李瑞琪 畢浩然 姜恭好 段海燕

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性高和廣適性強(qiáng)的水稻品種是現(xiàn)在水稻育種工作的重要目標(biāo)[1]?？沼?31是黑龍江省的主要水稻栽培品種，其生育期較短，具有結(jié)實(shí)率高、耐冷害能力強(qiáng)、田間抗性強(qiáng)、出米率高和米質(zhì)優(yōu)等諸多優(yōu)良性狀[2]。對(duì)該品種進(jìn)行持續(xù)的遺傳改良，補(bǔ)足品種短板，繼續(xù)發(fā)揮品種的優(yōu)異環(huán)境適應(yīng)性，對(duì)黑龍江省的水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

稻瘟病是一種水稻真菌性病害，每年都會(huì)造成嚴(yán)重的糧食產(chǎn)量損失[3]。近年來(lái)，由于稻瘟病生理小種的變化，空育131在黑龍江省的稻瘟病抗性嚴(yán)重退化，在生產(chǎn)上表現(xiàn)為抗性差和抗譜窄。經(jīng)過(guò)鑒定，空育131本身攜帶Pik和Pia稻瘟病抗性基因[4]，但不能滿足黑龍江省當(dāng)前稻瘟病抗性育種的需要，迫切需要引入新的具有廣譜抗性的基因。另外，由于空育131的稻米不具有香味，與當(dāng)下對(duì)香米市場(chǎng)的需求不相適應(yīng)，也有必要通過(guò)分子育種的手段對(duì)這2個(gè)性狀加以改良。

Pi1是位于第11號(hào)染色體上的來(lái)源于利比亞粳型品種LAC23的廣譜稻瘟病抗性基因[5]。Pi2是位于第6號(hào)染色體上的來(lái)源于秈稻品種5173的高抗稻瘟病基因[6]。Pi9同樣是位于第6號(hào)染色體上的來(lái)源于小粒野生稻（Oryza minuta）的抗稻瘟病基因[7]，它對(duì)來(lái)自13個(gè)國(guó)家的43個(gè)稻瘟病菌株都表現(xiàn)出了很高的抗性[8]。Pi2和Pi9都被認(rèn)為在水稻抗稻瘟病實(shí)踐中具有較高的利用價(jià)值。位于水稻第8號(hào)染色體上的Osbadh2（LOC＿Os08g32870）是一個(gè)重要的香味調(diào)控基因[9]。Osbadh2基因不同部位的缺失或插入會(huì)導(dǎo)致該基因功能喪失，分泌出香味物質(zhì)2-乙?；?吡咯啉（2AP），使稻米產(chǎn)生香味[10]，fgr是編碼甜菜醛脫氫酶（OsBADH2）的Osbadh2基因的隱性突變等位基因，導(dǎo)入該基因可以使稻米產(chǎn)生濃郁的香味品質(zhì)[11-12]。

本研究采用基因聚合育種的方法，利用以上4個(gè)（Pi1、Pi2、Pi9和fgr）基因?qū)沼?31的香味品質(zhì)和稻瘟病抗性2個(gè)性狀進(jìn)行遺傳改良，為培育食味品質(zhì)和抗病能力都有所加強(qiáng)的新空育131提供材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)將來(lái)源于4個(gè)供體的1個(gè)香味基因和3個(gè)抗稻瘟病基因，即DHX2（fgr）和HLJ2（Pi1）、HLJ7（Pi2）、HLJ16（Pi9）分別導(dǎo)入空育131中，再將香味基因改良系KY（fgr）與稻瘟病抗性基因改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）分別雜交，其雜交組合為Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr。以野生型空育131（KY131）作對(duì)照，對(duì)雜交F2和F3代通過(guò)分子標(biāo)記PCR進(jìn)行基因型篩選鑒定。fgr所用引物為BadF4和BadR4；Pi1所用引物為RM27322-F和RM27322-R；Pi2所用引物為L(zhǎng)11-F和L11-R；Pi9所用引物為L(zhǎng)7-F和L7-R。引物序列均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何予卿老師提供。并對(duì)篩選出的F3代株系進(jìn)行香味特征與稻瘟病抗性驗(yàn)證。

利用RCIE6K芯片（中國(guó)種子集團(tuán)有限公司）對(duì)所獲得的遺傳材料進(jìn)行背景分析。RICE6K芯片是基于全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP）陣列原理，根據(jù)520份世界微核心水稻種質(zhì)資源測(cè)序的結(jié)果，總共包含獲得5636個(gè)SNP標(biāo)記（包含少量的InDel插入/缺失標(biāo)記），經(jīng)過(guò)合成和測(cè)試，最終有4473個(gè)高質(zhì)量標(biāo)記具有良好的基因分型效果[13]。主要操作步驟包括DNA提取和PCR特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的片段化、芯片雜交、單堿基延伸、染色和掃描（由中國(guó)種子集團(tuán)有限公司完成）。農(nóng)藝性狀調(diào)查，包括分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、單穗粒數(shù)、單株粒重、千粒重和結(jié)實(shí)率。

采用混合蒸煮法驗(yàn)證香味基因改良系KY（fgr）的香味品質(zhì)，將以上3種株系與野生型空育131的稻米進(jìn)行不同比例的混合，蒸煮之后品嘗混合稻米的香味等級(jí)。采用苗期混合接種稻瘟病孢子的方法檢驗(yàn)雙基因聚合株系對(duì)稻瘟病的抗性，用來(lái)自中國(guó)種子集團(tuán)有限公司的稻瘟菌菌株分別接種Pi1+fgr、Pi2+fgr、Pi9+fgr以及感病對(duì)照KY131，觀察并記錄對(duì)稻瘟病的抗性等級(jí)。稻瘟病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照國(guó)際水稻研究所制定的稻瘟病抗性評(píng)價(jià)葉瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14]，共分為9級(jí)，從0級(jí)到9級(jí)病情逐漸加重。0級(jí)無(wú)病害癥狀；3級(jí)是葉片上出現(xiàn)小而圓以至稍長(zhǎng)的褐色壞死灰斑，直徑1～2mm；4級(jí)是葉片上出現(xiàn)典型的稻瘟病斑或橢圓型病斑，長(zhǎng)1～2cm，常限于2條葉脈間，病斑面積不足葉面積的2%；對(duì)照KY131為6級(jí)，表現(xiàn)為葉片上有典型的稻瘟病病斑，受害面積為10%～25%。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙基因聚合F2代基因型鑒定

F2代中每組選取200個(gè)單株，通過(guò)分子標(biāo)記PCR最終篩選出21株雙基因聚合的純合單株。其中，KY（Pi1+fgr）植株6株，KY（Pi2+fgr）7株，KY（Pi9+fgr）8株，具體結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 雙基因聚合F2代篩選結(jié)果Table 1 Identification pyramided genes of F2generation of double genes polymerization plants

圖1 雙基因聚合F2代PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The PCR identificationto of F2generation of double-gene polymerization individuals

2.2 雙基因聚合F3代香味基因驗(yàn)證

由基因F2代篩選結(jié)果（表2）表明，具有香味基因fgr的KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的改良系空育131已經(jīng)具有了香味品質(zhì)。隨著香味基因改良系KY（fgr）所占比例的增加，混合稻米的香味等級(jí)也不斷提升。

表2 雙基因聚合植株F3代香味品質(zhì)鑒定Table 2 Aroma quality appraisal of F3generation of double genes polymerization plants

2.3 雙基因聚合F3代稻瘟病抗性驗(yàn)證

由表3可得，改良系KY（Pi1）、KY（Pi2）和KY（Pi9）均提高了水稻葉瘟的抗性等級(jí)，其中對(duì)水稻葉瘟的抗性有明顯提升作用的改良系是KY（Pi1）和KY（Pi2），相對(duì)于CK（KY131）均提升了3級(jí)；KY（Pi9）對(duì)稻瘟病的抗性提升了2級(jí)，改良系KY（Pi9）對(duì)水稻稻瘟病抗性的改良稍遜于KY（Pi1）和KY（Pi2）。

表3 雙基因聚合植株F3代稻瘟病抗性鑒定Table 3 Rice blast resistance identification of F3 generation of double genes polymerization plants

2.4 雙基因聚合的F3代基因芯片分析

由圖2可知，3種組合中大面積為透明區(qū)域，在第8號(hào)染色體上均有紅色區(qū)域，表明KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）在第8號(hào)染色體上與KY131存在純合差異位點(diǎn)，即香味基因fgr所在位點(diǎn)與KY131存在多態(tài)性。在KY（Pi1+fgr）組合中，第11號(hào)染色體上存在紅色區(qū)域，表明該組合中第11號(hào)染色體上與KY131存在差異位點(diǎn)，即稻瘟病抗性基因Pi1所在位點(diǎn)與KY131存在差異；在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）組合中第6號(hào)染色體上存在紅色區(qū)域，表明在KY（Pi2+fgr）和KY（Pi9+fgr）的組合中，在第6號(hào)染色體上與KY131存在純合差異位點(diǎn)，即Pi2和Pi9所在的位點(diǎn)與KY131存在多態(tài)性。

圖2 雙基因聚合單株基因芯片分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of gene chip in double gene polymerization individuals

綜上可得，KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）、KY（Pi9+fgr）與KY131之間除目標(biāo)基因外，只有部分基因位點(diǎn)與KY131存在多態(tài)性，其余基因位點(diǎn)都與KY131保持高度一致，實(shí)現(xiàn)了香味性狀與稻瘟病抗性的精準(zhǔn)改良。

2.5 雙基因聚合的F3代農(nóng)藝性狀調(diào)查

由基因芯片分析結(jié)果可知，目標(biāo)基因Pi1、Pi2、Pi9和fgr已成功聚合于KY131中，且Pi2、Pi9和fgr為純合聚合。親本材料為KY（Pi1）導(dǎo)入系、KY（Pi2）導(dǎo)入系、KY（Pi9）導(dǎo)入系和KY（fgr）導(dǎo)入系，除目標(biāo)區(qū)段外，其余背景與野生型KY131一致，在F2代篩選出的雙基因純合株系在F3代仍是雙基因純合的情況，遺傳穩(wěn)定。對(duì)雙基因聚合KY（Pi1+fgr）、KY（Pi2+fgr）和 KY（Pi9+fgr）株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果（表4和圖3）表明，雙基因聚合株系與KY131的各個(gè)農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明改良型植株僅僅改變了目標(biāo)性狀，其他性狀并未發(fā)生改變，雙基因聚合型KY131依然保留了野生型KY131自身的優(yōu)良性狀。

表4 雙基因聚合植株F3代農(nóng)藝性狀調(diào)查Table 4 Investigation of agronomic traits of F3generation in double-gene polymerization plants

圖3 雙基因聚合植株F3代農(nóng)藝性狀Fig.3 Agronomic traits of F3generation of double genes polymerization plants

3 討論

隨著種植環(huán)境和年份的變化，稻瘟病病菌很容易發(fā)生變異，連續(xù)多年種植單一抗性品種會(huì)導(dǎo)致抗性逐漸減退，甚至可能喪失[15]。近些年，水稻品種的稻瘟病抗性越發(fā)引起人們關(guān)注，已經(jīng)成為品種審定的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[15]。KY131本身攜帶Pik和Pia基因，2003年之前在黑龍江省是比較抗病的品種。但目前，KY131在黑龍江省對(duì)稻瘟病抗譜窄、抗性差。本研究中與稻瘟病抗性相關(guān)的3個(gè)基因均具有廣譜抗性。導(dǎo)入上述3個(gè)基因的KY131的稻瘟病抗性分別提高了2～3級(jí)，其中Pi9提高了2級(jí)，Pi1和Pi2提高了3級(jí)。因此在水稻抗病育種中優(yōu)先選擇Pi1和Pi2基因效果更佳。

香味性狀是稻米品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，香稻育種成為現(xiàn)代水稻育種的重要方向之一[16]。本研究中選擇的水稻香味基因fgr來(lái)源于稻花香2號(hào)，結(jié)果表明，導(dǎo)入KY（fgr）香味基因的材料品質(zhì)也得到了提升。因此在水稻品質(zhì)改良中fgr基因可以有效地改善香味品質(zhì)，更好地提高稻米品質(zhì)。

基因聚合是將分子標(biāo)記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種方式相結(jié)合的育種方式，利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)改良型目標(biāo)群體進(jìn)行基因型鑒定，可以精準(zhǔn)地選擇目標(biāo)基因，聚合多個(gè)目標(biāo)基因，極大地縮短育種年限，提高育種效率，已成為目前育種工作中重要的方法[11,17]。本研究以水稻品種KY131為受體，用基因聚合的方法將抗病基因和香味基因聚合于KY131中，改良其抗稻瘟病抗性及香味特征，以達(dá)到延長(zhǎng)優(yōu)良品種的利用年限，使其更加適應(yīng)市場(chǎng)的需要。結(jié)果表明，基因聚合后的KY131的稻米具有香味，稻瘟病抗性也有效提高，農(nóng)藝性狀無(wú)明顯變化?；蚓酆虾蟮腒Y131具有寒區(qū)水稻種植資源推廣應(yīng)用的可能性，可為選育、改良品質(zhì)和抗病效果更好的抗稻瘟病香稻品種提供資源信息和親本材料。

4 結(jié)論

將KY（fgr）分別與KY（Pi1）、KY（Pi2）、KY（Pi9）雜交，雜交親本均是KY131的改良系，遺傳背景相似度極高，避免了雜交過(guò)程中的連鎖累贅，增加了聚合育種的效率和遺傳背景的純凈度。將香味基因與稻瘟病抗性基因聚合于KY131中，得到了3種香味基因和抗病基因聚合的純合植株，基因型分別為Pi1+fgr、Pi2+fgr和Pi9+fgr，在改良系的后代植株中，香味品質(zhì)得到了大幅提升，對(duì)稻瘟病的抗性提高了2～3級(jí)，成功選育出了香型抗病的雙基因聚合改良系KY131，對(duì)水稻高品質(zhì)抗病育種具有重要的實(shí)踐意義。