李運(yùn)杰， 關(guān) 鵬， 任建剛， 賈夢可， 錢文熙*

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

隨著我國畜牧業(yè)和飼料業(yè)的快速發(fā)展，蛋白飼料資源日益短缺（尹杰，2019），供求矛盾日益突出，價(jià)格也越來越高。棉籽粕飼料富含蛋白質(zhì)，成本低廉，新疆擁有豐富的棉花資源，是我國乃至全世界最大的產(chǎn)棉區(qū)，資源量全球第一（朱曉芳，2020）。合理利用棉籽餅粕可為新疆地區(qū)生產(chǎn)發(fā)展提供有益幫助，但受多種因素制約，棉籽餅粕飼料綜合利用率極低，其中最主要的原因是棉籽餅粕中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子棉酚，影響動物生長和健康（毛林峰，2014）。呂云峰（2010）按飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)游離棉酚最大量1200 mg/kg為依據(jù)，對牛羊不同生長階段推薦了10%~20%不等的棉籽粕安全限量。因此，本試驗(yàn)中棉酚添加量在0~1000 mg/kg。使用未脫毒的棉籽餅飼喂畜禽會導(dǎo)致畜禽中毒（朱曉春，2012），單胃動物棉酚中毒報(bào)道居多，少有反芻動物棉酚中毒報(bào)道，但長期飼喂棉副產(chǎn)品飼料也會導(dǎo)致中毒。

棉酚存在于棉籽中而各種加工方法都難以將其徹底清除。游離棉酚主要由活性醛基和活性羥基產(chǎn)生毒性而引起多種危害（Garry，2007），Chung（2000）研究結(jié)果表明，棉酚可以通過對膜基質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，以及通過負(fù)離子自由基機(jī)制對膜相結(jié)構(gòu)的破壞和對電子傳遞體系的干擾，從多個方面干擾細(xì)胞的代謝，尤其是與鈣離子依賴性蛋白激酶有關(guān)的代謝的干擾最強(qiáng)。劉軍（2008）指出隨著棉酚濃度的提高，組氨酸、半骯氨酸以及甘氨酸能有效降低棉酚對乳酸脫氫酶的抑制作用。瘤胃對游離棉酚具有解毒能力，在瘤胃內(nèi)，游離棉酚與可溶性蛋白結(jié)合形成結(jié)合棉酚。Radominska-Pandya（2010）認(rèn)為，反芻動物對棉酚的脫毒主要依靠瘤胃微生物，其原理可能是通過游離棉酚與微生物所分泌的酶、氨基酸或活性蛋白中的游離氨基結(jié)合，將游離棉酚轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，從而達(dá)到脫毒效果。目前研究表明反芻動物對棉酚有一定耐受性，但能夠承受的棉酚最大添加量還未確定，本試驗(yàn)通過體外產(chǎn)氣法研究不同棉酚添加量對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，并建議綿羊飼料中棉產(chǎn)品中的棉酚安全含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理 選擇健康狀況良好、雌性、品種內(nèi)體重差異不顯著的綿羊[3歲，（40±2.0）kg]3只單圈飼養(yǎng)，自由采食和自由飲水，每日8：00和20：00各飼喂一次。

1.2 日糧設(shè)計(jì) 按照等能等氮的原則配制基礎(chǔ)日糧，參考《動物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)》（張宏福，1998）中營養(yǎng)需要進(jìn)行配方設(shè)計(jì)，具體日糧組成如表1所示。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)6個處理組，分別為對照組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組，每組12個重復(fù)培養(yǎng)體系。棉酚，由北京邁瑞達(dá)科技有限公司提供，純度≥98%，占底物的添加含量分別為125、250、500、750 mg/kg和1000 mg/kg，對照組不添加棉酚，其他培養(yǎng)液和底物均相同，通過體外產(chǎn)氣測定綿羊體外發(fā)酵參數(shù)。

1.4 瘤胃液的獲取及人工瘤胃液的制備 瘤胃液采集：于晨飼前，通過瘺管取瘤胃上中下左右不同位點(diǎn)的瘤胃液，4層紗布過濾后放于提前預(yù)熱（39℃）的保溫壺中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

人工瘤胃液制備：人工唾液根據(jù)MENKE（1988）等的方法制備。備齊所需培養(yǎng)液，并按1：2的比例向瘤胃液中加入提前通入二氧化碳并預(yù)熱的人工唾液均勻混合，此發(fā)酵過程培養(yǎng)及樣品持續(xù)通入二氧化碳處理。

1.5 體外發(fā)酵培養(yǎng)及樣品的處理 精確稱取標(biāo)準(zhǔn)棉酚0.0050 g，用1%醋酸的無水乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶，即得到0.05 mg/mL的醋酸棉酚溶液。精確稱取發(fā)酵底物0.2000 g于注射器底部，將0.5 mL醋酸棉酚加入注射器底部的0.2000 g發(fā)酵底物上即得到125 mg/kg棉酚含量的發(fā)酵底物，250 mg/kg組添加1 mL、500 mg/kg組添加2 mL、750 mg/kg組添加3 mL、1000 mg/kg組添加4 mL醋酸棉酚溶液，對照組不添加醋酸棉酚，每組12個重復(fù)。注射芯在插入注射器前在其表面均勻涂抹凡士林，并小心插入注射器，注射器頂部套上三通閥。將配制完的人工瘤胃液吸至注射器內(nèi)，此過程持續(xù)通入二氧化碳，每支30 mL，關(guān)閉注射器三通閥閥門，置于39℃恒溫水浴搖床中振蕩發(fā)酵，記錄不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量，48 h發(fā)酵后的發(fā)酵液立即進(jìn)行pH測定，隨后將發(fā)酵液3500 r/min離心10 min。取發(fā)酵液上清液于40 mL離心管-20℃保存，用于測定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸濃度。

1.6 測定指標(biāo) 產(chǎn)氣量：讀取注射器上的刻度測定不同時(shí)間點(diǎn)（3、6、12、24、48 h）的產(chǎn)氣量。

瘤胃pH：取樣之后，立即利用pH計(jì)（FE22）快速測定pH。

氨態(tài)氮濃度：根據(jù)馮宗慈（2010）的比色法測定氨態(tài)氮含量。

揮發(fā)性脂肪酸測定：取出10 mL發(fā)酵液，10000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，用渦旋振蕩器混合均勻，再以10000 r/min離心15 min，過0.22 μL微孔膜參照曹慶云等（2006）方法測定揮發(fā)性脂肪酸。

48 h干物質(zhì)降解率和蛋白降解率：將48 h發(fā)酵后注射器中的殘?jiān)谷肽猃埓?，按照《動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實(shí)踐教程》（錢文熙，2012）測定日糧干物質(zhì)含量和蛋白質(zhì)含量并根據(jù)公式計(jì)算降解率：

干物質(zhì)降解率/%=（B－C）/B×100；

式中：B為待測樣品中干物質(zhì)的含量，%；C為待測樣品尼龍袋殘?jiān)懈晌镔|(zhì)含量，%。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，SPSS 17.0處理軟件中單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，LSD法多重比較其差異性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃產(chǎn)氣量的影響由表2可見，隨發(fā)酵時(shí)間的增長，各組的產(chǎn)氣量逐漸增加，隨棉酚添加量的增加各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量逐漸下降，第Ⅰ組各時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量均低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組各時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)氣量均低于對照組差異顯著（P＜0.05），即超過250 mg/kg棉酚添加量的發(fā)酵組產(chǎn)氣量顯著低于未添加棉酚的發(fā)酵組（P＜0.05），48 h時(shí)第Ⅱ組產(chǎn)氣量比對照組降低了24.46%。

表2 不同棉酚添加量對綿羊產(chǎn)氣量的影響

2.2 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響由表3可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組瘤胃液在48 h時(shí)的pH呈下降趨勢。對照組的pH最高與第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的pH顯著低于對照組（P＜0.05），第Ⅱ組pH比對照組降低了0.62%。第Ⅱ組pH低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組pH顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組pH低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組pH低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響

2.3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃48 h干物質(zhì)降解率的影響 由表4可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的48 h干物質(zhì)降解率逐漸減少，對照組48 h干物質(zhì)降解率最高，第Ⅰ組48 h干物質(zhì)降解率低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組48 h干物質(zhì)降解率呈下降趨勢，且均低于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組48 h干物質(zhì)降解低于第Ⅰ組差異顯著（P＜0.05）降低了7.07%，第Ⅲ組48 h干物質(zhì)降解率低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組48 h干物質(zhì)降解低于第Ⅲ組差異顯著（P＜0.05），第Ⅴ組48 h干物質(zhì)降解低于第Ⅳ組差異顯著（P＜0.05）。

表4 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃48 h干物質(zhì)降解率的影響

2.4 不同棉酚添加量對綿羊粗蛋白降解率的影響 由表5可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的蛋白質(zhì)干物質(zhì)降解率逐漸減少，對照組粗蛋白質(zhì)降解率最高，第Ⅰ組粗蛋白質(zhì)降解率低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組粗蛋白質(zhì)降解率呈下降趨勢均低于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組粗蛋白質(zhì)降解率比對照組降低了3.85%，第Ⅱ組粗蛋白質(zhì)降解率低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組粗蛋白質(zhì)降解率低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組粗蛋白質(zhì)降解率低于第Ⅲ組差異顯著（P＜0.05），第Ⅴ組粗蛋白質(zhì)降解率低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同棉酚添加量對綿羊粗蛋白質(zhì)降解率的影響

2.5 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮的影響由表6可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的氨態(tài)氮含量呈上升趨勢，對照組的氨態(tài)氮含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組氨態(tài)氮含量呈上升趨勢均高于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組氨態(tài)氮含量比對照組升高了13.73%，第Ⅱ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅰ組（P＜0.05），第Ⅲ組氨態(tài)氮含量高于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅳ組（P＜0.05）。

表6 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮的影響

2.6 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響 由表7可見，隨棉酚含量的增加，各發(fā)酵組的乙酸、丙酸、丁酸、乙酸比丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均呈下降趨勢。對照組的乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均最高，均與第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量呈下降趨勢，與對照組差異顯著（P＜0.05）。第Ⅱ組的乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量比對照組分別降低了16.19%、11.60%、20.84%。第Ⅱ組乙酸含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組乙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組丙酸含量低于第Ⅰ組和對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的丙酸含量呈下降趨勢，與對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅲ組丙酸含量比對照組降低了16.64%，第Ⅲ組丙酸含量顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組丙酸含量顯著低于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組丙酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組丁酸含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組丁酸含量顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組丁酸含量低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組丁酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。對照組乙酸比丙酸含量最高，顯著高于其他組（P＜0.05），第Ⅰ組、第Ⅱ組和第Ⅲ組乙酸比丙酸含量差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組乙酸比丙酸含量顯著低于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組乙酸比丙酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著低于第Ⅰ組（P＜0.05），第Ⅲ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表7 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響 mmol/L

3 討論

3.1 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃產(chǎn)氣量的影響瘤胃微生物可消耗飼料中的碳水化合物和粗蛋白質(zhì)，產(chǎn)生二氧化碳、甲烷、氫氣和低級脂肪酸等，當(dāng)產(chǎn)氣量越高，表明瘤胃微生物活性越高（雷冬至，2009）。產(chǎn)氣量反映了瘤胃微生物的生長情況和飼料底物的降解程度，可發(fā)酵的營養(yǎng)物質(zhì)越多微生物活性越強(qiáng)，產(chǎn)氣量越大（徐子萱，2021）。本試驗(yàn)中，各發(fā)酵組的產(chǎn)氣量隨著時(shí)間的增加而增加，添加棉酚組的產(chǎn)氣量均低于對照組，且隨棉酚添加量的增多產(chǎn)氣量呈下降趨勢，添加250 mg/kg顯著低于對照組，說明當(dāng)棉酚添加量超過250 mg/kg時(shí)對綿羊瘤胃微生物產(chǎn)生影響，降低了微生物活性。王彩蝶（2019）研究發(fā)現(xiàn)，用棉酚含量為361 mg/kg和722 mg/kg的飼料飼養(yǎng)綿羊時(shí)，瘤胃液中的原蟲數(shù)量逐漸降低，棉酚添加量的增加使原蟲數(shù)量下降，抑制了瘤胃發(fā)酵，使產(chǎn)氣量呈下降趨勢。

3.2 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響瘤胃pH是評價(jià)瘤胃發(fā)酵的綜合指標(biāo)（馮帆，2020），反芻動物通過唾液分泌合成、吸收和排出瘤胃內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸和有機(jī)酸，反映了瘤胃微生物代謝產(chǎn)物的酸堿平衡狀況（馮帆，2019）。瘤胃液的正常pH在5.5~7.5，過酸或過堿不利于瘤胃微生物發(fā)酵（郝建祥，2011）。本試驗(yàn)各發(fā)酵組48 h發(fā)酵后的pH均在正常范圍內(nèi)，說明緩沖液配制合理達(dá)到了穩(wěn)定發(fā)酵環(huán)境的條件。本試驗(yàn)發(fā)酵48 h時(shí)對照組與添加250、500 mg/kg和750 mg/kg棉酚組的pH差異不顯著，添加1000 mg/kg棉酚組與對照組差異顯著。王海榮（2012）研究表明添加0、50、100 mg/kg和500 mg/kg棉酚對綿羊體外發(fā)酵48 h時(shí)的pH影響不顯著，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。

3.3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸的影響 氨態(tài)氮是瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料（王志敬，2017）。氨態(tài)氮含量越高說明合成的蛋白質(zhì)越多。本試驗(yàn)中隨棉酚添加量的增加瘤胃氨態(tài)氮含量呈下降趨勢，瘤胃氨態(tài)氮濃度主要受瘤胃微生物合成蛋白的影響（孫國強(qiáng)，2013）。侯彩云（2012）研究表明添加棉酚發(fā)酵后瘤胃氨態(tài)氮含量高于未添加棉酚發(fā)酵組，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。Mena（2011）認(rèn)為游離棉酚與瘤胃中的游離氨基酸結(jié)合。隨游離棉酚含量的增加生成的結(jié)合蛋白增多，可能使瘤胃中的氨氮含量增多從而增加了氨態(tài)氮含量。飼料中的碳水化合物通過瘤胃微生物的代謝作用最終形成揮發(fā)性脂肪酸，揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量可顯著影響反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和生產(chǎn)能力的發(fā)揮（張華，2018）。本試驗(yàn)隨棉酚添加量的增加乙酸、丙酸和丁酸含量呈下降趨勢，250 mg/kg棉酚添加組顯著低于對照組，與產(chǎn)氣量的變化規(guī)律一致，進(jìn)一步說明棉酚添加量超過250 mg/kg時(shí)，對瘤胃發(fā)酵有抑制作用。

3.4 不同棉酚添加量對綿羊干物質(zhì)降解率和粗蛋白質(zhì)降解率的影響 干物質(zhì)降解率可反映反芻動物機(jī)體對飼料的消化能力，是評價(jià)不同飼料飼用價(jià)值高低的重要指標(biāo)，越高說明瘤胃微生物活性越強(qiáng)、發(fā)酵效果越好（Zhang，2016）。導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)降解率差異的主要是飼料本身的蛋白質(zhì)降解性和飼料中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、來源等因素的影響（Devant，2001）。張力莉（2014）通過體外產(chǎn)氣法研究游離棉酚對瘤胃發(fā)酵的影響表明，隨棉酚添加量的增加，干物質(zhì)降解率呈下降趨勢，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。干物質(zhì)降解率和粗蛋白降解率是都是隨棉酚添加量的增加呈下降趨勢，通過上述結(jié)果表明，棉酚添加量超過250 mg/kg時(shí)飼料不易消化吸收，降低了反芻動物對粗蛋白質(zhì)的利用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）隨棉酚添加量的增加，產(chǎn)氣量、pH、干物質(zhì)降解率、蛋白質(zhì)降解率和揮發(fā)性脂肪酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢，氨態(tài)氮呈現(xiàn)上升趨勢。（2）125 mg/kg的棉酚添加量對瘤胃發(fā)酵無顯著影響，超過250 mg/kg的棉酚添加量后對瘤胃發(fā)酵有抑制作用，因此建議綿羊飼料中棉產(chǎn)品中的棉酚含量不超過250 mg/kg。