李 洋，杜興乾，李志偉，馬志倩，焦 點，荊 揚，何 員，馮英桐，肖書奇

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學學院，陜西 楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種病毒性傳染病[1]。據(jù)報道，PRRS每年對美國造成的經(jīng)濟損失高達6.64億美元[2]。1996年，PRRSV首次在中國被分離[3]，此后，2006年出現(xiàn)的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。2013年前后，NADC30-like PRRSV開始在中國出現(xiàn)，并逐漸成為占有優(yōu)勢地位的流行毒株[6-9]。PRRSV是已知變異速度最快的RNA病毒之一，其核苷酸取代率約為每年4.7×10-2～ 9.8×10-2/堿基[10-12]。此外，PRRSV基因組間同源性較低，毒株多樣性豐富，易于發(fā)生突變和重組而持續(xù)性進化，現(xiàn)有的疫苗難以對豬群提供充足保護，特別是針對近些年流行的NADC30-like PRRSV[13-18]。

除疫苗免疫外，研究人員正逐步探索出一種新的較為有效的PRRSV防控方案，即血清馴化，其在美國部分養(yǎng)豬場已有多年的運用歷史[19-20]。血清馴化即通過野毒感染或人工弱毒感染健康豬的方式制備PRRSV陽性血清。再將采集的大量陽性血清按一定比例稀釋后接種至全群，以誘導其他豬產(chǎn)生有效PRRSV抗體，從而實現(xiàn)對PRRSV防控的目的[21-22]。隨著國內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)豬場的迅速發(fā)展，已有部分豬場嘗試借鑒美國血清馴化的經(jīng)驗進行PRRS防控。楊玉堅等[23]以100日齡的后備母豬為研究對象進行了血清馴化，結(jié)果表明后備母豬的健康指數(shù)雖受到了影響，但平均值仍高于100，且血清馴化并未明顯影響受馴化母豬的生產(chǎn)性能。曹玉美等[24]的研究結(jié)果表明受馴化母豬在血清馴化前、后的受胎率及分娩率均未發(fā)生明顯變化，不過堅持1年后受馴化母豬的配種分娩率及存活子豬數(shù)量均有了明顯升高，且豬群產(chǎn)生了較為穩(wěn)定的PRRSV抗體。伍少欽等[21]對廣西省某規(guī)?；B(yǎng)豬場的后備母豬進行封群管理并實施了血清馴化，最終成功在該場實現(xiàn)了PRRS凈化。張寧等[25]的研究比較了血清馴化方案和傳統(tǒng)疫苗免疫方案誘導母豬產(chǎn)生PRRSV抗體的能力，并評估了兩者對受馴化母豬生產(chǎn)性能的影響，發(fā)現(xiàn)2種方案產(chǎn)生的效果并沒有顯著差異，表明血清馴化似乎可以作為常規(guī)疫苗接種防控PRRSV的替代方案。孫龍等[26]同樣比較了豬場經(jīng)血清馴化或常規(guī)疫苗免疫后防控PRRSV的效果，結(jié)果表明，這2種方案對受馴化母豬的生產(chǎn)水平影響不大，但血清馴化方案可以節(jié)省疫苗注射成本。

2013年前后，NADC30-like PRRSV開始在中國大陸流行，時至今日已逐漸成為優(yōu)勢流行毒株[27-30]?；贜ADC30-like PRRSV毒株的血清馴化方案報道較少，探索NADC30-like PRRSV血清馴化方案具備實際意義[31-32]。

本研究對某曾暴發(fā)PRRS的養(yǎng)豬場進行種毒篩選分離PRRSV，以此為基礎(chǔ)制定合理的NADC30-like PRRSV血清馴化方案，并科學評估血清馴化誘導的PRRSV抗體水平及對該豬場后備母豬生產(chǎn)性能的影響，以期為規(guī)模化養(yǎng)豬場防控PRRSV，特別是NADC30-like PRRSV提供新的數(shù)據(jù)支持和經(jīng)驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞及試驗試劑研究主要在山東省某規(guī)?；i場和西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院完成。MARC-145細胞和PAM細胞由本實驗室保存；熒光抗體購自Abcam公司；制備大量馴化血清時所用的種公豬為該養(yǎng)豬場自國外引進，受馴化的后備母豬為該養(yǎng)豬場自留豬；PRRSV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、熒光定量PCR試劑等購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物交由陜西中科羽瞳生物科技有限公司合成；測序交由北京擎科生物科技有限公司西安分公司完成。

1.2 引物序列本研究所用的病原檢測引物如表1所示，分離毒株全基因組測定所需引物如表2所示。

表1 病原檢測引物序列

表2 分離毒株全基因組測定引物

1.3 相關(guān)參考毒株見表3。

表3 參考毒株信息

1.4 相關(guān)分子生物學分析涉及的軟件MegAlign、Editseq、SeqMan、SnapGene、BioEdit、SeqMan等用于分離毒株基因組測定及特性分析；GraphPad Prism 5.0用于數(shù)據(jù)處理，Photoshop、Adobe Illustrator CS6等用于圖片處理；P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

1.5 樣品的采集、處理與鑒定2016年初，山東省某規(guī)?；B(yǎng)豬場出現(xiàn)了疑似PRRS癥狀的大量癥候豬群，采集發(fā)病豬血清后提取核酸并利用表1引物進行PCR鑒定。

1.6 PRRSV流行毒株分離及基因組特性分析選擇PRRSV陽性血清進行病毒分離。將血清經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接入長至單層的MARC-145細胞和PAM細胞上，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察CPE，待有顯著CPE產(chǎn)生時，參照文獻[32]方法對其進行IFA鑒定。

用表2中的引物測定分離毒株的全基因組，以表3中相關(guān)毒株作為參考毒株，對該PRRSV毒株的Nsp2基因、ORF5基因和全基因組分別進行進化分析及核苷酸同源性分析，以探究其在PRRSV毒株中的分類情況。

1.7 大量血清制備及血清中抗原檢測血清馴化需制備大量目標PRRSV的陽性血清，用于制備大量血清的豬需無關(guān)抗原及PRRSV抗體水平呈陰性。注射上述NADC30-like PRRSV陽性血清至該養(yǎng)豬場自國外引進的健康種公豬體內(nèi)，注射前1周在種公豬的飲水中添加阿莫西林，觀察其臨床表現(xiàn)。待豬出現(xiàn)明顯臨床癥狀時采集前腔靜脈血分離血清200 mL/頭?；旌纤胁杉?，無菌分裝后凍存?zhèn)溆?，隨機選擇3份送至實驗室檢驗，核實其除PRRSV外其他無關(guān)抗原均保持陰性。

1.8 陽性血清稀釋比的確定馴化血清中的病毒滴度是血清馴化效果的重要影響因素。血清稀釋度過低會使待馴化母豬接受過量的PRRSV，增加了其發(fā)病的風險。血清稀釋度過高時，血清中有效病毒含量較低，難以誘導受馴化豬快速產(chǎn)生高水平PRRSV抗體。因此，需探究合適的馴化血清稀釋比例。在本研究中，將原始血清分別按1∶5 000，1∶1 250，1∶1 000，1∶500，1∶250，1∶200和1∶125的比例稀釋至生理鹽水中，提取RNA后用熒光定量PCR進行定量測定，以檢測稀釋血清樣品中的PRRSV含量，最終根據(jù)測定結(jié)果估計陽性血清的稀釋比。

為進一步驗證上述稀釋比(1∶250)可以滿足血清馴化的需求，本研究先在60頭健康豬體內(nèi)按上述比例接種稀釋血清，進行了持續(xù)3個月的血清馴化，并評估了按1∶250馴化后的PRRSV抗原和抗體水平。

1.9 對后備母豬實行血清馴化并評估其生產(chǎn)性能按上述稀釋比將稀釋血清肌肉注射至未免疫PRRSV疫苗的后備母豬體內(nèi)實施血清馴化，同時注射1頭份易速達。血清馴化前7 d在馴化母豬的飲水中添加阿莫西林，10 mg/kg。此后引進的健康豬在轉(zhuǎn)入基礎(chǔ)母豬群前均需先在隔離舍中完成血清馴化。

觀察所有受馴化母豬的臨床表現(xiàn)，定期采血測定其PRRSV抗體水平，記錄各項生產(chǎn)指標，包括平均每月母豬死亡數(shù)、窩均木乃伊胎比、平均每月母豬死亡數(shù)、窩均斷奶數(shù)、平均每月流產(chǎn)數(shù)、斷奶仔豬數(shù)、每頭母豬每年所能提供的斷奶仔豬頭數(shù)(PSY)等，以評估血清馴化誘導的PRRSV抗體水平，并探究其對規(guī)模化養(yǎng)豬場后備母豬生產(chǎn)性能的影響。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病豬血清病原檢測及毒株分離采集發(fā)病豬的血清樣品提取核酸并用表1中的引物對其進行病原檢測。PCR檢測結(jié)果表明樣品為PRRSV陽性，且測序結(jié)果顯示送檢樣品中Nsp2基因及ORF5基因序列均保持一致，即該場感染的PRRSV毒株為同一株P(guān)RRSV(結(jié)果未顯示)。

在MARC-145細胞和PAM細胞上對豬場PRRSV陽性血清中的病毒進行分離，結(jié)果如圖1所示，該PRRSV毒株(RD-YL)可在PAM細胞上產(chǎn)生明顯CPE(圖1A)，但在MARC-145細胞上盲傳3代仍無CPE產(chǎn)生。此外，IFA結(jié)果顯示，該毒株在PAM細胞上能與PRRSV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，但MARC-145細胞上未見熒光(圖1B)。結(jié)果表明該PRRSV分離毒株能感染PAM細胞，但對MARC-145細胞失去了感染性。

圖1 病毒分離的CPE(A)及IFA(B)鑒定

2.2 PRRSV分離毒株全基因組測定及進化分析如前所述測定PRRSV RD-YL毒株的全基因組序列，測序結(jié)果可知該PRRSV毒株的全基因組長度為15 044 bp。以表3毒株為參考，分別就Nsp2基因、ORF5基因和全基因組序列對該PRRSV分離株進行進化分析，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明，RD-YL PRRSV毒株基于Nsp2基因(圖2A)、ORF5基因(圖2B)和全基因組序列(圖2C)構(gòu)建的進化樹中，該毒株均與NADC30毒株處于同一進化分支上，與NADC30-like PRRSV集群的親緣關(guān)系較近。

2.3 PRRSV分離毒株核苷酸同源性分析進一步在核苷酸水平對該毒株進行了同源性分析，結(jié)果見圖3。

圖3 RD-YL毒株核苷酸水平同源性分析

PRRSV RD-YL分離毒株與CH1a、JXA1、NADC30、VR2332等毒株核苷酸相似性分別為84.7%，84.2%，94.2%和85.3%，與NADC30 PRRSV同源性最高，表明其屬于目前處于優(yōu)勢地位的NADC30-like PRRSV。

2.4 馴化血清的大量制備及抗原檢測選擇該養(yǎng)豬場引入的健康種公豬注射上述PRRSV陽性血清，大量采集血清后混勻，隨機選出3份進行病原檢測，結(jié)果見表4。檢測結(jié)果顯示制備的大量血清中PRRSV抗原均陽性，其余無關(guān)抗原均為陰性，符合預(yù)期。

表4 大量制備的PRRSV陽性血清抗原檢測

2.5 馴化血清稀釋比的確定將稀釋好的系列陽性血清提取RNA進行RT-qPCR，以確定合適的稀釋比例，所用的標準品為PRRSV-ORF7 基因所構(gòu)建的質(zhì)粒。最終，當稀釋比例為1∶125，1∶200和1∶250時，qPCR檢測起峰明顯，Ct值小于30；1∶500稀釋時，起峰晚，置信度低；當按1∶1 000，1∶1 250，1∶5 000稀釋時，未見起峰，無Ct值。結(jié)果表明，可嘗試按1∶250的稀釋比進行血清馴化。

為了進一步驗證上述摸索的稀釋比能否滿足需求，本研究按該稀釋比在60頭健康母豬上進行了小規(guī)模的血清馴化，為期3個月，結(jié)果如表5所示。

表5 血清馴化前、后PRRSV抗原及抗體檢測

結(jié)果顯示馴化前、后后備母豬均未檢出PRRSV抗原，符合預(yù)期；此外，馴化后1個月，出現(xiàn)PRRSV抗體血清轉(zhuǎn)化的母豬比例達50%，此后逐月升高；在血清馴化持續(xù)3個月時，馴化母豬PRRSV抗體陽性率達100% (過程中有2頭豬因無關(guān)原因死亡)。綜上，該稀釋比符合預(yù)期，可以按該比例進行后續(xù)血清馴化。

2.6 受馴化母豬PRRSV抗體水平及生產(chǎn)性能評估該養(yǎng)豬場在血清馴化前曾暴發(fā)過PRRS，為了進一步比較血清馴化對該豬場后備母豬生產(chǎn)性能的影響，將馴化前PRRSV發(fā)病期、馴化前時期、馴化后時期3個階段的各項生產(chǎn)指標放在一起進行了比較分析。

2.6.1受馴化母豬PRRSV抗體水平 2018年10月起，本研究對該養(yǎng)豬場的后備母豬進行了血清馴化，并連續(xù)6個月隨機采血測定了受馴化母豬的PRRSV抗體水平，結(jié)果見表6。

表6 血清馴化后母豬PRRSV抗體水平

結(jié)果顯示，接受血清馴化1個月后，有56.7%的母豬實現(xiàn)了PRRSV抗體的血清轉(zhuǎn)化，此后PRRSV抗體陽性率逐月升高，馴化后3個月時有94.2%的受馴化母豬體內(nèi)產(chǎn)生了PRRSV抗體；馴化后4個月時抽檢的受馴化母豬均產(chǎn)生了PRRSV抗體，抗體陽性率達100%。結(jié)果表明，在該規(guī)?；B(yǎng)豬場進行的NADC30-like PRRSV血清馴化成功誘導母豬群產(chǎn)生了較高水平的PRRSV抗體。

2.6.2后備豬群平均每月流產(chǎn)數(shù) 由圖4可知，馴化前PRRSV發(fā)病期流產(chǎn)數(shù)最高，馴化前和馴化后1年平均每月流產(chǎn)數(shù)均顯著低于馴化前PRRSV發(fā)病期(P<0.01)，馴化后1年平均每月流產(chǎn)數(shù)較馴化前平均每月流產(chǎn)數(shù)有所下降，降幅為3.1%，但并無顯著性差異(P>0.05)，表明血清馴化并未影響后備母豬平均每月流產(chǎn)數(shù)。

圖4 該后備豬群平均每月流產(chǎn)數(shù)

2.6.3平均每月母豬死亡數(shù) 由圖5可知，馴化前PRRSV發(fā)病期母豬死亡頭數(shù)顯著高于未發(fā)病期(P<0.01)，但血清馴化前和血清馴化后1年的平均每月母豬死亡頭數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明血清馴化并未明顯影響后備母豬的平均每月母豬死亡數(shù)。

圖5 該后備豬群平均每月死亡母豬數(shù)

2.6.4窩平均木乃伊胎比例 由圖6可知，馴化前PRRSV發(fā)病期的窩均木乃伊胎比例最高，顯著高于未感染PRRSV時期(P<0.01)。此外，馴化后1年窩均木乃伊胎比例顯著低于血清馴化前(P<0.05)，表明血清馴化能顯著降低后備母豬窩均木乃伊胎比例。

圖6 馴化前、后平均每窩產(chǎn)木乃伊胎比例

2.6.5窩均斷奶數(shù) 由圖7可知，馴化前PRRSV發(fā)病期窩均斷奶仔豬的數(shù)量最低，顯著低于未感染時(P<0.05)。血清馴化后1年與血清馴化前相比，窩均斷奶數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明血清馴化并未明顯影響后備豬的窩均斷奶數(shù)。

圖7 馴化前、后窩均斷奶數(shù)

2.6.6斷奶仔豬頭數(shù) 由圖8可知，馴化前PRRSV發(fā)病期斷奶仔豬數(shù)最低，但血清馴化前、馴化后的斷奶仔豬數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，表明血清馴化并未對該豬場的斷奶仔豬頭數(shù)造成顯著影響。

圖8 馴化前、后斷奶仔豬數(shù)

2.6.7PSY PSY是規(guī)?；i場最關(guān)鍵的生產(chǎn)指標。該規(guī)?；i場馴化前、后PSY的結(jié)果見圖9。

圖9 馴化前、后PSY值

由圖9可知，馴化前PRRSV發(fā)病期時該豬場的PSY值最低，為21.23，顯著低于馴化前及馴化后水平(P<0.05)。但血清馴化前、后該豬場PSY并無顯著性差異(P>0.05)，表明血清馴化并未對該場PSY造成明顯影響。

3 討論

PRRSV是一種高度變異的RNA病毒，常規(guī)疫苗接種已逐漸難以對其提供有效的交叉保護，特別是針對近些年加大流行的NADC30-like PRRSV。本研究對山東省某暴發(fā)PRRS的規(guī)?；B(yǎng)豬場進行了病原分離鑒定并分析了其基因組特性，證實其屬于NADC30-like PRRSV，與HP-PRRSV商品化疫苗和經(jīng)典PRRSV商品化疫苗的原型毒株的親緣關(guān)系均較遠。鑒于該分離毒株是目前田間優(yōu)勢流行毒株，且是在該養(yǎng)豬場分離，具有一定的代表性，故以該分離毒株的陽性血清為原型進行血清馴化。

血清馴化的優(yōu)點是具備程序性。一方面，豬群受馴化時間可以經(jīng)人為控制而盡可能保持一致性。另一方面，由于馴化PRRSV血清類型的純粹性，可以使豬群盡可能獲得一致性的抗體，且可能在一定程度上提升母豬的繁殖性能和生產(chǎn)性能[34]。此外，血清馴化方案實施時具有一定的復雜性。如難以確定馴化血清的稀釋比例。血毒載量過高時可能加劇PRRS的暴發(fā)，而亞病毒濃度的陽性血清又難以誘導機體在短時間內(nèi)迅速產(chǎn)生高效的抗體，甚至可能由于抗體依賴增強(ADE)效應(yīng)而引起嚴重的后果等[35]。最佳血清稀釋比的確定是一個關(guān)鍵問題。劉德清等[36]將原始血清按1∶120，1∶150，1∶200，1∶300，1∶600，1∶1 200，1∶3 000等比例進行了系列稀釋后進行了RT-PCR，發(fā)現(xiàn)當稀釋度大于1∶1 200時PCR無法擴增出陽性條帶，認為1∶1 200稀釋是該批次血清的檢測限，隨后，其提升10倍按1∶120對血清進行稀釋后進行了血清馴化。在本研究中，我們借助RT-qPCR的方法摸索了血清適宜的稀釋度，具體操作是將原始血清按不同比例進行稀釋，再經(jīng)RT-qPCR分析其擴增情況，選擇臨近無擴增曲線的稀釋度作為參考稀釋度。之后在60頭健康豬上按該比例進行血清馴化預(yù)試驗，以評估該稀釋比的安全性和有效性，結(jié)果表明該稀釋度能有效誘導受馴化母豬產(chǎn)生PRRSV抗體且未檢測到病毒，符合預(yù)期。值得注意的是，最佳血清稀釋比有其專門的定義，以能產(chǎn)生較高水平抗體且不排毒的稀釋度為最佳稀釋比，且只能通過動物試驗確定。本研究受條件所限，采用RT-qPCR來確定血清稀釋比的方法并不十分嚴謹和科學，且受血清抗體效價、定量檢測方法靈敏度、試驗儀器等客觀因素影響較大。在條件允許的情況下，仍建議對血清進行梯度稀釋后通過動物試驗來系統(tǒng)的確定最佳稀釋比。

有研究結(jié)果顯示血清馴化方案能使規(guī)?；i場產(chǎn)生有效的PRRSV抗體，且能顯著改善豬場內(nèi)PRRSV感染的持續(xù)周期[37]。本研究中，經(jīng)過血清馴化的豬群在1個月后即有56.7%的母豬產(chǎn)生了PRRSV抗體，4個月時PRRSV抗體已覆蓋抽檢的全部豬群，表明血清馴化確實在短時間內(nèi)誘導母豬產(chǎn)生了高效的PRRSV抗體。

伍少欽等[21]的研究結(jié)果顯示受馴化母豬群的分娩率和窩產(chǎn)活仔數(shù)均顯著提高。本研究中，血清馴化前和血清馴化后1年該豬場的平均每月流產(chǎn)數(shù)、平均每月母豬死亡數(shù)、窩均斷奶數(shù)、斷奶仔豬頭數(shù)和PSY等生產(chǎn)指標并無顯著性差異，但馴化后1年的窩均木乃伊胎比例較馴化前顯著降低，表明在該場進行的NADC30-like PRRSV血清馴化并未對受馴化母豬的生產(chǎn)性能造成不良影響，甚至降低了其窩均木乃伊胎比例。

劉德清等[36]的研究比較了疫苗免疫與血清馴化防控PRRS的效果，試驗結(jié)果顯示血清馴化與疫苗免疫均能提高豬群的PRRSV抗體水平，且在影響母豬生產(chǎn)性能方面有相似的效果。本研究中用到的陽性血清的原型毒株是NADC30-like PRRSV，目前尚無以該類毒株為原型毒株的疫苗面市，現(xiàn)有疫苗對其防護效果并不十分充足，且考慮到盡可能避免由人為引入多種PRRSV毒株而造成的重組毒株的出現(xiàn)，本研究在進行血清馴化時并未設(shè)置同型疫苗組對照。

綜上，本研究自山東省某規(guī)?；B(yǎng)豬場采集陽性血清并分離了PRRSV流行株RD-YL?；蚪M特性分析表明該毒株為NADC30-like PRRSV，屬于近年流行的優(yōu)勢毒株。用該毒株陽性血清注射健康豬制備大量血清，按1∶250稀釋后對后備母豬進行血清馴化。結(jié)果顯示馴化后豬群短時間內(nèi)產(chǎn)生了高水平的PRRSV抗體。此外，血清馴化并未對受馴化母豬的生產(chǎn)性能產(chǎn)生不良影響，甚至顯著降低了其木乃伊胎比例。這表明血清馴化是該規(guī)?；i場防控PRRS的有效方案。本研究為規(guī)模化豬場通過血清馴化防控PRRSV，特別是NADC30-like PRRSV提供了數(shù)據(jù)支持和經(jīng)驗參考。