林宇青，梁依然，陳 琦，姜 君，安仁波

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002;2.長春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,長春 130000；3.延邊大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 延吉 133002 )

神曲又名六曲，六神曲。目前神曲對(duì)藥物的加工方式多為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，因神曲中含有酵母菌、根霉菌等真菌，可在一定的溫度和濕度下通過其自身的催化分解作用，使藥物發(fā)泡、生衣，更易于人體吸收[1-2]。

榛子(Corylusheterophylla)為樺木科的果實(shí)，主要生長于北半球的溫帶地區(qū)，其雄花穗在中國長白山地區(qū)常被用于預(yù)防和治療肝臟疾病[3]。榛子樹在越冬期間，其雄花都會(huì)有不同程度的脫落或損害，而這些在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上往往被忽略。作為世界4大堅(jiān)果食品的榛子，其藥理活性已被大量研究證實(shí)[4-5]，然而其雄花卻并未受到廣泛關(guān)注。因此，該試驗(yàn)利用榛子雄花生神曲和炒神曲發(fā)酵物研究了3種提取物的抗氧化、抗炎、抗糖尿病及抑制黑色素形成的影響，并與水提取物(對(duì)照)進(jìn)行了比較，為后續(xù)榛子雄花產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榛子雄花于2016年4月采集于吉林省延吉市，由延邊大學(xué)藥學(xué)院安仁波教授鑒定。生神曲、炒神曲購置河北金草藥業(yè)有限公司；DMEM，胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；DPPH，購于索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購買于碧云天生物技術(shù)有限公司；α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，酪氨酸酶均購于上海源葉生物有限公司；(S)-2-氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸(左旋多巴)購于Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

稱取10 g榛子雄花放于預(yù)先裝入200 mL蒸餾水的三角瓶中后，分別加入10 g的生神曲與炒神曲，以不加神曲處理的蒸餾水組為對(duì)照。用棉花塞住瓶口，放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，搖勻后培養(yǎng)6 d，發(fā)酵后取發(fā)酵液，冷凍干燥后置于-20 ℃保存。

1.2.2 體外抗氧化試驗(yàn)

1) DPPH清除能力

參考夏秋霞等[6]的方法測(cè)定了DPPH自由基清除能力。將2種神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液分別配置成0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL后，與1 mL的60 μmol/L DPPH混合。維生素C(Vc)為陽性組，以不加榛子雄花發(fā)酵液為對(duì)照組?；旌弦河?7 ℃下避光溫育30 min，測(cè)定517 nm處的吸光值。

2) 鐵離子螯合能力

參考 Fu等[7]的方法，于96孔板中加入用不同神曲發(fā)酵的不同濃度的榛子雄花發(fā)酵液(0、5、10、15、20 mg/mL)后，加入蒸餾水137.5 μL和2.5 μL的2 mmoL的FeCl2，搖蕩后加入10 μL的5 mmoL菲洛嗪溶液。室溫下反應(yīng)10 min后于562 nm處測(cè)定吸光值。

鐵離子螯合能力=

1.2.3 體外細(xì)胞抗炎試驗(yàn)

1) 細(xì)胞培養(yǎng)

Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)液中后在相對(duì)濕度為95%，CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2) 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將Raw264.7細(xì)胞以1×104cells/孔培養(yǎng)于96孔板中，試驗(yàn)組加入不同濃度的榛子雄花發(fā)酵液，孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，加入MTT (500 μg/mL)，培養(yǎng)2 h后取出，加入DMSO后置于振蕩器以充分溶解甲瓚結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀在波長為550 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

3) NO測(cè)定

選取對(duì)數(shù)生長期Raw264.7細(xì)胞以2.5×105cells/孔培養(yǎng)于48孔板。正常組和LPS組分別加入培養(yǎng)液150 μL，處理組加入不同濃度的榛子雄花發(fā)酵液。1 h后，處理組與LPS組同時(shí)加入LPS(100 ng/mL)37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，每孔取50 μL上清液至96孔板中。使用NO標(biāo)準(zhǔn)品工作液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每孔按1∶1 加入Griess試劑50 μL，使用酶標(biāo)儀在波長為550 nm處測(cè)定OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO含量。

1.2.4 降血糖活性測(cè)定

1) α-葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定

取50 μL不同濃度榛子雄花發(fā)酵液(0、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mg/mL)于試管中，加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液(0.5 mol/mL)，混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)反應(yīng)10 min，加入100 μL對(duì)硝基苯酚葡萄糖苷(PNPG)溶液，用塑料膜密封并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，最后加入50 μL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，405 nm處測(cè)定吸光值[8]。計(jì)算公式如下。

式中，C1，樣品+α-葡萄糖苷酶+PNPG 的吸光值；C2，樣品+PNPG 的吸光值；C3，α-葡萄糖苷酶+PNPG 的吸光值；C4，PNPG 的吸光值。

2) α-淀粉酶抑制率測(cè)定

取50 μL α-淀粉酶溶液(2 mol/mL)于96孔板中，加入50 μL不同濃度榛子雄花發(fā)酵液(0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL)，混勻，置于37 ℃恒溫箱中10 min。加入50 μL 1%淀粉溶液，在37 ℃反應(yīng)10 min，加入100 μL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)，沸水浴中反應(yīng)5 min 后立即冰浴，冷卻后550 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算公式如下。

式中，C1，樣品+α-淀粉酶+1%淀粉的吸光值；C2，樣品+1%淀粉的吸光值；C3，α-淀粉酶+1%淀粉的吸光值；C4，1%淀粉的吸光值。

1.2.5 酪氨酸酶抑制率檢測(cè)

為了測(cè)定不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制影響。參考Chan等的方法[9]，在96孔板中依次加入榛子雄花發(fā)酵物、磷酸鹽緩沖液和1 mmol/L左旋多巴，在37 ℃水浴10 min，加入100 U/mL酪氨酸酶反應(yīng)5 min，在475 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算酪氨酸酶的抑制率。

式中，A，不含樣品但含酪氨酸酶的陰性組吸光值；B，不含樣品及酪氨酸酶的空白組吸光值；C，包含樣品及酪氨酸酶的樣品組吸光值；D，含樣品但不含酪氨酸酶的對(duì)照組吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，利用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)為平均數(shù)，采用t檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子雄花神曲發(fā)酵液的抗氧化活性

2.1.1 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花清除DPPH自由基的能力

不同神曲發(fā)酵的榛子雄花對(duì) DPPH 自由基的清除活性有所差異，隨著榛子雄花發(fā)酵物濃度的增加，對(duì)DPPH 自由基的清除能力不斷增強(qiáng)(圖1)。其中，對(duì)照組在1 mg/mL清除效果達(dá)到了81.33%，清除能力稍低于維生素C(Vc)，炒神曲組清除效果達(dá)到了68%。當(dāng)提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)于DPPH自由基的清除能力依次為：對(duì)照組>炒神曲組>生神曲組。

圖1 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)清除DPPH自由基能力的影響

2.1.2 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)鐵離子螯合能力試驗(yàn)

不同神曲發(fā)酵的榛子雄花隨著濃度的升高，鐵離子螯合能力也逐漸增強(qiáng)，呈正相關(guān)。炒神曲組在20 mg/mL時(shí)，螯合能力達(dá)到91%，稍高于檸檬酸(圖2)。當(dāng)榛子雄花發(fā)酵物濃度為20 mg/mL時(shí)，不同榛子雄花神曲發(fā)酵對(duì)于鐵離子的螯合能力依次為：炒神曲組>對(duì)照組>生神曲組。

圖2 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液 對(duì)鐵離子螯合能力的影響

2.2 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液抗炎活性比較

2.2.1 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液的毒性試驗(yàn)

分別用濃度為0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200和400 μg/mL的榛子雄花提取物處理細(xì)胞24 h。與空白組比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度低于100 μg/mL時(shí)，該樣品對(duì)于細(xì)胞無毒性影響，大于100 μg/mL對(duì)細(xì)胞有毒性(圖3A)。因此，榛子雄花組在后續(xù)試驗(yàn)中低、中、高組濃度依次選擇為25、50和100 μg/mL，以確保后續(xù)試驗(yàn)的正確性。

生神曲組篩選濃度為0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200和400 μg/mL，處理細(xì)胞24 h，與空白組比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度低于25 μg/mL時(shí)，對(duì)于細(xì)胞無毒性影響，而大于25 μg/mL對(duì)細(xì)胞有毒性(圖 3B)。因此，生神曲組在后續(xù)試驗(yàn)選擇低、中、高組濃度為6.25、12.5和25 μg/mL，以確保后續(xù)試驗(yàn)的正確性。

分別使用0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200和400 μg/mL的炒組樣品處理細(xì)胞24 h。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)樣品濃度低于25 μg/mL時(shí)，該樣品對(duì)于細(xì)胞無明顯毒性影響(圖3C)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)分別選擇6.25、12.5和25 μg/mL為該樣品的低、中、高劑量組濃度，以確保后續(xù)試驗(yàn)的正確性。

圖3 榛子雄花生水提取(A)、神曲(B)和炒神曲發(fā)酵物(C)對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.2.2 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)NO釋放量影響對(duì)比試驗(yàn)

由圖4可知，Raw264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS(200 ng/mL)刺激后，細(xì)胞上清中NO的含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組比較發(fā)現(xiàn)，不同神曲發(fā)酵的榛子雄花預(yù)處理后，細(xì)胞上清中NO含量上升的現(xiàn)象被有效抑制(P<0.05)，并且隨著榛子雄花發(fā)酵物濃度的增加呈正相關(guān)。其中，不同組別樣品對(duì)NO的抑制率依次為：對(duì)照組>炒神曲組>生神曲組。

圖4 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)NO釋放量的影響

2.3 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)降血糖活性測(cè)定

由圖5A可知，不同神曲發(fā)酵的榛子雄花的提取物濃度在0～2 mg/mL時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯抑制作用，且抑制率隨提取物濃度的升高呈快速上升趨勢(shì)，其中，抑制率強(qiáng)弱分別為炒神曲組>對(duì)照組>生神曲組。

由圖5B可知，不同神曲發(fā)酵的榛子雄花在0～2 mg/mL時(shí)，對(duì)α-淀粉酶均有抑制作用，且隨提取物濃度的升高呈快速上升的趨勢(shì)，其中，對(duì)α-淀粉酶的抑制能力炒神曲組>對(duì)照組>生神曲組。

圖5 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)酶的抑制作用的影響

2.4 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

由圖6可知，不同神曲發(fā)酵的榛子雄花提取物濃度處于0～1.25 mg/mL時(shí)，對(duì)酪氨酸酶有抑制作用，且抑制率隨著樣品濃度的升高呈快速上升的趨勢(shì)，其中，炒神曲組>對(duì)照組>生神曲組。

圖6 不同神曲發(fā)酵的榛子雄花發(fā)酵液對(duì)黑色素的抑制作用

3 討論與結(jié)論

神曲又被稱為中華第1曲，是用發(fā)酵法制成的代表性中藥炮制品，其原料復(fù)雜，主要含有酵母菌和根霉菌[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苷類和揮發(fā)油在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中不穩(wěn)定，會(huì)降解或揮發(fā)，因此發(fā)酵后產(chǎn)生的各種酶在一定程度上削減了神曲的藥理活性[10-11]。該研究探究了神曲經(jīng)不同處理后對(duì)榛子雄花藥效的影響，通過對(duì)榛子雄花提取物“抗氧化”“抗炎”“降血糖”“抑制黑色素生成”等活性的檢驗(yàn)，以確定榛子雄花的最佳處理方式。

體外抗氧化指標(biāo)主要可分為清除自由基的能力、鐵離子的還原力及金屬離子的螯合能力等[6]。DPPH是一種常見的自由基，利用其與樣品結(jié)合后在可見光區(qū)吸光值的變化可以有效地評(píng)價(jià)樣品的抗氧化性[12]；Fe2+可以催化活性氧自由基的形成從而對(duì)細(xì)胞和組織造成損傷，如果可以將這些Fe2+耦合為Fe3+，即可消除其催化作用，以證明其樣品的抗氧化活性[13]。在該研究中，炒神曲發(fā)酵的榛子雄花的提取物鐵離子螯合能力最佳，而DPPH自由基消除效果為對(duì)照組最優(yōu)。

炎癥發(fā)生時(shí)，細(xì)胞間質(zhì)中促炎介質(zhì)NO濃度升高，過量的NO有較強(qiáng)的毒性作用，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷[14-15]。對(duì)照組抑制NO的釋放量最高，達(dá)73.5%。在人體中，α-淀粉酶將碳水化合物水解成寡糖，寡糖在α-葡萄糖苷酶的作用下進(jìn)一步水解成葡萄糖；抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，能減緩葡萄糖生成，從而降低人體血糖水平[16-17]。炒神曲發(fā)酵的榛子雄花對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制作用。在生化酶學(xué)研究中，黑色素細(xì)胞中存在大量的黑色素體，酪氨酸酶主要存在于黑色素體中。當(dāng)人體中黑色素增長過多時(shí)會(huì)造成皮膚色素沉著，顏色暗沉，從而引起皮膚類疾病，顏色分布不均造成黃褐斑、老年斑、雀斑等，因此，抑制酪氨酸酶可以減少黑色素瘤的形成[18]。在生化酶學(xué)法研究黑色素的抑制研究中，炒神曲明顯優(yōu)于其他發(fā)酵方式。

總之，不同神曲發(fā)酵榛子雄花藥效不盡相同，但均能有效抗氧化，抑制炎癥，抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性及黑色素的生成。