guān)聯(lián)［10］，Cry1基因的表達(dá)異常也影響著AS的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，與27例健康受試者（對(duì)照組）相比，招募的36例AS患者中Cry1 mRNA的表達(dá)顯著降低，在人促使斑塊形成的血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中，包括Cry1在內(nèi)的生物鐘基因表達(dá)水平減弱，增強(qiáng)斑塊破裂，影響AS的進(jìn)程［11］。接下來從炎癥、高血壓、糖脂代謝方面探討生物鐘基因Cry1對(duì)AS發(fā)展產(chǎn)生的影響。

1、生物鐘基因Cry1與炎癥

AS是一種慢性炎癥性疾病，伴有內(nèi)皮功能障礙、泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌細(xì)胞增生等復(fù)雜病理變化［12］。研究顯示，核心鐘基因Cry1的表達(dá)可能是炎癥過程的潛在影響因素［13］。Cry蛋白被證明是先天免疫和炎性反應(yīng)的基本免疫調(diào)節(jié)成分。Cry1基因表達(dá)受損與血漿促炎細(xì)胞因子水平升高相關(guān)，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和 誘 導(dǎo) 型 一 氧 化 氮 合 酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）以細(xì)胞自主方式升高［8］。內(nèi)皮功能障礙在CVD尤其是AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是AS發(fā)展的早期發(fā)現(xiàn)和標(biāo)志。核心鐘基因Cry1通過調(diào)節(jié)睡眠剝奪過程中的炎癥過程，在觸發(fā)內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮重要作用。睡眠剝奪小鼠模型中，Cry1的表達(dá)減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）、黏附分子［如血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子（ICAM）-1、E選擇素（E-selectin）］表達(dá)增加，單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合增強(qiáng)，增加了AS的風(fēng)險(xiǎn)［13］。當(dāng)在睡眠剝奪小鼠體內(nèi)過表達(dá)Cry1后，促炎細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)、單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合受到抑制，這意味著Cry1可能參與調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。此外，過表達(dá)Cry1可以通過與腺苷酸環(huán)化酶相互作用抑制環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的產(chǎn)生，Cry1蛋白的缺失減弱其對(duì)cAMP生成的抑制，導(dǎo)致cAMP水平升高和蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活增加，隨后通過S276位點(diǎn)p65的磷酸化導(dǎo)致核因子（NF）-κB激活［8］。Qin與Deng［13］通過Western blot檢測(cè)睡眠剝奪小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中p65的磷酸化狀態(tài)，與對(duì)照組相比，睡眠剝奪組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中p65的磷酸化水平顯著上調(diào)，而這一結(jié)果可被Cry1過表達(dá)顯著抑制。本實(shí)驗(yàn)螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，過表達(dá)Cry1顯著抑制NF-κB在內(nèi)皮細(xì)胞中的活化。此外，過表達(dá)Cry1顯著降低Toll樣受體（TLR）2、TLR4蛋白的表達(dá)［14］。綜上所述，Cry1可以通過調(diào)控TLR/NF-κB通路緩解AS的發(fā)展。

2、生物鐘基因Cry1與高血壓

晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致醛固酮、腎素、血管緊張素Ⅱ和糖皮質(zhì)激素等激素分泌的變化，這些激素在一定程度上與血壓的日常調(diào)節(jié)節(jié)律有關(guān)。血壓的變化取決于內(nèi)源性和外源性因素。內(nèi)部因素包括自主神經(jīng)活動(dòng)和體液因素（皮質(zhì)醇、腎素、血管活性腸肽和醛固酮）。外部因素包括身體的活動(dòng)、飲食、情緒狀態(tài)和睡眠/清醒狀態(tài)［2］。血壓的一個(gè)顯著特征是它的晝夜節(jié)律性，從黎明開始升高，中午達(dá)到峰值，下午下降，達(dá)到最小值［15］。健康人的夜間血壓會(huì)下降10%～20%。靜息血壓變化不超過10%的人被稱為“非杓型血壓”。鹽敏感性高血壓和非杓型高血壓可增加CVD的死亡風(fēng)險(xiǎn)［2］。

近年來的研究表明，晝夜節(jié)律機(jī)制在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。高血壓組的小鼠Cry1水平明顯低于正常血壓組［2］。Doi等［16］在Cry1/Cry2基因敲除小鼠中研究了血壓，與對(duì)照組小鼠相比，Cry1-/2-小鼠的血壓晝夜變化特征消失，血漿醛固酮水平顯著升高，表現(xiàn)出鹽敏感性高血壓，使用選擇性醛固酮受體拮抗劑依普利酮，鹽敏感性高血壓表型可以得到改善［17］。3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）被認(rèn)為是醛固酮合成過程中的一個(gè)限速步驟，在對(duì)導(dǎo)致Cry1-/2-小鼠腎上腺功能障礙的生成酶的研究中，發(fā)現(xiàn)了Hsd3b6是Cry基因失活導(dǎo)致小鼠鹽敏感性高血壓的關(guān)鍵酶。Hsd3b6是3β-HSD的一個(gè)亞型，僅在腎上腺球狀帶細(xì)胞中表達(dá)。在Cry1-/2-小鼠腎上腺中，Hsd3b6 mRNA水平升高，3β-HSD酶活性增強(qiáng)，使血漿醛固酮水平升高。人類Hsd3b1基因與小鼠Hsd3b6基因在功能上是對(duì)應(yīng)的，因?yàn)镠sd3b1在人類腎上腺醛固酮生成細(xì)胞中表達(dá)［15-16］。

高血壓導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生，其病理基礎(chǔ)是其供應(yīng)血管發(fā)生動(dòng)脈僵硬、AS、狹窄和閉塞［18］。因此早期診斷治療高血壓對(duì)治療AS病變有著重要作用。而血壓晝夜節(jié)律的紊亂會(huì)影響高血壓的預(yù)后，臨床指南也強(qiáng)調(diào)了將血壓維持在正常水平的重要性，因?yàn)閲?yán)格控制血壓與降低主要心血管事件和死亡風(fēng)險(xiǎn)有著很強(qiáng)的相關(guān)性［19］。

3、生物鐘基因Cry1與脂代謝

AS是一種脂質(zhì)來源的炎癥性疾病，涉及多細(xì)胞改變，以脂質(zhì)斑塊形成為特征［12］。脂質(zhì)是細(xì)胞膜和脂蛋白的組成成分，其作為細(xì)胞內(nèi)、外的信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞生理方面有著廣泛的影響。脂質(zhì)代謝中有很多關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，包括Rev-erb、ROR蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、PPARγ和PPARδ等。這些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子存在于肝臟、脂肪組織中，受到生物鐘的調(diào)控，并呈現(xiàn)晝夜節(jié)律表達(dá)，當(dāng)晝夜節(jié)律障礙時(shí)，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂、肥胖和代謝疾?。?0］。大量文獻(xiàn)表明，生物鐘基因影響脂質(zhì)代謝關(guān)鍵限速酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激素等表達(dá)，參與機(jī)體脂代謝反應(yīng)調(diào)控，維持動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)平衡，防止脂肪過多堆積，這提示生物鐘在脂類代謝中有著重要的潛在功能。Ando等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，ob/ob小鼠在代謝異常出現(xiàn)之前，脂肪組織中Cry1等生物鐘基因的表達(dá)就已經(jīng)表現(xiàn)出降低現(xiàn)象，提示生物鐘基因表達(dá)異常先于脂肪代謝紊亂。Barclay等［22］的研究表明，Cry基因的缺失會(huì)增加飲食引起的肥胖癥易感性，高脂飲食的Cry1-/2-小鼠顯示出與脂肪攝取和生成相關(guān)基因FASN、ACC1、LPL、DGAT1的上調(diào)，出現(xiàn)脂質(zhì)蓄積。此外，有研究表明，與高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠相比，過表達(dá)Cry1的ApoE-/-小鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度均有所下降，小鼠主動(dòng)脈竇斑塊面積減小［14］。ChREBP-α可驅(qū)動(dòng)脂肪生成，從而導(dǎo)致肝臟脂肪變性的發(fā)生，最近的研究顯示，Cry1通過結(jié)合ChREBP-α的c-末端基序和降低ChREBP-α全長(zhǎng)蛋白的豐度來促進(jìn)ChREBP-α的降解，抑制脂肪生成［23］。綜上，Cry1可通過降低血脂水平延緩AS的進(jìn)展。

4、生物鐘基因Cry1與糖代謝

高血糖是微血管并發(fā)癥的主要危險(xiǎn)因素，其與動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度存在因果關(guān)聯(lián)，因此早期血糖控制可以降低心血管事件的發(fā)生。高血糖與血脂異常在AS形成中的作用密切相關(guān)，高血糖可加重血脂異常，也可對(duì)AS有獨(dú)立影響。許多研究表明，鏈脲霉素誘導(dǎo)的高血糖不伴脂質(zhì)或脂蛋白異常，其可以促進(jìn)ApoE-/-小鼠發(fā)生AS［24］。Veerman等［24］的研究表明糖尿病微血管病變可加快ApoE-/-糖尿病小鼠AS的發(fā)生和發(fā)展。

肝臟是哺乳動(dòng)物主要的糖異生器官，與其他器官一起參與維持體內(nèi)血糖水平的平衡［25］。生物鐘通過同步組織特異性的葡萄糖代謝機(jī)制維持血糖的生理水平［26］。Cry基因缺陷小鼠顯著降低糖異生基因的表達(dá)抑制，并使地塞米松誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平升高，這表明Cry基因?qū)μ瞧べ|(zhì)激素受體和糖異生基因轉(zhuǎn)錄有著顯著的抑制作用。此外，Cry1和/或Cry2基因缺失的小鼠出現(xiàn)了糖耐量下降、血液循環(huán)中皮質(zhì)醇濃度升高的表現(xiàn)，提示Cry可能通過降低對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺軸的抑制，增加糖皮質(zhì)激素在肝臟中的轉(zhuǎn)化激活［27］。Zhang等［27］的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，禁食期間肝臟Creb的活動(dòng)可由Cry1基因調(diào)節(jié)，它們?cè)诟闻K中有節(jié)律地表達(dá)。Cry1的表達(dá)在白-夜過渡期間升高，它能通過阻斷胰高血糖素介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的增加和PKA介導(dǎo)的環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse element-binding protein，Creb）磷酸化降低空腹糖異生基因的表達(dá)，如葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶-1（Pck1），最終降低血糖水平。研究顯示，與對(duì)照組相比，Cry基因敲除小鼠中糖異生基因的mRNA水平更高，而過表達(dá)Cry1下調(diào)了空腹注射胰高血糖素小鼠的糖異生基因表達(dá)，還降低了胰島素抵抗小鼠的血糖濃度并改善了胰島素敏感性［28］。另外，空腹或胰高血糖素誘導(dǎo)的cAMP濃度以24 h為周期波動(dòng)，其波谷水平與Cry蛋白表達(dá)的峰值水平一致。Cry蛋白可能通過與G蛋白Gsα亞基的相互作用調(diào)節(jié)肝臟糖異生的晝夜變化，導(dǎo)致胰高血糖素觸發(fā)Creb磷酸化［29-30］。FOXO1（forkhead box O1）是糖異生關(guān)鍵酶G6pc、Pck1的正向調(diào)節(jié)劑，而Cry蛋白可以促進(jìn)FOXO1的降解，從而抑制糖異生［31］。由此可以得知，肝臟中Cry1基因表達(dá)量的升高可以抑制cAMP的累積和Creb磷酸化的發(fā)生，進(jìn)而抑制肝臟細(xì)胞中葡萄糖的濃度，降低患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。

小結(jié)

越來越多的研究表明，晝夜節(jié)律紊亂已經(jīng)成為AS形成和發(fā)展的危險(xiǎn)因素，其中生物鐘基因Cry1是晝夜節(jié)律的一個(gè)重要組成部分，但是我們對(duì)Cry1作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然有限。通過對(duì)近幾年的研究分析我們發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因Cry1可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥、血壓、糖脂代謝以及內(nèi)皮細(xì)胞功能來影響AS的進(jìn)展。接下來我們需要進(jìn)一步探索生物鐘基因，特別是Cry1基因，是通過何種機(jī)制來影響AS的發(fā)生發(fā)展。相信隨著對(duì)生物鐘基因研究的進(jìn)一步深入，將會(huì)為我們尋找AS相關(guān)性疾病新的預(yù)防和治療靶點(diǎn)提供更充足的理論基礎(chǔ)。