李鰻亭，韋穎怡，楊 帆，李新春

（廣西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

MicroRNAs（miRNAs）是一類由17~25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡等許多過程中扮演重要的角色［1-2］。研究表明，miRNAs表達(dá)水平與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是相關(guān)疾病臨床早期診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志物［3-4］。

miRNAs具有序列高度同源、豐度低等特點(diǎn)，給其定量檢測(cè)帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)［5］。目前較為成熟的miRNAs檢測(cè)方法主要包括Northern印跡分析［6］、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)［7］和微陣列分析等［8］。近年來，微流控芯片技術(shù)［9］、局部表面等離子共振［10］、表面增強(qiáng)拉曼散射［11-12］和熒光分析［13-14］等方法被用于miRNA的定量檢測(cè)。電化學(xué)技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、響應(yīng)速度快、檢測(cè)成本低、可微型集成化等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。Zouari等［15］在AuNPs/rGO修飾的SPCEs上組裝巰基標(biāo)記DNA捕獲探針，將鏈霉親和素修飾的二茂鐵封端的AuNPs與生物素化的檢測(cè)探針相結(jié)合，作為標(biāo)記納米載體，在miRNA-21存在下進(jìn)行“三明治”雜交，實(shí)現(xiàn)miRNA-21的高靈敏檢測(cè)；Bao等［16］報(bào)道了一種雙鏈特異性核酸酶功能化的石墨烯納米陣列/金納米粒子碳墨電極，用于miRNA的動(dòng)態(tài)、靈敏和實(shí)時(shí)分析；Wang等［17］開發(fā)了一種基于靶標(biāo)介導(dǎo)的環(huán)狀鏈置換反應(yīng)和引物交換DNA擴(kuò)增反應(yīng)的雙重?cái)U(kuò)增策略的非標(biāo)記電化學(xué)生物傳感器，用于檢測(cè)外泌體中miRNA；Luo等［18］開發(fā)了一種基于鎖核酸修飾的“Y”形結(jié)構(gòu)的比率型電化學(xué)DNA生物傳感器，用于檢測(cè)外泌體中miRNA-21。上述方法均具有較高靈敏度，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程略顯繁瑣，耗時(shí)耗力。

本文報(bào)道了一種非標(biāo)記、靶標(biāo)誘導(dǎo)核酸自組裝，且無需酶輔助信號(hào)擴(kuò)增或其他繁瑣雜交鏈反應(yīng)的電化學(xué)傳感方法，用于miRNA-21的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)miRNA-21存在時(shí)，金電極表面巰基標(biāo)記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)捕獲探針打開，與設(shè)計(jì)的兩個(gè)銜接子Strand-UP鏈、Strand-DOWN鏈，以及miRNA-21互補(bǔ)配對(duì)，自組裝成一個(gè)“H”型核酸復(fù)合結(jié)構(gòu)。同時(shí)，利用鐵氰根離子（［Fe（CN）6］3-）調(diào)控［Ru（NH3）6］3+/2+氧化還原循環(huán)，實(shí)現(xiàn)催化電流信號(hào)放大。該生物傳感器對(duì)miRNA-21具有極高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)單堿基錯(cuò)配以及其他miRNA分子具有很強(qiáng)的抗干擾能力，適用于多個(gè)細(xì)胞系中miRNA-21的定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI650E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器股份有限公司）；pH酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；TDL-5A臺(tái)式低速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；MICRO17R小型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，美國）；ME104E萬分之一電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

除特別說明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。K3［Fe（CN）6］、K4［Fe（CN）6］·3H2O、KCl、NaCl、MgCl2、HCl、H2SO4、無水乙醇、6-巰基己醇（MCH）、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP，純度≥98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99．8%）、氯化六氨合釕（［Ru（NH3）6］3+，RuHex）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氧化鋁（Al2O3，0．05 μm，武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司）；MicroRNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（18．2 MΩ·cm）。DNA序列（見表1）由上海生工生物工程有限公司合成并經(jīng)高效液相色譜法純化。實(shí)驗(yàn)用緩沖溶液如表2所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)使用的核酸序列Table 1 The nucleic acid sequences used in this experiment

表2 本實(shí)驗(yàn)使用的緩沖溶液Table 2 The buffer solutions used in this experiment

1.2 電極的預(yù)處理

將2 mm金盤電極在拋光布上用Al2O3粉（粒徑0．05 μm）充分打磨后，依次用水、乙醇、水各超聲1 min。然后將電極置于0．5 mol/L H2SO4中，用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行活化（掃速為100 mV/s，電位范圍為-0．25~1．55 V），至形成穩(wěn)定的伏安圖譜。取出電極用水沖洗，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.3 非標(biāo)記miRNA-21電化學(xué)傳感器的構(gòu)建

將50 μL含1．0 μmol/L CP和1 mmol/L TCEP的Buffer-Ⅰ避光處理1 h，取6 μL滴至金電極表面，在室溫下避光孵育2 h。用Buffer-W沖洗金電極盤面，氮?dú)獯蹈珊髮⒔痣姌O置于200 μL 1 mmol/L MCH溶液中浸泡1 h，封閉殘余的電極位點(diǎn)，然后用Buffer-W沖洗干凈。再將CP/MCH修飾的金電極浸入40 μL Strand-UP、40 μL Strand-DOWN以及40 μL含不同濃度miRNA-21的Buffer-H中，37．5℃孵育12 h，取出電極，用Buffer-W沖洗電極盤面。最后，將金電極置于10 mL Buffer-E-1中5 min，通過靜電吸附［Ru（NH3）6］3+至平衡狀態(tài)，用于后續(xù)電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)。測(cè)試前向電解池中通10 min氮?dú)獬?，排除其?duì)電化學(xué)測(cè)量的干擾。

1.4 電化學(xué)測(cè)量

電化學(xué)檢測(cè)采用三電極系統(tǒng)，其中鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl（3 mol/L氯化鉀）電極為參比電極，組裝有核酸納米結(jié)構(gòu)的金電極（直徑2 mm）為工作電極，室溫下測(cè)量。DPV電位掃描范圍為0．1~0．6 V，振幅50 mV、脈沖寬度0．05 s、脈沖周期0．2 s，掃描速度為50 mV/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

基于靶標(biāo)誘導(dǎo)自組裝、非標(biāo)記、電化學(xué)-化學(xué)偶聯(lián)信號(hào)放大的miRNA-21超靈敏電化學(xué)檢測(cè)示意圖如圖1所示。利用金-硫鍵可將末端修飾巰基的CP固定在金電極表面，CP序列首尾部含有4對(duì)C/G堿基對(duì)，可形成相對(duì)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。Strand-UP和Strand-DOWN鏈均含有與CP、miRNA-21部分互補(bǔ)的片段。在無miRNA-21的情況下，由于CP莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，Strand-UP和Strand-DOWN不能與金電極表面的CP相互作用形成DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，電極表面僅有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)未被打開。由于核酸鏈中帶負(fù)電荷的磷酸骨架與釕氨離子（［Ru（NH3）6］3+）之間存在靜電作用，［Ru（NH3）6］3+可靜電吸附到CP鏈上，通過DNA介導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生很低的背景電流信號(hào)。當(dāng)有miRNA-21時(shí)，觸發(fā)CP鏈的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，CP與Strand-UP、Strand-DOWN以及miRNA-21通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成一個(gè)“H”型的DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，為［Ru（NH3）6］3+提供了大量的吸附位點(diǎn)，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的電流信號(hào)。當(dāng)測(cè)試體系中含有［Fe（CN）6］3-時(shí)，［Ru（NH3）6］3+電解還原產(chǎn)物［Ru（NH3）6］2+進(jìn)一步被［Fe（CN）6］3-氧化，重新生成［Ru（NH3）6］3+，即形成電化學(xué)-化學(xué)偶聯(lián)循環(huán)，使得［Ru（NH3）6］3+被多次利用，產(chǎn)生高效的催化電流和信號(hào)放大效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-21的超靈敏檢測(cè)［19］。

圖1 一種非標(biāo)記及催化信號(hào)放大的miRNA-21電化學(xué)傳感示意圖及信號(hào)響應(yīng)模式圖Fig．1 Schematic diagram and signal response mode of label-free and catalytic current amplified electrochemical sensing of miRNA-21

2.2 電極修飾表征

采用電化學(xué)阻抗圖譜（EIS）對(duì)電極修飾過程進(jìn)行表征，高頻區(qū)域?yàn)殡娮愚D(zhuǎn)移控制過程，其中半圓形弧線直徑對(duì)應(yīng)電荷轉(zhuǎn)移阻抗。如圖2所示，在5 mmol/L K3［Fe（CN）6］+5 mmol/L K4［Fe（CN）6］體系（即Buffer-E-2）中，裸金電極在高頻區(qū)域僅有一個(gè)非常小的半圓弧線，電荷轉(zhuǎn)移阻抗約為140 Ω（曲線a），表明在金電極表面具有快速的電子傳遞過程。當(dāng)電極修飾了CP后，電荷轉(zhuǎn)移阻抗增大到約2 070 Ω（曲線b），這是由于DNA帶負(fù)電荷，與［Fe（CN）6］3-/4-電化學(xué)對(duì)之間存在靜電排斥，表明CP通過金-硫鍵連接到金電極表面。用MCH封閉金電極表面多余的活性位點(diǎn)后，電荷轉(zhuǎn)移阻抗進(jìn)一步增大到10 530 Ω（曲線c），這是由于MCH會(huì)阻礙［Fe（CN）6］3-/4-與電極界面的接觸和電子交換。當(dāng)無靶標(biāo)存在時(shí)，電荷轉(zhuǎn)移阻抗約為10 900 Ω，這是因?yàn)橐隨trand-UP和Strand-DOWN后，不能形成穩(wěn)定的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，因此不會(huì)改變電極表面狀態(tài)（曲線d）。當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)，由于形成DNA-RNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重阻礙了電子交換過程，導(dǎo)致電荷轉(zhuǎn)移阻抗顯著增大至17 500 Ω（曲線e）。以上結(jié)果表明已在金電極上成功識(shí)別miRNA-21并自組裝形成核酸復(fù)合結(jié)構(gòu)。

圖2 電極修飾過程中電化學(xué)阻抗譜的變化Fig．2 Electrochemical impedance spectroscopy tracing the modification process of gold electrode

2.3 捕獲探針的組裝密度

金電極表面CP的組裝密度對(duì)形成H型DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的影響較大，進(jìn)而會(huì)影響電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)。因此采用計(jì)時(shí)電量法（CC）檢測(cè)不同濃度CP在電極上的組裝密度［20］。當(dāng)用CP修飾的電極置于含有多價(jià)氧化還原陽離子和低離子強(qiáng)度電解質(zhì)中時(shí)，氧化還原陽離子與天然電荷補(bǔ)償陽離子交換并在該界面處被靜電捕獲。計(jì)時(shí)庫侖法（Chronocoulometry）可以方便地將基于擴(kuò)散的RuHex氧化還原過程與表面限制的RuHex氧化還原過程分開，由于雙電層和其他吸附在電極表面上的物質(zhì)的反應(yīng)引起的電量，不同于由于擴(kuò)散到電極表面的氧化還原分子反應(yīng)產(chǎn)生的電量。因此，采用計(jì)時(shí)庫侖法可對(duì)DNA上吸附的陽離子（［Ru（NH3）6］3+）氧化還原電量進(jìn)行測(cè)量，從而計(jì)算出CP分子的組裝密度。積分電量Q，作為計(jì)時(shí)庫侖實(shí)驗(yàn)中時(shí)間t的函數(shù)由積分Cottrell表達(dá)式給出，公式如下：

式中，n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，A是電極面積（cm2），D0是擴(kuò)散系數(shù)（cm2·s-1），C0是體積濃度（mol/cm2），Qdl是電容電荷（C），nFAΓ0是吸附的氧化還原標(biāo)記的Γ0（mol/cm2）還原產(chǎn)生的電荷。Γ0表示限制在電極表面附近的RuHex的量，Q總電荷包含電容電荷和吸附的反應(yīng)物電荷。計(jì)時(shí)庫侖截距（在t=0時(shí)）表示限制在電極表面的氧化還原分子RuHex的電荷。由于RuHex對(duì)DNA的完全電荷補(bǔ)償，表面限制的氧化還原分子數(shù)可轉(zhuǎn)換為DNA探針密度，關(guān)系如下：

式中，ΓDNA是探針表面密度（mol/cm2），m是探針DNA中的堿基數(shù)，Z是氧化還原分子的電荷數(shù)（Z=1），NA是阿伏伽德羅常數(shù)。圖3A給出了CP修飾電極在Tris緩沖液中的計(jì)時(shí)庫侖圖，通過對(duì)比這兩種情況（即Tris緩沖液中是否含有50 μmol/L RuHex）的氧化還原電量，可計(jì)算出修飾電極上CP探針的組裝密度。從圖3B可以看出，當(dāng)CP濃度為0．7 μmol/L時(shí)，其組裝密度相對(duì)較高，濃度達(dá)到1．5 μmol/L時(shí)，CP組裝密度下降較為明顯，這是由于過高濃度的DNA單鏈之間會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻，不利于DNA自組裝單層的形成。

圖3 電化學(xué)傳感器在加入RuHex前后緩沖溶液中的計(jì)時(shí)庫侖圖（A），及不同濃度CP在金電極上的組裝密度（B）Fig．3 Chronocoulometry signal response of the electrochemical sensor in buffer without or with RuHex（A），and comparison of the assembly density of CP on gold electrode（B）

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，提高檢測(cè)靈敏度，對(duì)CP濃度、Strand-UP/Strand-DOWN與CP濃度比及核酸組裝時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。采用微分脈沖伏安法（DPV）檢測(cè)電流信號(hào)的改變：S%=（ImiRNA-21-I0）/I0×100%，式中S%為電流信號(hào)的改變，ImiRNA-21為miRNA-21存在時(shí)的峰電流值，I0為無miRNA-21時(shí)的峰電流值，其中靶標(biāo)miRNA-21濃度固定為100 pmol/L。

2.4.1 CP濃度的優(yōu)化CP濃度會(huì)影響其在金電極表面的組裝密度，進(jìn)而影響DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的生成效率。如圖4A所示，當(dāng)CP濃度從0．2 μmol/L增加到1．0 μmol/L時(shí)，信號(hào)增幅逐漸增大，繼續(xù)增加CP濃度至1．5 μmol/L，則S%降低。這是由于當(dāng)電極表面CP濃度過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較大的空間位阻，致使兩個(gè)銜接子鏈和miRNA-21不能有效形成穩(wěn)定的H結(jié)構(gòu)；CP濃度過低時(shí)，則生成的H結(jié)構(gòu)較少，吸附的釕氨離子數(shù)量有限，電流信號(hào)弱，靈敏度低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇1．0 μmol/L CP作為最佳固定探針濃度。

圖4 CP濃度（A）、Strand-UP/Strand-DOWN與CP的濃度比（B）及孵育時(shí)間（C）對(duì)信號(hào)響應(yīng)的影響Fig．4 Effects of CP concentration（A），concentration ratio of Strand-UP/Strand-DOWN to CP（B），and incubation time（C）on electrochemical signal response

2.4.2 雜交鏈與CP濃度比的優(yōu)化Strand-UP/Strand-DOWN與CP的濃度比會(huì)直接影響H型DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的形成效率。如圖4B所示，S%在濃度比0~2之間隨比值的增大而增大，繼續(xù)增大濃度比，則S%呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)Strand-UP/Strand-DOWN濃度過大時(shí)，會(huì)增大電極表面的空間位阻，使得CP莖環(huán)結(jié)構(gòu)不能有效打開，阻礙了H型DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致S%降低。另外，過高濃度的Strand-UP/Strand-DOWN鏈會(huì)產(chǎn)生較大的靜電排斥，4條鏈不能有效地識(shí)別和互補(bǔ)配對(duì)，從而導(dǎo)致S%降低。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Strand-UP/Strand-DOWN與CP鏈的濃度比為2作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

2.4.3 孵育時(shí)間的優(yōu)化孵育時(shí)間直接影響4條核酸鏈雜交反應(yīng)的進(jìn)程以及最終H型DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的數(shù)量，進(jìn)而影響電化學(xué)響應(yīng)靈敏度。如圖4C所示，S%在4~12 h范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)電流信號(hào)逐漸增大，之后呈下降趨勢(shì)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇12 h作為最佳孵育時(shí)間。

2.5 電化學(xué)傳感器的性能分析

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下考察了傳感器對(duì)不同濃度miRNA-21的響應(yīng)。測(cè)試體系為表2中的Buffer-E-1。如圖5所示，在0．1 fmol/L~0．1 nmol/L濃度范圍內(nèi)，DPV電流響應(yīng)值隨著miRNA-21濃度的不斷增加，峰電流增幅與濃度的對(duì)數(shù)（lgcmiRNA-21）呈良好的線性關(guān)系（圖5插圖），其線性方程為S%=19．05 lgcmiRNA-21+331．53，r2=0．995，檢出限（LOD，S/N≥3）為12．8 amol/L。以上結(jié)果表明所采用的電化學(xué)-化學(xué)偶聯(lián)循環(huán)策略可顯著增強(qiáng)電流響應(yīng)，提高miRNA-21的檢測(cè)靈敏度。相較其他miRNA電化學(xué)傳感器，本方法具有更低的檢出限（見表3）。

圖5 信號(hào)擴(kuò)增模式下系列濃度miRNA-21的微分脈沖伏安圖Fig．5 DPV curves of the sensor response to serial concentrations of miRNA-21 with signal amplification strategy insert：quantitative calibration curve of the sensor for miRNA-21 assay

表3 miRNA電化學(xué)傳感器的性能比較Table 3 Comparison of analytical performance of electrochemical sensors for miRNA assay

2.6 電化學(xué)傳感器的特異性分析

為評(píng)估制備的電化學(xué)傳感器對(duì)miRNA-21檢測(cè)的特異性，以相同濃度（100 pmol/L）的其他miRNA，包括miRNA-16、miRNA-39，以及不同堿基錯(cuò)配RNA鏈對(duì)該傳感器的抗干擾能力進(jìn)行考察。如圖6所示，相同濃度水平的miRNA-21可產(chǎn)生164%的電流信號(hào)變化，其他潛在干擾物的信號(hào)變化比值均低于20%，表明制備的傳感器具有很好的特異性，可以區(qū)分其他miRNA家族成員、多堿基錯(cuò)配甚至是單堿基錯(cuò)配RNA序列，這得益于H型核酸復(fù)合結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。

圖6 傳感器對(duì)miRNA-21測(cè)定的選擇性Fig．6 Selectivity of the present sensor for miRNA-21 assay

2.7 細(xì)胞裂解液中的miRNA-21檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法在復(fù)雜生物基質(zhì)中定量測(cè)定miRNA-21的能力，以4種腫瘤細(xì)胞如小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCl-H460）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、宮頸癌細(xì)胞（Hela）和正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的細(xì)胞裂解物作為分析樣本，濃度分別為9．4×10-14、2．7×10-15、2．9×10-11、3．0×10-13、6．0×10-18mol/L?？梢园l(fā)現(xiàn)，相對(duì)于其他腫瘤細(xì)胞，MCF-7細(xì)胞中的miRNA-21濃度較高，也明顯高于正常內(nèi)皮細(xì)胞。因此，該方法能夠靈敏地檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中miRNA-21的濃度水平，在相關(guān)疾病診斷中具有一定的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種靶標(biāo)介導(dǎo)的無標(biāo)記且無需酶輔助信號(hào)擴(kuò)增的超靈敏電化學(xué)傳感策略。在靶標(biāo)miRNA-21存在下，CP鏈、Strand-UP鏈與Strand-DOWN鏈在金電極表面可自發(fā)形成H型核酸復(fù)合結(jié)構(gòu)，通過鐵氰根離子（［Fe（CN）6］3-）調(diào)控［Ru（NH3）6］3+/2+氧化還原循環(huán)，產(chǎn)生電化學(xué)-化學(xué)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，產(chǎn)生高效催化電流，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-21的超靈敏檢測(cè)，最低檢出限為12．8 amol/L，并能有效區(qū)分其他microRNA以及單堿基錯(cuò)配核酸序列。方法成功用于多種細(xì)胞中miRNA-21的定量檢測(cè)。該傳感器具有靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬等特點(diǎn)，優(yōu)于目前報(bào)道的PCR擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、鏈置換反應(yīng)等分析策略，為microRNA相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床疾病診斷提供了一種新的技術(shù)手段。