梁梓洋，梁梓豪，馬葉芬，羅輝泰，黃 芳，吳惠勤

（廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平穩(wěn)步提高，對(duì)化妝品的要求也隨之不斷提高?！吨腥A人民共和國國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展第十四個(gè)五年規(guī)劃和2035年遠(yuǎn)景目標(biāo)綱要》明確指出，要開展中國品牌創(chuàng)建行動(dòng)，保護(hù)發(fā)展中華老字號(hào)，提升自主品牌影響力和競(jìng)爭(zhēng)力，率先在化妝品、服裝、家紡、電子產(chǎn)品等消費(fèi)品領(lǐng)域培育一批高端品牌［1］，這標(biāo)志著我國化妝品行業(yè)科技引領(lǐng)的高質(zhì)量發(fā)展時(shí)代已到來。在市場(chǎng)潮流的推動(dòng)下，綠色化及具有特定功效的化妝品日益受到青睞，許多化妝品以添加天然植物成分為亮點(diǎn)，植物提取物在化妝品中的應(yīng)用日趨廣泛［2］。植物提取物的引入不僅可為化妝品帶來獨(dú)特香味，其活性成分還具有滋養(yǎng)、修護(hù)、祛痘等特定功效［3］，因此植物提取物的正確應(yīng)用能為化妝品帶來更好的美容護(hù)膚效果［4］，具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于環(huán)境污染或種植過程中非法使用農(nóng)藥等問題［5-6］，在化妝品引入植物提取物原料時(shí)會(huì)帶來農(nóng)藥殘留的安全風(fēng)險(xiǎn)。

由農(nóng)藥殘留引起的化妝品安全問題已逐漸得到國內(nèi)外研究者的高度重視。早在2010年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局在《關(guān)于印發(fā)化妝品中可能存在的安全性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南的通知》中指出，使用植物來源原料的化妝品應(yīng)說明其農(nóng)藥殘留的情況。2013年，歐盟在化妝品法規(guī)EC1223/2009中明確指出艾氏劑、狄氏劑等農(nóng)藥屬于化妝品中的禁用組分［7］；我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》中明確規(guī)定多種農(nóng)藥成分為化妝品的禁用組分［8］。2020年，國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布了《含植物提取物類化妝品中55種禁用農(nóng)藥殘留量的測(cè)定》（GB/T 39665-2020），為植物源化妝品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了依據(jù)［9］。

目前，化妝品中農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法等［7，10-12］。GB/T 39665-2020中使用氣相色譜-質(zhì)譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，前者可測(cè)定35種禁用農(nóng)藥。然而植物源化妝品基質(zhì)比傳統(tǒng)化妝品更為復(fù)雜，使用氣相色譜-質(zhì)譜法的選擇離子掃描模式（SIM）也難以避免干擾。而串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）可對(duì)母離子進(jìn)行選擇性分離，利用其產(chǎn)生的子離子進(jìn)行檢測(cè)，可提高分辨能力并大大降低背景值，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）可在復(fù)雜基質(zhì)情況下獲得更好的選擇性和抗干擾能力［13-15］，從而提高分析的靈敏度，近年來被越來越多地用于多種基質(zhì)的禁用農(nóng)藥殘留檢測(cè)中［16-19］。例如《中國藥典（2020年版）》［20］中，規(guī)定使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)中藥材中33種禁用農(nóng)藥進(jìn)行測(cè)定。植物源化妝品的基質(zhì)復(fù)雜程度更高，但尚未見使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定其農(nóng)藥殘留的報(bào)道。本文選取GB/T 39665-2020和《中國藥典（2020年版）》中涉及的53種禁用農(nóng)藥，以水基型的精華液和非水基型的膏霜2種代表性樣品為研究對(duì)象優(yōu)化樣品前處理方法，建立了植物源化妝品中53種禁用農(nóng)藥殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單快速，方法靈敏度和選擇性高，重復(fù)性好，適用于化妝品中多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)、快速檢測(cè)，為保障化妝品質(zhì)量安全和促進(jìn)我國化妝品的高質(zhì)量發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（TRACE 1300-TSQ 9000，美國Thermo Fisher Scientific公司）；超聲波清洗器（東莞市超聲波設(shè)備有限公司）；電子天平（美國Sartorious公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）；QB-600型高速振蕩混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；氮吹濃縮儀（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司）；冷凍高速離心機(jī)（湘儀集團(tuán)）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（300 mg/3 mL，美國Agilent公司）；0．22 μm有機(jī)相濾膜（美國Agilent公司）。

1.2 材料與試劑

53種農(nóng)藥對(duì)照品（壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯（色譜純，德國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液與工作溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取適量待測(cè)農(nóng)藥對(duì)照品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)，根據(jù)需求用乙腈稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 空白樣品基質(zhì)溶液與基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制稱取經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)待測(cè)物的空白樣品0．5 g，按照樣品前處理方法制得空白樣品基質(zhì)溶液。經(jīng)氮?dú)鉂饪s后，加入不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后定容，得到基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

液體樣品（精華液、化妝水及原液等）：稱取試樣0．5 g（精確至0．000 1 g）于15 mL離心管中，加入3 mL飽和氯化鈉溶液稀釋并混勻，隨后加入5 mL乙腈，渦旋混合30 s后以1 120次/min的頻率振蕩提取10 min，以10 000 r/min離心3 min。取上清液于另一15 mL離心管中，剩余部分用5 mL乙腈再提取1次，合并兩次提取液，于35℃水浴下氮吹濃縮至約3 mL。濃縮后的提取液過EMR固相萃取柱凈化。收集洗脫液于35℃水浴下氮吹至約0．3 mL，用乙腈定容至0．5 mL，經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾后待測(cè)定。

膏霜和乳液樣品（面霜、精華霜及護(hù)發(fā)乳等）：稱取試樣0．5 g（精確至0．000 1 g）于15 mL離心管中，加入3 mL飽和氯化鈉溶液后渦旋混合1 min，超聲處理5 min使樣品充分分散。加入5 mL乙腈于上述離心管中，渦旋混合30 s后以1 120次/min的頻率振蕩提取10 min，以10 000 r/min離心3 min。取上清液于另一15 mL離心管中，剩余部分用5 mL乙腈再提取1次，合并兩次提取液，于35℃水浴下氮吹濃縮至約3 mL。置于-24℃下冷凍20 min，于4℃下以10 000 r/min離心2 min，上清液過EMR固相萃取柱凈化。收集洗脫液于35℃水浴下氮吹至約0．3 mL，用乙腈定容至0．5 mL，經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾后待測(cè)定。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：Agilent VF-17ms毛細(xì)管柱（30 m×0．25 mm×0．25 μm）；色譜柱升溫程序：70℃保持2 min，以25℃/min升至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升至280℃保持10 min；載氣：氦氣（純度≥99．999%）；載氣流速：1．0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：260℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力為150 kPa，0．75 min后打開分流閥和隔墊吹掃。

1.5.2 質(zhì)譜條件電子轟擊電離源（70 eV）；離子源溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃；碰撞氣：氬氣；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式，時(shí)間窗口為保留時(shí)間±1．0 min。53種農(nóng)藥的定性定量離子對(duì)、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 53種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 53 pesticides

（續(xù)表1）

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇分別考察了弱極性的DB-5MS（30 m×0．25 mm×0．25 μm）和中等極性的VF-17ms（30 m×0．25 mm×0．25 μm）兩種色譜柱的分離效果。實(shí)驗(yàn)表明，兩種色譜柱均能使53種農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)基線分離，對(duì)于互為異構(gòu)體的農(nóng)藥，如β-六六六/γ-六六六和p，p＇-滴滴滴/o，p＇-滴滴滴，在VF-17ms色譜柱上能夠取得更滿意的分離度。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇VF-17ms柱作為色譜柱。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化使用目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，對(duì)53種農(nóng)藥進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，在各化合物的一級(jí)質(zhì)譜中選取豐度較高的分子離子峰或質(zhì)荷比較大的基峰作為母離子，對(duì)各化合物的母離子施加一定的碰撞能量獲得其二級(jí)質(zhì)譜，選取豐度較高且質(zhì)荷比較大的碎片離子作為子離子。通過優(yōu)化碰撞能量使53種農(nóng)藥的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大值，從而確定各化合物最優(yōu)的質(zhì)譜參數(shù)，如“1．5．2”所示。53種農(nóng)藥在優(yōu)化條件下的SRM總離子流圖見圖1。

圖1 53種農(nóng)藥在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描下的總離子流圖Fig．1 Total ion chromatograms of 53 pesticides using SRM mode peak numbers 1 to 53 are corresponding with the compounds shown in Table 1

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇由于化妝品基質(zhì)較復(fù)雜，不同種類的農(nóng)藥性質(zhì)也存在差異，提取效率易受到基質(zhì)的影響，因此需選擇提取效率高且對(duì)基質(zhì)提取較少的溶劑作為提取溶劑。常見的提取溶劑主要有乙腈、丙酮和乙酸乙酯等［21］。本文以精華液和膏霜樣品為研究對(duì)象，考察了乙腈、丙酮和乙酸乙酯對(duì)目標(biāo)物的提取效率（見表2）。對(duì)于部分膏霜樣品，需先加入飽和氯化鈉溶液進(jìn)行破乳和分散，提高提取溶劑的提取效率；對(duì)于精華液樣品，加入飽和食鹽水可降低樣品的黏度，同時(shí)可使有機(jī)相與水相更好地分層。結(jié)果表明，3種提取溶劑均能從精華液和膏霜兩種基質(zhì)中提取53種目標(biāo)農(nóng)藥，但由于丙酮與乙酸乙酯的極性相對(duì)較小，在提取目標(biāo)化合物的同時(shí)也提取了膏霜樣品中的大量油脂，會(huì)對(duì)進(jìn)樣口和色譜柱造成污染［22］。而乙腈的極性適中，且能夠與飽和氯化鈉溶液較好地分層，對(duì)53種目標(biāo)化合物的提取效率也較高，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

表2 不同溶劑對(duì)53種農(nóng)藥的提取效率Table 2 Extraction efficiencies of 53 pesticides with different solvents

2.2.2 提取方式的選擇比較了渦旋提取和振蕩提取兩種方式的提取效果。結(jié)果表明，以乙腈作為提取溶劑，采用渦旋提取時(shí)，53種農(nóng)藥在精華液和膏霜樣品中的平均回收率分別為82．3%~104%和62．8%~102%；當(dāng)采用振蕩提取時(shí)，53種農(nóng)藥在精華液和膏霜樣品中的平均回收率分別為83．1%~102%和79．0%~108%，可見振蕩提取的效果較好。由于精華液和膏霜樣品具有一定的黏度，即使加入飽和氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋，其黏度仍較大，導(dǎo)致提取溶劑與樣品難以充分接觸。相比之下，利用振蕩提取可使兩相充分接觸，獲得相對(duì)較好的提取效率。綜合考慮，選擇乙腈振蕩提取作為提取方式。

2.3 樣品凈化方式的選擇

由于膏霜樣品中含有大量油脂，即使選擇極性較大的乙腈作為提取溶劑，也不可避免地共提取出一部分油脂，而過多的油脂會(huì)使固相萃取柱的填料飽和，影響提取液的凈化效果，并對(duì)進(jìn)樣口和色譜柱造成污染。由于油脂在低溫條件下易從乙腈中析出［23］，因此選擇在-24℃下冷凍處理20 min，以去除乙腈提取液中的油脂。為考察冷凍除脂對(duì)53種農(nóng)藥回收率的影響，比較了冷凍處理前后的平均回收率。結(jié)果表明，膏霜樣品經(jīng)冷凍處理前、后的回收率分別為58．5%~118%和70．9%~113%，說明冷凍處理能夠去除部分油脂而起到凈化作用。同時(shí)比較了精華液樣品在冷凍處理前后回收率的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理前、后的回收率相差甚微，因此對(duì)于精華液樣品可省略該步驟。

盡管冷凍除脂可起到一定的凈化效果，但乙腈提取液中仍含有一定量的油脂，而EMR-Lipid固相萃取柱可以選擇性地從高油脂含量樣品中保留脂質(zhì)［24-25］，將油脂從提取液中分離，從而達(dá)到凈化效果。為進(jìn)一步消除油脂對(duì)后續(xù)測(cè)定的影響，選擇該固相萃取柱進(jìn)行凈化。膏霜樣品的乙腈提取液經(jīng)冷凍除脂后，以EMR-Lipid柱進(jìn)行凈化前、后53種農(nóng)藥的平均回收率分別為68．7%~114%和76．6%~104%，說明EMR-Lipid柱能夠減弱基質(zhì)的影響。此外，考察了EMR-Lipid固相萃取柱對(duì)精華液樣品乙腈提取液的凈化效果，處理前、后53種農(nóng)藥的平均回收率分別為76．0%~94．3%和82．8%~101%，表明EMR-Lipid柱起到了一定的凈化效果。綜上，選擇冷凍除脂結(jié)合EMR-Lipid固相萃取柱作為樣品凈化方式。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

質(zhì)譜分析中存在的基質(zhì)效應(yīng)（ME）會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果造成較大影響。分別以精華液和膏霜基質(zhì)為對(duì)象，考察53種農(nóng)藥在這兩類樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。選取經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)待測(cè)物的空白樣品，將經(jīng)提取和凈化后配制的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液與使用乙腈配制的相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)按照“1．5”條件進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：ME（%）=100%×（A-B）/B［7］。式中，A和B分別為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME＞0時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)。

53種農(nóng)藥的響應(yīng)值在基質(zhì)溶液中均有不同程度的增大，在精華液樣品中的平均ME值為21．4%~130%，在膏霜樣品中的平均ME值為25．5%~148%，均表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物的影響，樣品采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

采用基質(zhì)匹配的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，按照“1．5”條件對(duì)系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以各化合物的定量離子對(duì)峰面積（y）對(duì)各自的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸分析，得到各組分的回歸方程與相關(guān)系數(shù)。并在空白樣品中添加一定濃度的53種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定結(jié)果以3倍信噪比為檢出限（LOD），10倍信噪比為定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，53種農(nóng)藥在兩種化妝品基質(zhì)中具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0．996 1~0．999 9，LOD為0．01~0．02 mg/kg，LOQ為0．02~0．05 mg/kg（見表3）。

表3 53種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 53 pesticides

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以精華液（水基樣品）和膏霜（非水基樣品）兩種化妝品作為代表性基質(zhì)，選取經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)待測(cè)物的空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。在0．05 mg/kg加標(biāo)水平下進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算53種農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表4可知，53種農(nóng)藥在精華液樣品中的平均回收率為84．5%~102%，RSD為1．1%~4．9%；在膏霜樣品中的平均回收率為77．1%~105%，RSD為0．50%~4．0%，能夠達(dá)到GB/T 39665-2020的要求，滿足實(shí)際檢測(cè)需要。

表4 精華液與膏霜樣品中53種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and relative standard deviations of 53 pesticides in essence and cream sample

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

使用本方法對(duì)30個(gè)植物源化妝品進(jìn)行檢測(cè)，檢出2個(gè)陽性樣品，在1個(gè)含人參提取物的膏霜樣品和另1個(gè)含金銀花提取物的液體樣品中，分別檢出0．06 mg/kg的六氯苯和0．04 mg/kg的氟蟲腈，陽性樣品的總離子流圖如圖2所示。盡管在化妝品中由植物提取物所引入的農(nóng)藥殘留量一般較低，但由于大部分化妝品屬于日常使用的生活必需品，而在長期低劑量暴露于包括六氯苯在內(nèi)的有機(jī)氯農(nóng)藥及有機(jī)磷農(nóng)藥情況下，會(huì)帶來生殖毒性及神經(jīng)毒性等潛在安全風(fēng)險(xiǎn)［26-28］，因此化妝品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)重視植物提取物原料中農(nóng)藥殘留的控制。

圖2 檢出六氯苯（A）和氟蟲腈（B）的陽性樣品的總離子流圖Fig．2 Total ion chromatograms of hexachlorobenzene（A）and fipronil（B）in positive samples

3 結(jié)論

本研究采用乙腈提取，經(jīng)過冷凍除脂-EMR固相萃取凈化，結(jié)合高靈敏度的GC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了植物源化妝品中53種常見農(nóng)藥的快速定性定量分析。該方法具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，前處理簡(jiǎn)便快速，能夠滿足實(shí)際檢測(cè)的要求，為植物源化妝品的質(zhì)量控制提供了技術(shù)支撐。利用本方法在采集的30個(gè)植物源化妝品中檢出2個(gè)陽性樣品，提示該類化妝品中農(nóng)藥殘留的問題不容忽視，生產(chǎn)企業(yè)與政府相關(guān)部門應(yīng)對(duì)該問題予以更高的重視，以促進(jìn)我國化妝品行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。