王玉杰 冷春旭 孫中義 王 珣 趙 曦 李曉娟 趙 偉 吳立成

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，哈爾濱 150028；2 黑龍江省作物與家畜分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150028）

種子是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的“芯片”，是國(guó)家糧食安全和農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的“源頭”。2020年中央經(jīng)濟(jì)工作會(huì)議將解決好種子和耕地問(wèn)題作為年度經(jīng)濟(jì)工作重點(diǎn)任務(wù)，鑒定種子質(zhì)量是保障農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)的重要工作之一，而種子純度和真實(shí)性是種子質(zhì)量控制中最難解決的問(wèn)題。種子的純度和真實(shí)性鑒定本質(zhì)上就是品種基因型的鑒定，DNA 分子標(biāo)記技術(shù)通過(guò)比較不同個(gè)體基因組DNA 序列差異來(lái)鑒定品種。

DNA 分子標(biāo)記多態(tài)性的產(chǎn)生是由于DNA 分子出現(xiàn)插入、缺失、倒位、異位、重排和置換等排列造成的核苷酸差異。與傳統(tǒng)形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記相比，具有分布廣、多態(tài)性高、準(zhǔn)確性高、操作快速簡(jiǎn)便、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)。目前分子標(biāo)記技術(shù)已成為作物純度和真實(shí)性鑒定應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。

1 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展歷程

分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，為農(nóng)作物種子質(zhì)量分析提供了更為準(zhǔn)確、可靠、方便、快捷的方法。分子標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了從以Southern 雜交為基礎(chǔ)的第1 代限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP，Restriction fragment length polymorphism）標(biāo)記到以PCR 反應(yīng)為基礎(chǔ)的2 代隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD，Random amplified polymorphic DNA）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP，Amplified fragment length polymorphism）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR，Simple sequence repeat）和以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的第3 代單核苷酸標(biāo)記（SNP，Single nucleotide polymorphism）。

1.1 RFLP 技術(shù)RFLP 作為第1 代分子標(biāo)記于1980年被Bostein 等[1]發(fā)現(xiàn)，其原理是限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割基因組DNA，經(jīng)PAGE 電泳后，應(yīng)用特定探針進(jìn)行Southern 雜交，最后通過(guò)放射自顯影獲得RFLP 圖譜。RFLP 標(biāo)記具有穩(wěn)定性高和共線性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是隨著PCR 技術(shù)的誕生和發(fā)展，RFLP 逐漸被淘汰，目前已不再應(yīng)用該技術(shù)。

1.2 RAPD 技術(shù)RAPD 技術(shù)是以PCR 為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的第2 代分子標(biāo)記技術(shù)，于1990年被Welsh等[2]發(fā)現(xiàn)，其原理是利用單一隨機(jī)引物將基因組中存在的重復(fù)序列之間的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳及染色即可顯示多態(tài)性。與第1 代RFLP標(biāo)記相比具有通用性強(qiáng)、成本低和檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)，而RAPD的缺點(diǎn)是反應(yīng)條件敏感，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，無(wú)法用于基因分型。

1.3 AFLP 技術(shù)AFLP 標(biāo)記是在RFLP 和RAPD標(biāo)記技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，于1993年被Zabeau 等[3]發(fā)明，其原理是利用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA 后，酶切片段在T4 連接酶的作用下與特定的接頭連接，最后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳及染色顯示多態(tài)性。AFLP 標(biāo)記綜合了RFLP 和RAPD 兩種標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有樣品需求少、穩(wěn)定性高、可靠性好且多態(tài)性高等特點(diǎn)，缺點(diǎn)是試驗(yàn)費(fèi)用高、對(duì)DNA的質(zhì)量要求較高。

1.4 SSR 技術(shù)SSR 也稱為微衛(wèi)星序列，是以1～6 個(gè)堿基為基序，經(jīng)過(guò)串聯(lián)重組而組成的DNA 序列，廣泛存在于植物基因組[4]。其原理是利用SSR 兩側(cè)的保守序列為模板，設(shè)計(jì)特異引物，當(dāng)SSR 重復(fù)的次數(shù)不同或者不完全重復(fù)時(shí)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增及電泳分離，即可獲得該位點(diǎn)的多態(tài)性。SSR 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是多態(tài)性豐富，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，且為共顯性標(biāo)記，可用于基因分型，缺點(diǎn)是開發(fā)成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

1.5 SNP 技術(shù)SNP 是在SSR 標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展的第3代分子標(biāo)記，于1996年由Eric S.Lander等發(fā)明，SNP 是指不同生物個(gè)體DNA 序列中單堿基差異，包括單個(gè)堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換等類型[5]。其原理是利用特異性的引物對(duì)某一基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)SNP 位點(diǎn)信息，進(jìn)行基因分型。SNP 分子標(biāo)記技術(shù)具有遺傳穩(wěn)定性高、分布均勻、數(shù)量多、通量高、檢測(cè)快和可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽(yáng)性、成本高，且必須在全基因測(cè)序的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析。

2 分子標(biāo)記在農(nóng)作物種子檢測(cè)中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)直接以種子DNA 作為研究對(duì)象，彌補(bǔ)和克服了傳統(tǒng)農(nóng)作物種子鑒定方法的不足，具有不受環(huán)境條件影響、操作簡(jiǎn)便快捷、數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢測(cè)中越來(lái)越受到重視。RFLP 標(biāo)記因?yàn)镈NA 用量大，技術(shù)復(fù)雜且檢測(cè)過(guò)程中需要放射性同位素不便操作，所以不適合快速檢測(cè)種子純度和品種的真實(shí)性；RAPD 標(biāo)記由于引物篩選工作量大，多態(tài)性不足，對(duì)品種的鑒定難度大，導(dǎo)致該標(biāo)記很少應(yīng)用到大規(guī)模的種子鑒定中；AFLP 標(biāo)記兼具PCR的高效性與RFLP的可靠性，多態(tài)性強(qiáng)，可分析較大基因組作物，非常適合鑒定作物品種的真實(shí)性和純度，但是操作程序復(fù)雜，需要很高的實(shí)驗(yàn)技能和精密的儀器，因此很難在作物種子質(zhì)量鑒定中普及推廣；SSR 標(biāo)記既有RFLP的遺傳學(xué)優(yōu)點(diǎn)，又比RAPD的可信度高，還比AFLP標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，已成為可高效準(zhǔn)確檢測(cè)種子純度和真實(shí)性的熱點(diǎn)技術(shù)。2014年我國(guó)頒布了水稻、玉米、大豆3 個(gè)作物的品種鑒定技術(shù)規(guī)程-SSR 分子標(biāo)記法的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。SNP 標(biāo)記具有重復(fù)性好、覆蓋面廣、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適合親緣關(guān)系較近和遺傳背景復(fù)雜的品種鑒定，尤其適合大量樣本檢測(cè)，在種子質(zhì)量檢測(cè)中越來(lái)越受到重視，擁有廣闊的應(yīng)用前景。

2.1 分子標(biāo)記應(yīng)用于種子真實(shí)性檢測(cè)種子的真實(shí)性是指一批種子所屬品種、種或?qū)倥c該品種審定時(shí)所描述的內(nèi)容是否一致，是衡量種子質(zhì)量的指標(biāo)之一。品種真實(shí)性鑒定包括真實(shí)性驗(yàn)證和真實(shí)身份鑒定，真實(shí)性驗(yàn)證是把待測(cè)樣品與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較，檢驗(yàn)兩者是否相同；真實(shí)性身份鑒定是將待測(cè)樣品與DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定樣品的品種名稱。傳統(tǒng)鑒定種子真實(shí)性的方法主要是田間種植鑒定和蛋白質(zhì)電泳等，而分子標(biāo)記以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)，比傳統(tǒng)鑒定方法更加快速高效，已廣泛應(yīng)用于種子真實(shí)性檢測(cè)。

李雪等[6]利用40 對(duì)SSR 引物和3072 個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)11 套玉米雜交種和親本進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明SSR 和SNP 在種子真實(shí)性鑒定方面具有較好的一致性；陳廣鳳等[7]利用SNP 分子標(biāo)記對(duì)205 份小麥進(jìn)行基因分型，結(jié)果表明SNP 標(biāo)記在檢測(cè)種子真實(shí)性、位點(diǎn)穩(wěn)定性、品種區(qū)分能力以及遺傳關(guān)系分析等方面準(zhǔn)確可靠、快捷有效。進(jìn)行真實(shí)性身份鑒定須建立DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，2010年農(nóng)業(yè)部啟動(dòng)玉米、水稻、小麥、棉花、大豆等主要農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)樣品的征集工作，為標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫(kù)的構(gòu)建提供了可靠的樣品[4]。王鳳格等[8]利用40 對(duì)SSR 核心引物對(duì)3998 份玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建了DNA 指紋圖庫(kù)，建立了玉米品種標(biāo)準(zhǔn)指紋比對(duì)服務(wù)平臺(tái)。

2.2 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于種子純度檢測(cè)種子純度是衡量種子質(zhì)量的另一個(gè)重要指標(biāo)，也是影響作物品質(zhì)和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，玉米種子純度合格率每下降1%，產(chǎn)量下降3%[9]。種子純度鑒定包括田間鑒定法、生化標(biāo)記法以及DNA 分子標(biāo)記法，其中分子標(biāo)記法因其具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好和重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于作物自交系和雜交種純度鑒定。

Smith 等[10]利用RFLP 鑒定了78 個(gè)玉米雜交種的純度，Shimornura 等[11]研究發(fā)現(xiàn)2 對(duì)SSR 引物可區(qū)分10 個(gè)日本主栽草莓品種，Tommasini 等[12]利用3 組SSR 引物區(qū)分10 個(gè)油菜品種。吳明生等[13]發(fā)現(xiàn)1 個(gè)SNP 多態(tài)性位點(diǎn)可將2 個(gè)雜交玉米品種中混雜的親本區(qū)分出來(lái)，匡猛等[14]從63K的棉花全基因組芯片中應(yīng)用KASP 技術(shù)選出26 個(gè)雜合率高且分型效果理想的SNP 核心位點(diǎn)，進(jìn)行棉花雜交種純度檢測(cè)。研究表明，SNP 檢測(cè)種子純度靈敏度更高，能將親緣關(guān)系較近和遺傳關(guān)系復(fù)雜的品種明確區(qū)分出來(lái)，特別適用大量樣品檢測(cè)。

3 展望

分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有快速、準(zhǔn)確，不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于作物種子檢測(cè)，大大提高了鑒定的效率，有效保障了種子的真實(shí)性和純度，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)，促進(jìn)種業(yè)市場(chǎng)規(guī)范發(fā)展，推動(dòng)農(nóng)民增收貢獻(xiàn)了力量。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，更多高效的新型分子標(biāo)記將逐步被挖掘，種子檢測(cè)體系也將不斷地完善和成熟，為打擊非法套牌及制售假劣種子提供了科技支撐，保障了我國(guó)的糧食安全。