高曉斌 武雪亮 趙軼峰 聶雙發(fā) 梁 峰 張迎春

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，治療選擇有限且5 年生存率較低，因此迫切需要尋找有效的分子生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可以促進(jìn)早期檢測(cè)或腫瘤對(duì)特定療法的反應(yīng)，以降低死亡率。Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）是一種新型的RNA 干擾家族，已被證明是癌癥早期檢測(cè)和治療的有效生物標(biāo)志物[1-4]。與微RNA 和小干擾RNA 不同，piRNA 的特征是具有21～35 個(gè)核苷酸的單鏈小非編碼RNA 沉默子，帶有2’-O-甲基修飾的3’末端并與Piwi 蛋白結(jié)合形成功能性沉默復(fù)合物[5-6]。piRNA 的失調(diào)發(fā)生在多種癌癥中，例如多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、食管癌[7]?；趐iRNA 在癌癥樣本中的表達(dá)差異可以將癌癥患者與健康人群區(qū)分開，其檢測(cè)靈敏度高于癌胚抗原和糖類抗原19-9[8-9]。此外，手術(shù)前后患者piRNA 的表達(dá)變化可用于術(shù)后長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和疾病進(jìn)展指標(biāo)[10]。而本研究則旨在探究piR-128 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的生物學(xué)作用及其對(duì)DNA 甲基化酶（DNA methylase，DNMT）3B 的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 患者和標(biāo)本的獲取

選取2018 年2 月至2020 年1 月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）普通外科診斷為結(jié)直腸癌的54 例患者的手術(shù)標(biāo)本，包括其結(jié)直腸癌組織和匹配的正常組織（距腫瘤邊緣3～7 cm），且經(jīng)我院病理科病理診斷。參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行TNM 分期[7]，根據(jù)《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范》[10]評(píng)估其組織學(xué)等級(jí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①在我院普通外科行手術(shù)治療；②年齡≥18 歲；③首次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)腫瘤；②采用化學(xué)療法或放射療法；③孕婦。本研究獲得我院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審：K20150212）。

1.2 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

使用Trizol（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）從人類組織或細(xì)胞中提取總RNA，通過Nanodrop 2 000（Invitrogen，美國(guó)）定量總RNA，使用miScript 逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒（Qiagen GmbH，美國(guó)）生成cDNA，使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，美國(guó)）進(jìn)行qRT-PCR，U6 用作內(nèi)部對(duì)照，PCR 反應(yīng)在ABI7500 FAST 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)條件：變性95℃，30 s；退火58℃，1.0 min；延伸72℃，1.5 min；35 個(gè)循環(huán)。通過比較交叉閾值（Ct）方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)，并使用Graph Pad Prism v.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，引物序列見表1。觀察癌組織和鄰近正常組織中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 水平的差異，分析其與DNMT3B 的相關(guān)性，再進(jìn)一步分析不同piR-128、DNMT3B 水平患者與其臨床特征的關(guān)系。

表1 引物序列

1.3 體外實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌細(xì)胞LIM1215 購(gòu)自美國(guó)典型收藏物保藏中心的細(xì)胞庫(kù)，在補(bǔ)充10%FBS（Invitrogen，美國(guó)）的RPMI1640 培養(yǎng)基（賽多利斯生物試劑，德國(guó)）中培養(yǎng)，按照試劑盒說明書Lipofectamine 2 000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行空白（對(duì)照組）、piR-128 抑制劑（piR-128 抑制劑組）、si-DNMT3B（si-DNMT3B組）、piR-128 抑制劑+DNMT3B Vector（抑制劑+Vector組）的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h 收獲細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所用材料均購(gòu)自浙江格魯斯特生物技術(shù)公司。

1.3.2 Western blot 將細(xì)胞與300 μl RIPA 裂解液（博拓生物科技股份有限公司，中國(guó)）和苯甲磺酰氟（PMSF，博拓生物科技股份有限公司，中國(guó)）在冰上放置30 min 以裂解細(xì)胞，獲取上清液后使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（博拓生物科技股份有限公司，中國(guó)）測(cè)量蛋白質(zhì)裂解物濃度，通過SDS-PAGE 分離總共40 μg 的蛋白裂解物，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%封閉緩沖液封閉膜2 h 后，將膜與抗DNMT3B 和GAPDH 的一抗（1∶500）在4°C 下免疫印跡過夜，然后用HRP 偶聯(lián)的二抗（1∶200）室溫孵育2 h，最后，使用ECL Super Signal West Pico 套件進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

1.3.3 增殖測(cè)定 將細(xì)胞以3 000 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96 孔板中，各組轉(zhuǎn)染24 h 后將10 μl CCK8試劑添加到37℃的普通培養(yǎng)基中反應(yīng)2 h，然后分別在0、12、24、36、48、72 h 時(shí)通過酶標(biāo)儀（Rayto，中國(guó)）記錄450 nm 處的吸光度，各做5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 transwell 實(shí)驗(yàn) 在37℃下將40 μl 的Matrigel（1 μg/μl，BD Biosciences，美國(guó)）添加到transwell 上室預(yù)先包被2 h，各組轉(zhuǎn)染24 h 后將100 μl 細(xì)胞懸液接種到上腔室中，并將600 μl 完全培養(yǎng)基添加到下腔室中，孵育24 h 后，將下部小室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用5%結(jié)晶紫染色，用棉簽涂抹器除去上腔室中未遷移的細(xì)胞，拍攝代表性圖像，并對(duì)5 個(gè)隨機(jī)視野中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)，各做5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6 孔板中，各組轉(zhuǎn)染24 h 后使用200 μl 無(wú)菌移液器進(jìn)行劃痕，各做5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用磷酸鹽平衡鹽溶液洗滌后，將細(xì)胞在補(bǔ)充有1% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在Leica 顯微鏡對(duì)傷口愈合進(jìn)行成像，觀察細(xì)胞遷移率（遷移寬度/總寬度）×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞儀 各組轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞并以1×105個(gè)細(xì)胞/ml 的密度重懸于結(jié)合緩沖液中，用5 μl Annexin V-APC 和5 μl 7-AAD 進(jìn)行雙重染色后，按照生產(chǎn)商的說明使用Cyto FLEX 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析以檢測(cè)細(xì)胞凋亡，各做5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用散點(diǎn)圖表示，比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性，受試者操作特征曲線分析診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與鄰近正常組織中piR-128 和DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA 表達(dá)比較及piR-128 與DNMT3B 的相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌組織中piR-128、DNMT3B mRNA 的表達(dá)水平高于鄰近正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中piR-128 與DNMT3B mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.574，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織與鄰近正常組織中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 表達(dá)比較及piR-128 與DNMT3R 的相關(guān)性分析

2.2 不同piR-128、DNMT3B 水平患者與其臨床特征的關(guān)系

以piR-128 相對(duì)表達(dá)水平的中位數(shù)將患者分為piR-128 高表達(dá)患者（＞2，39 例）和piR-128 低表達(dá)患者（≤2，15 例），結(jié)果顯示piR-128 表達(dá)水平與臨床特征無(wú)關(guān)（P >0.05）。見表2。以DNMT3B mRNA 相對(duì)表達(dá)水平將患者分為DNMT3B 高表達(dá)患者（≥1，35 例）和DNMT3B 低表達(dá)患者（<1，19 例），相關(guān)性分析結(jié)果顯示DNMT3B 表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間無(wú)關(guān)（P >0.05）。見表3。

表2 不同piR-128 水平患者與其臨床特征的關(guān)系（例）

表3 不同DNMT3B 水平患者與其臨床特征的關(guān)系（例）

2.3 piR-128 對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值分析

piR-128 診斷結(jié)直腸癌的截?cái)嘀禐?.52，曲線下面積為0.713（95%CI：0.615～0.810，P ＜0.001），約登指數(shù)為0.398，靈敏度為62.9%，特異度為76.9%。見圖2。

圖2 piR-128 診斷結(jié)直腸癌的受試者操作特征曲線

2.4 四組細(xì)胞piR-128、DNMT3B 表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡情況比較

piR-128 抑制劑組、抑制劑+Vector 組piR-128、DNMT3BmRNA 水平低于對(duì)照組，si-DNMT3B 組DNMT3BmRNA 水平低于對(duì)照組，抑制劑+Vector 組DNMT3BmRNA 水平高于si-DNMT3B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3A。piR-128 抑制劑組、si-DNMT3B 組、抑制劑+Vector 組、DNMT3B 蛋白水平低于對(duì)照組，抑制劑+Vector 組DNMT3B 蛋白水平高于si-DNMT3B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3B。si-DNMT3B 組、piR-128 抑制劑組、抑制劑+Vector 組在24、36、48、72 h 的吸光度均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3C。piR-128 抑制劑組、si-DNMT3B 組、抑制劑+Vector 組細(xì)胞侵襲能力均低于對(duì)照組，抑制劑+Vector 組高于piR-128 組、si-DNMT3B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3D。piR-128 抑制劑組、si-DNMT3B 組、抑制劑+Vector 組細(xì)胞遷移率均低于對(duì)照組，抑制劑+Vector 組高于piR-128 抑制劑組、si-DNMT3B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3E。piR-128 抑制劑組、si-DNMT3B 組、抑制劑+Vector 組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，抑制劑+Vector 組低于si-DNMT3B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3F。

圖3 四組細(xì)胞piR-128、DNTM3B 表達(dá)水平及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡情況比較（n=5）

3 討論

先前研究表明，piRNA 是一種重要的生物標(biāo)志物，在多種人類癌癥中失調(diào)[11-13]。piR-128 在包括乳腺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的癌癥中上調(diào)[14-19]，在胃癌和腎癌中表達(dá)則下調(diào)[20-21]。本研究結(jié)果顯示，piR-128 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著升高，并可通過DNMT3B 發(fā)揮促癌作用。

在轉(zhuǎn)錄后水平上，piRNA 可誘導(dǎo)mRNA 降解及蛋白質(zhì)磷酸化或泛素化調(diào)控癌癥的發(fā)生和進(jìn)展[22-24]，機(jī)制分析表明，piR-128 通過與其共同轉(zhuǎn)錄因子HSF1結(jié)合并誘導(dǎo)其在Ser326 位點(diǎn)磷酸化，同時(shí)促進(jìn)HSP27、HSP60、HSP70 的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖而抑制凋亡。本研究在結(jié)直腸癌中觀察到piR-128 和DNMT3B 的過表達(dá)，以及piR-128 和DNMT3B 呈正相關(guān)，據(jù)此假設(shè)piR-128 可能通過DNMT3B 激活異常DNA 甲基化，本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分提示，該假設(shè)可能為piR-128 的促癌機(jī)制。piRNA 在細(xì)胞惡性表型（細(xì)胞增殖、逃避細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲和細(xì)胞周期停滯）中具有調(diào)節(jié)作用，例如肺癌細(xì)胞中piRNA-128 敲低可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，從而引發(fā)促血管生成活性[16-18]。此外，piRNA-128 抑制劑可抑制肺癌細(xì)胞外囊泡對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖和抗凋亡作用，伴隨著上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白和活性氧的產(chǎn)生及下調(diào)一氧化氮的產(chǎn)生[21]。而抑制piR-128 可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖抑制、細(xì)胞周期停滯在G1期和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)[20]。而本研究中，一系列的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，piRNA-128 可以在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，在使用piRNA-128 抑制劑轉(zhuǎn)染后，DNMT3B 過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)piRNA-128 抑制誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力抑制和細(xì)胞凋亡增加，提示piRNA-128 的促癌作用需要通過DNMT3B 來(lái)發(fā)揮。

綜上，本研究提示，piR-128 和DNMT3B 在結(jié)直腸癌中上調(diào)，較高水平的piR-128 與DNMT3B 表達(dá)呈正相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)則提示piR-128 可以通過上調(diào)DNMT3B表達(dá)發(fā)揮促癌作用，piR-128 在結(jié)直腸癌中的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物潛力。