牛成群,楊芷茜,林 潔,明振華

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室廣西甘蔗生物學(xué)重點實驗室,中國廣西 南寧 530004)

為抵御自然界病原微生物的侵染,植物在漫長進化過程中,形成了特有的兩道免疫防線[1]。第一道免疫防線是病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)觸發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity,PTI)[2],該免疫反應(yīng)一般是通過位于植物細(xì)胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別PAMPs,并將免疫信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)[3～5],最終引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量上升、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上離子通道的激活、胼胝質(zhì)的沉積、生長抑制和防御相關(guān)基因的表達等免疫相關(guān)反應(yīng)[6];第二道免疫防線是病原微生物逃逸PTI過程中產(chǎn)生的效應(yīng)因子所觸發(fā)的免疫反應(yīng)(effectortriggered immunity,ETI)。觸發(fā)該免疫反應(yīng)的是病原微生物向宿主植物細(xì)胞注入的毒力因子(virulence factors),也被稱為效應(yīng)因子(effector molecules),這類毒力因子通過對PTI途徑的關(guān)鍵信號組分進行修飾、降解、結(jié)合或者活性調(diào)控,抑制植物的PTI[7]。毒力因子對宿主細(xì)胞的破壞作用如果被定位在植物細(xì)胞內(nèi)的抗性蛋白(R蛋白)所感知,一般會引起劇烈的免疫防御反應(yīng)(通常伴隨超敏反應(yīng))[8～9]。

CERK1(chitin elicitor receptor kinase 1)是植物細(xì)胞膜上存在的一種類受體激酶(receptor-like kinase,RLK),因其可以感知真菌細(xì)胞壁含有的幾丁質(zhì)并磷酸化下游蛋白質(zhì)引發(fā)免疫反應(yīng)而被發(fā)現(xiàn)并命名,在植物感知并抵御真菌侵染方面有重要作用[10～13]。同時,CERK1在介導(dǎo)植物與共生真菌互作過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。CERK1在擬南芥、水稻、人、小鼠等物種內(nèi)廣泛存在,并具有較高的同源性[15]。CERK1識別的PAMPs或共生因子包括真菌幾丁質(zhì)、細(xì)菌肽聚糖、真菌線性β-1,3-葡聚糖和菌根真菌的共生因子等微生物來源的N-乙酰葡萄糖胺多聚物[16～17]。根據(jù)蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜的相對位置,CERK1可分為3個組成部分:細(xì)胞外負(fù)責(zé)感知PAMPs的LysM結(jié)構(gòu)域[18]、跨膜疏水性結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)磷酸化下游蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)(kinase domin,KD)結(jié)構(gòu)域[19]。在擬南芥中,AtCERK1胞外結(jié)構(gòu)域一般通過組成同源二聚體[20],或和LYK5胞外區(qū)組成異源二聚體來感知PAMPs[21]。AtCERK1胞外LysM結(jié)構(gòu)域感知真菌幾丁質(zhì)這一PAMP后[22],引發(fā)胞內(nèi)KD區(qū)的自磷酸化及其對PBL27蛋白的轉(zhuǎn)磷酸化,隨后PBL27磷酸化MAPKKK5(MAPK kinase kinase 5),引起級聯(lián)免疫反應(yīng)[23]。鑒于AtCERK1在識別和感知真菌幾丁質(zhì)、將免疫信號傳遞至胞內(nèi)并觸發(fā)PTI免疫反應(yīng)中的重要性,一些病原菌通過分泌毒力因子攻擊AtCERK1途徑以實現(xiàn)免疫逃逸。例如,細(xì)菌Ⅲ型效應(yīng)蛋白AvrPtoB可以特異識別并泛素化AtCERK1的KD區(qū),進而靶向降解AtCERK1,使植物喪失由AtCERK1誘導(dǎo)引起PTI的能力[24]。目前,CERK1胞外感知幾丁質(zhì)的機制已經(jīng)比較清楚,但其如何發(fā)揮下游信號傳遞的功能及如何被AvrP-toB特異性修飾有待進一步探索,故CERK1胞內(nèi)KD區(qū)的結(jié)構(gòu)解析顯得尤為關(guān)鍵。

本課題旨在利用晶體學(xué)手段對AtCERK1胞內(nèi)KD區(qū)進行晶體篩選以獲得高分辨率的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。實驗成功構(gòu)建了AtCERK1的體外原核表達系統(tǒng),并經(jīng)純化獲得純度為95%以上的野生型及突變型蛋白質(zhì)樣品,成功篩選到可以結(jié)晶的條件,經(jīng)X射線檢測收集,獲得分辨率為3.2 ?的AtCERK1和ADP復(fù)合物的衍射數(shù)據(jù),為該蛋白質(zhì)進一步的結(jié)構(gòu)與功能研究進行了實驗探索。

1 材料與方法

1.1 材料

AtCERK1胞內(nèi)區(qū)原核表達載體pRSFDuet1-CERK1為實驗室構(gòu)建;大腸桿菌BL21感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;LB培養(yǎng)基、卡那霉素(kanamycin,Kana)、誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)購于北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白質(zhì)純化相關(guān)試劑:鎳柱(Ni NTA beads)、陰離子交換柱(Capto Q)和Superdex75分子篩,購于GE Healthcare公司(美國);蛋白質(zhì)結(jié)晶相關(guān)試劑:結(jié)晶試劑盒(包括 Index、Crystal screen1&2、Sa-ltRx1&2、Natrix1&2、PEGRx1&2 和 PEGion1&2)購于Hampton Research公司(美國),防凍液相關(guān)試劑乙二醇(ethylene glycol,EG)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和NaCOOH購于Sigma公司(美國)。

1.2 溶液的配制

AtCERK1純化緩沖液:稱取2.423 g三羥甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane,Tris)、0.681 g咪唑和8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?Buffer 1);稱取8.000 g NaCl、0.200 g KCl、1.440 g Na2HPO4、0.240 g KH2PO4和0.681 g咪唑,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L(Buffer 2,即PBS緩沖液);稱取2.423 g Tris、20.424 g咪唑和8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?Buffer 3,即洗脫緩沖液)。

AtCERK1離子交換緩沖液:稱取2.423 g Tris于Ⅰ級水中,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?Buffer A);稱取2.423 g Tris、58.440 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?Buffer B)。

AtCERK1凝膠過濾緩沖液:稱取2.423 g Tris、0.406 g MgSO4·12H2O 和 8.766 g NaCl于Ⅰ級水中,用HCl調(diào)節(jié)pH到8.0,隨后用Ⅰ級水定容至1 L,過濾除菌后4℃儲存?zhèn)溆?Buffer C)。

1.3 生物信息學(xué)分析

擬南芥CERK1(AtCERK1)蛋白的CDS序列(NP_566689.2)從NCBI上查找并下載得到。使用TMHMM Server v2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0;2020-09-11)在線網(wǎng)站對蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測以確定蛋白質(zhì)邊界。使用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index;2020-09-11)在線網(wǎng)站對AtCERK1的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。利用ExPASy網(wǎng)站的在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/;2020-09-18)預(yù)測AtCERK1的等電點(isoelectric point,PI)、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)。利用HHpred(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred;2020-11-20)在線網(wǎng)站搜索PDB數(shù)據(jù)庫里已經(jīng)解析出的同源性高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)用于分子置換結(jié)構(gòu)解析。

1.4 AtCERK1的野生型及突變型構(gòu)建

經(jīng)由PCR獲得AtCERK1(301～599)的目的基因(引物序列見表1),PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,隨后經(jīng)膠回收分離純化出所需目的基因片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分別對目的基因和pRSFDuet1載體進行雙酶切,酶切產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,分別分離純化出酶切后具有相同黏性末端的AtCERK1(301～599)和pRSFDuet1片段。用T4 DNA連接酶于16℃進行連接,2 h后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,冰上靜置30 min,經(jīng)42℃熱激90 s后再次靜置于冰上5 min,37℃、210 r/min培養(yǎng)1 h后涂于含Kana抗性的LB固體平板上,倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱,等待14～16 h。挑取單克隆于含Kana的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)6～8 h,用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶進行雙酶切驗證,取陽性樣本送到廣州睿博生物科技有限公司進行測序。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建所需的引物Table 1 Primers used for construction of plasmids

基于重疊延伸PCR技術(shù)進行點突變擴增,獲得未甲基化的突變重組質(zhì)粒AtCERK1F460V和At-CERK1K349R。用DpnⅠ酶(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)消化后,轉(zhuǎn)入DMT感受態(tài)(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)中,14 h后在LB固體培養(yǎng)板上挑取單克隆,接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒后送往廣州睿博生物科技有限公司進行測序。

1.5 SDS-PAGE檢測

配置SDS-PAGE膠,將所制備樣品加入上樣孔里,120 V恒壓電泳1 h,考馬斯亮藍染色15 min,脫色過夜后進行拍照分析。

1.6 野生型AtCERK1蛋白的表達及親和層析純化

pRSFDuet1-CERK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)后,挑取菌落接種至含Kana(50 μg/mL)的10 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h(37 ℃、210 r/min),接入1 L含有Kana的LB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600到0.8(37℃、210 r/min)。加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.5 mmol/L),16℃誘導(dǎo)20 h后,蛋白質(zhì)表達完成。4 000 r/min離心15 min收集菌體,用 Buffer 1(20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑,pH 8.0)重懸,高壓破碎后離心1 h(4℃、12 000 r/min);取上清與鎳柱結(jié)合進行親和層析,Buffer 1沖洗30 mL后,取柱上樣品R,采用咪唑?qū)兓牡鞍踪|(zhì)進行梯度洗脫(10～70 mmol/L咪唑),并收集梯度洗脫樣品E10～E70,再由含300 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(Buffer 3)進行洗脫,同時收集洗脫樣品E300。所有樣品采用SDSPAGE進行分析。

緩沖液純化效果比較:蛋白質(zhì)表達完成后,用Buffer 1和Buffer 2(PBS緩沖液,10 mmol/L咪唑,pH 8.0)分別重懸菌體,高壓破碎后離心1 h(4℃、12 000 r/min)。取上清與鎳柱結(jié)合進行親和層析,收集柱上樣品R,用提高了咪唑濃度(20 mmol/L)的Buffer 1及Buffer 2對鎳柱進行洗雜,收集洗下的樣品E20。采用SDS-PAGE對收集的樣品進行分析。

1.7 AtCERK1的深度純化

離子交換層析:將用20 mmol/L咪唑洗雜、300 mmol/L咪唑洗脫的初步純化的AtCERK1蛋白濃縮到2 mL,置于冰上備用。陰離子交換柱(Capto Q)用 Buffer A(20 mmol/L Tris,pH 8.0)、Buffer B(20 mmol/L Tris、1 mol/L NaCl,pH 8.0)平衡,平衡程序為7.5%Buffer B,即用75 mmol/L NaCl平衡。將2 mL濃縮蛋白質(zhì)和2 mL Buffer A混合進行降鹽處理,4℃、12 000 r/min離心10 min,去沉淀后通過5 mL Loop環(huán)上樣,同時收集樣品,等UV(ultraviolet)峰走平后,逐漸升高鹽濃度(20 min內(nèi)從75 mmol/L升高到600 mmol/L),停止收集。取收集的樣品進行SDS-PAGE分析。

凝膠過濾層析:將離子交換層析純化到的蛋白質(zhì)樣品濃縮到1 mL以下,置于冰上備用。分子篩柱(Superdex75)用 Buffer C(20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl,pH 8.0)平衡。將1 mL濃縮蛋白質(zhì)樣品在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min,去沉淀后通過1 mL Loop環(huán)上樣,并收集樣品,待UV峰平穩(wěn)后,停止收集。取收集的樣品進行SDSPAGE分析。將分離純化的蛋白質(zhì)進行濃縮,利用Nanodrop One紫外分光光度計進行蛋白質(zhì)濃度測定。

1.8 突變型AtCERK1蛋白的純化

AtCERK1突變型的純化方案參考野生型,用20 mmol/L咪唑競爭性洗雜純化后,采用含300 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液進行充分洗脫,隨后將洗脫蛋白質(zhì)用Superdex75分子篩純化柱進行凝膠過濾分選。SDS-PAGE分析后進行蛋白質(zhì)濃縮。

1.9 AtCERK1野生型及突變型的結(jié)晶條件篩選

經(jīng)純化得到的野生型及突變型蛋白質(zhì)均濃縮到10 mg/mL,分別與終濃度為5 mmol/L的ADP或ATP冰上孵育1 h。對每種蛋白質(zhì)的3種不同狀態(tài):單獨蛋白質(zhì)、與ADP的復(fù)合物、與ATP的復(fù)合物,進行蛋白質(zhì)晶體初步篩選。晶體初篩采用氣象懸滴擴散法進行,采用Hampton Research公司的6×96種晶體學(xué)條件:Crystal screen1&2、Index、PEGRx1&2、PEGion1&2、SaltRx1&2、Natrix-1&2,在硅化玻片上加入1 μL蛋白質(zhì)溶液和1 μL池液(即試劑盒溶液),并將其混合,瓊脂密封好后將晶體板放置于16℃,每隔24 h在光學(xué)顯微鏡下觀察晶體生長情況。

1.10 晶體優(yōu)化

有晶體初步析出后,對析出晶體的條件進一步優(yōu)化,優(yōu)化方案包括:1)4∶1優(yōu)化。即把初篩條件中的池液改為4/5的量,加入1/5份其他條件的池液,以研究不同溶質(zhì)組分對晶體生長的影響;2)梯度對拉優(yōu)化。即把初篩得到的池液條件中所含的某一溶質(zhì)成分按照線性梯度進行溶液的配置;3)添加劑及去垢劑優(yōu)化。將1 μL蛋白質(zhì)溶液加入1 μL池液,再加入0.2 μL添加劑或去垢劑。優(yōu)化后每隔24 h觀察晶體。

1.11 晶體衍射分析

將晶體在顯微鏡下用合適直徑的帶底座晶體環(huán)撈取后,放置于提前準(zhǔn)備好的防凍液(由原池液基礎(chǔ)上添加20%的甘油配置)中,脫水后迅速放入液氮中凍存。在上海同步輻射光源中心(Shanghai Synchrotron Radiation Facility,SSRF)大分子線站BL17U1進行晶體衍射。收集數(shù)據(jù)后用XDS處理并用軟件CCP4以及Phenix進行分子置換以及結(jié)構(gòu)解析。

2 結(jié)果

2.1 AtCERK1的生物信息學(xué)分析

在NCBI上查找到AtCERK1的CDS序列,在TMHMM Server v2.0在線網(wǎng)站上對序列進行跨膜區(qū)域分析,從圖1的分析結(jié)果可知胞內(nèi)區(qū)邊界為255～617。結(jié)合Phyre2的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖2),刪除一些可能影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的柔性結(jié)構(gòu)域,確定克隆邊界為301～599。在ExPASy上預(yù)測蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì),得到AtCERK1的基本信息:AtCERK1由299個氨基酸組成,預(yù)測相對分子質(zhì)量為33 kD,pI為6.22,消光系數(shù)Abs(0.1%=1 g/L)為 0.802。

圖1 AtCERK1全長的跨膜區(qū)域預(yù)測結(jié)果Fig.1 Transmembrane domain prediction of AtCERK1

圖2 AtCERK1胞內(nèi)區(qū)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.2 Secondary structure prediction of AtCERK1 intracellular region

2.2 野生型AtCERK1蛋白的表達純化

pRSFDuet1載體的融合表達蛋白在其N端帶有6個His標(biāo)簽,故使用鎳柱親和層析進行第1輪蛋白質(zhì)純化。分別選用Tris-NaCl緩沖液(Buffer 1)以及PBS緩沖液(Buffer 2)對誘導(dǎo)表達的菌體進行重懸,隨后進行高壓破碎、鎳柱親和層析純化。取勻漿液中的上清樣品(S)、沉淀樣品(P),以及用含20 mmol/L咪唑的不同緩沖液洗下的樣品(E20)和洗雜后與鎳介質(zhì)結(jié)合的樣品(R),進行SDSPAGE分析。從圖3的電泳結(jié)果可知:在PBS緩沖體系(Buffer 2)下純化出的AtCERK1與鎳柱結(jié)合得更牢,不會輕易被低濃度咪唑洗脫,但最后留在鎳柱上的雜蛋白很多;而Tris-NaCl緩沖體系(Buffer 1)下純化出的AtCERK1蛋白只有兩條主要的雜蛋白需要去除,且與PBS緩沖體系(Buffer 2)相比,最后留在鎳柱的AtCERK1蛋白含量相差不大。綜合分析后選用Tris-NaCl緩沖液(Buffer 1)進行后續(xù)的純化實驗。

圖3 不同緩沖體系對AtCERK1初步純化的影響M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);P:沉淀樣品;S:上清樣品;R:介質(zhì)樣品;Ex:咪唑洗脫樣品(x為咪唑濃度)。Fig.3 Effects of different buffers on purification of AtCERK1M:Protein marker;P:Precipitation sample;S:Supernatant sample;R:Medium sample;Ex:Imidazole elution sample(x represents the concentration of imidazole).

確定蛋白質(zhì)純化的緩沖體系之后,為進一步探索洗脫蛋白質(zhì)的咪唑濃度,用不含咪唑的Tris-NaCl緩沖液對誘導(dǎo)表達的菌體進行重懸,并進行高壓破碎和離心,上清與鎳介質(zhì)結(jié)合后取樣品(R),同時,依次用含10～70 mmol/L咪唑的Tris-NaCl溶液洗滌鎳柱并收集洗脫樣品(E10～E70)。對上述樣品進行SDS-PAGE分析,從圖4的電泳結(jié)果可知:用20 mmol/L咪唑可競爭性洗脫大量雜蛋白。故后期的初步純化方案為含20 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液洗雜,含300 mmol/L咪唑的Tris-NaCl緩沖液洗脫,這樣即得到初步純化的AtCERK1。

圖4 不同咪唑濃度對AtCERK1的純化效果M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);R:介質(zhì)樣品;Ex:咪唑洗脫樣品(x為咪唑濃度)。Fig.4 Effects of different imidazole concentrations on purification of AtCERK1M:Protein marker;R:Medium sample;Ex:Imidazole elution sample(x represents the concentration of imidazole).

使用離子交換和凝膠過濾層析方法對初步純化的蛋白質(zhì)進行進一步純化。利用陰離子交換柱(Capto Q)進行離子交換層析,純化結(jié)果如圖5所示:隨著鹽濃度的升高(紅色曲線為電導(dǎo)值,可表示鹽濃度),AtCERK1蛋白先被洗脫下來,隨后25 kD左右的一條雜蛋白才被洗脫下來,故離子交換層析處理可去除25 kD的一條主要的雜蛋白。取離子交換層析洗脫的目的蛋白液,濃縮后用Superdex75分子篩進行凝膠過濾層析,分離純化結(jié)果如圖6所示:絕大多數(shù)的雜蛋白會先從分子篩上洗脫下來,而目的蛋白AtCERK1主帶在11.5 mL處才開始被洗脫下來,對稱的峰形說明蛋白質(zhì)比較均一。收集并濃縮AtCERK1的蛋白質(zhì)溶液,得到高濃度、高純度的目的蛋白,以用于后續(xù)結(jié)晶實驗。

圖5 AtCERK1的離子交換層析(A)離子交換色譜圖;(B)對應(yīng)的蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。Fig.5 Ion exchange chromatography of AtCERK1(A)The ion exchange chromatogram;(B)The protein gel electrophoresis diagram.

圖6 AtCERK1的凝膠過濾層析(A)凝膠過濾色譜圖;(B)對應(yīng)的蛋白質(zhì)凝膠電泳圖。Fig.6 Size exclusion chromatography of AtCERK1(A)The size exclusion chromatogram;(B)The protein gel electrophoresis diagram.

2.3 AtCERK1突變型的表達純化

用親和層析、凝膠過濾層析手段純化出針對植物免疫激酶的ATP結(jié)合位點設(shè)計的兩個突變型AtCERK1K349R和AtCERK1F460V。純化結(jié)果如圖7所示,突變型AtCERK1K349R和AtCERK1F460V的純度已達到結(jié)晶要求,故將其濃縮到10 mg/mL待用。

圖7 AtCERK1K349R(A)和AtCERK1F460V(B)的純化結(jié)果Fig.7 Purification of AtCERK1K349R(A)and AtCERK1F460V(B)

2.4 AtCERK1野生型和突變型的晶體篩選

除了單獨的野生型或突變型蛋白質(zhì),At-CERK1、AtCERK1F460V和 AtCERK1K349R還分別與終濃度為5 mmol/L的ATP或ADP冰上孵育1 h,以制備復(fù)合體樣品。將一共9種樣品進行蛋白質(zhì)晶體初步篩選,在16℃恒溫培養(yǎng)3 d后,于顯微鏡下觀察到突變型AtCERK1F460V與ADP的復(fù)合物在PEGion1試劑盒的3號條件(0.2 mol/L氟化銨、20%PEG3350)出現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)晶,晶體呈金剛石狀(圖 8)。

圖8 AtCERK1F460V與ADP復(fù)合物的晶體Fig.8 Crystals of the AtCERK1F460V-ADP complex

2.5 AtCERK1F460V復(fù)合物晶體的衍射分析

晶體X射線衍射獲得的最高衍射分辨率為3.2 ?(圖9),具體數(shù)據(jù)資料見表2。利用HHpred搜索PDB數(shù)據(jù)庫里同源性最高的結(jié)構(gòu)模型作為分子置換模版,可以得到正確的解。但由于晶體衍射分辨率不高,電子密度不理想,未來還需要對晶體篩選條件進行進一步優(yōu)化。

表2 AtCERK1F460V與ADP復(fù)合物的X射線衍射數(shù)據(jù)Table 2 X-ray diffraction data of AtCERK1F460V-ADP complex

圖9 AtCERK1F460V與ADP復(fù)合物的X射線衍射圖譜Fig.9 X-ray diffraction pattern of the AtCERK1F460VADP complex

3 討論

植物的固有免疫分為PTI和ETI兩種類型,對植物生長發(fā)育和抗性至關(guān)重要。CERK1作為能夠特異性識別幾丁質(zhì)類多糖分子并向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號觸發(fā)PTI免疫反應(yīng)的模式識別受體,對植物抵御致病真菌和細(xì)菌感染至關(guān)重要。在擬南芥中,AtCERK1通過胞外LysM區(qū)識別幾丁質(zhì)來感知真菌的侵染,然后由胞內(nèi)激酶區(qū)通過磷酸化下游蛋白質(zhì)PBL27傳遞信號,再由PBL27磷酸化MAPKKK5引起級聯(lián)免疫反應(yīng)[25]。區(qū)段交換與嵌合體設(shè)計實驗表明,胞外區(qū)感知信號和胞內(nèi)區(qū)傳遞信號是兩個相對獨立的過程[26],但目前AtCERK1胞內(nèi)信號傳遞結(jié)構(gòu)域的作用機理尚不清楚,因此,解析AtCERK的胞內(nèi)激酶區(qū)結(jié)構(gòu),深入分析其信號激活與信號傳遞的分子機理,十分必要。

為了解析AtCERK1胞內(nèi)激酶區(qū)的三維結(jié)構(gòu),首先需要對該蛋白質(zhì)片段進行晶體學(xué)研究。本實驗針對AtCERK1蛋白的KD區(qū)基因片段序列,構(gòu)建了E.coli-pRSF表達系統(tǒng)和兩種關(guān)鍵突變型,最終獲得3種純度在95%以上的蛋白質(zhì)樣品,并通過與ATP底物或ADP產(chǎn)物組裝復(fù)合體,最終使用氣象懸滴擴散法成功獲得可以產(chǎn)生X射線衍射的蛋白質(zhì)晶體。在本研究中,野生型AtCERK1析出的晶體經(jīng)X射線衍射分辨率很低,在8～10 ?之間。我們猜想可能是受野生型AtCERK1酶活力的影響,其每個分子空間結(jié)構(gòu)間不能很有規(guī)律的排布。之后的實驗中我們根據(jù)激酶經(jīng)典的ATP結(jié)合位點(K)及關(guān)鍵催化位點(F)[27]進行突變,最終成功提高了蛋白質(zhì)晶體的分辨率。蛋白質(zhì)晶體學(xué)研究的難點是獲得高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。激酶發(fā)揮功能的過程中酶先與ATP結(jié)合,將ATP中γ位的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物的羥基,最后釋放ADP。反應(yīng)涉及酶與ATP結(jié)合以及酶與ADP結(jié)合的兩種過渡態(tài),不同狀態(tài)下樣品的結(jié)晶能力有所差別[28]。為了提高AtCERK1胞內(nèi)激酶區(qū)結(jié)晶成功率,我們將野生型和突變型蛋白質(zhì)與ATP或ADP組裝復(fù)合體,最終成功實現(xiàn)了復(fù)合體結(jié)晶。復(fù)合體結(jié)晶比單獨蛋白質(zhì)的結(jié)晶更有意義,解析蛋白質(zhì)與小分子相互作用的細(xì)節(jié)有助于之后的研究深入理解其工作機理[29]。

在0.2 mol/L氟化銨、20%PEG3350條件下,突變型AtCERK1F460V和ADP的復(fù)合物成功析出晶體,經(jīng)X射線衍射得到的最高分辨率為3.2 ?。衍射圖像分析顯示,晶體屬于P62空間群;晶胞參數(shù)是:a=119.47 ?,b=119.47 ?,c=69.30 ?,α=90.0°,β=90.0°,γ=120.0°。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目,計算得到該晶體最有可能的馬修斯系數(shù)為2.12,暗示一個不對稱單位中可能有兩個復(fù)合體分子。初步的結(jié)構(gòu)解析顯示,蛋白質(zhì)電子密度不太理想,對比以往的研究分析[30],原因可能有:1)晶體是由大量微觀物質(zhì)單元按一定規(guī)律有序排列的結(jié)構(gòu),衍射時,X衍射也是通過晶體內(nèi)部原子有規(guī)律的排列才出現(xiàn)衍射點,而本研究中所獲得的蛋白質(zhì)晶體析出的速度比較快,晶體內(nèi)部原子堆積排列可能不規(guī)律;2)晶體結(jié)晶的條件仍需要進一步優(yōu)化,例如:改變鹽離子、緩沖液成分、沉淀劑以及pH值,或者添加一些其他可能促進晶體質(zhì)量的元素,或者用添加劑、去垢劑試劑盒進行優(yōu)化等;3)防凍液沒有配置適宜,晶體質(zhì)量在液氮環(huán)境中發(fā)生了退化。雖然劉婷婷等[31]解析出了CERK1胞外區(qū)的三維結(jié)構(gòu),但CERK1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)一直沒有得到解析研究。因此,實驗最終成功拿到中等衍射分辨率的蛋白質(zhì)晶體,是向解析CERK1激酶區(qū)的空間結(jié)構(gòu)邁出的關(guān)鍵一步,為后續(xù)AtCERK1結(jié)構(gòu)解析提供了重要信息和寶貴經(jīng)驗。在后續(xù)的實驗中,課題組將繼續(xù)優(yōu)化AtCERK1激酶區(qū)的蛋白質(zhì)晶體,并在解析出結(jié)構(gòu)后對其關(guān)鍵氨基酸殘基定向改造,以獲得酶活力更高、熱穩(wěn)定性更強的重組酶分子,從而強化植物免疫,提高植物存活率及生長質(zhì)量。