劉文平，梁烜赫，張春宵，李淑芳，曹鐵華*，李曉輝*

（1．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，吉林 公主嶺 136100；2．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，吉林 長春 130033；3．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所，吉林 公主嶺 136100）

氮素是植物生長發(fā)育必需的大量元素之一，是氨基酸、核酸和葉綠素等不可缺少的組成成分。土壤中的氮含量會嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，氮含量低時，植株的根不斷伸長，側(cè)根數(shù)量增多，生長變慢、分枝和分蘗都變少［1-2］。土壤中的氮素會被細(xì)菌硝化成硝酸鹽，所以土壤中通常存在大量的硝酸鹽，是植物獲取氮素的主要來源。由于植物不能像動物一樣自由移動，為了適應(yīng)不同的氮素環(huán)境條件，進(jìn)化出了復(fù)雜巧妙的調(diào)控機(jī)制去適應(yīng)時刻變化的外界環(huán)境。植物從土壤中吸收硝酸鹽是一個復(fù)雜的生物過程，包括硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和同化等［3-4］。經(jīng)過長期的進(jìn)化過程，硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因是一個多基因的基因家族，這些基因在植株不同部位特異表達(dá)，基因功能也各不相同，并且存在一因多效的基因。在整個生物過程中，需要不同的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植株的不同部位各司其職并共同調(diào)控作用才能完成。植物通過根系細(xì)胞膜上的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收硝酸鹽，然后從根部細(xì)胞向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，經(jīng)過木質(zhì)部和韌皮部的裝載及卸載，最后轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片細(xì)胞，被同化或者被儲存在液泡中［5-6］。

提高作物的產(chǎn)量主要是通過增施氮肥，但是大量施用氮肥不僅會造成能源的浪費(fèi)和生產(chǎn)成本的增加，還會加劇土壤酸化和水體的富營養(yǎng)化。為了提高氮肥利用效率，闡明植物如何從土壤中獲取氮素的分子機(jī)理是植物營養(yǎng)與肥料學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。近年來，前人從植物的根、莖、葉等部位和從細(xì)胞水平到分子水平對植物氮素吸收利用進(jìn)行了深入研究，全面闡述植物是如何從外界環(huán)境中吸收氮素，轉(zhuǎn)運(yùn)到植株的不同部位，并進(jìn)行同化利用［7］。本文綜述了植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的研究進(jìn)展，以期利用基因編輯技術(shù)對NRT關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，提高NRT蛋白對硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配的效率，提高植株對氮素的利用效率，培育氮高效利用的作物品種，以減少氮肥的投入，從而實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排的作物可持續(xù)生產(chǎn)。

1 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因

硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植物中對硝酸鹽的吸收利用具有至關(guān)重要的作用。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族成員十分復(fù)雜，在功能上也不相同，它們的組織特異表達(dá)部位各不相同［1，8］。已被鑒定的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因成員主要分為4大類：NRT1（Nitrate transporter1/peptide family）、NRT2、CLC（Chloride channel）和SLAC/SLAH（Slow anion channel-associated homologues）［9］。為了高效地從土壤中吸收硝酸鹽，植物進(jìn)化出不同功能的NRT基因，這些基因的功能從控制根系發(fā)育、地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽，到氮素的儲存和再分配等，從而形成了復(fù)雜的氮素吸收信號通路。在環(huán)境中硝酸鹽濃度低時，植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽主要是硝酸鹽高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在發(fā)揮作用；反之，在環(huán)境中的硝酸鹽濃度高時，植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽的系統(tǒng)是低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在已鑒定NRT1基因成員中主要包括NRT1.1和NRT1.2基因；NRT1.1基因是個例外，它是硝酸鹽雙親和基因［10-11］。這些不同的NRT基因在氮吸收信號通路中發(fā)揮不同的作用，并且也影響植物的性狀。

1.1 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽吸收中的作用

氮素來源于土壤，在整個生育期植物如何從土壤環(huán)境中吸取氮源是至關(guān)重要的第一步。植物硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)信號通路中，被鑒定的第一個硝酸鹽雙親和基因是NRT1.1（CHL1/NPR6.3），它是植物根系細(xì)胞中硝酸鹽的受體，能開關(guān)硝酸鹽信號途徑中其他基因的表達(dá)［12］。在氮素充足的條件下，與對照植株相比，擬南芥nrt1.1突變體的硝酸鹽含量下降了45%［13］；在0.2 mmol/L硝酸鹽條件下，擬南芥nrt2.1/2.2雙突變體植株的硝酸鹽吸收率下降了50%；而nrt1.1/2.1/2.2三突變體植株則比雙突變體植株的硝酸鹽吸收率下降更多，達(dá)到38%，并且三突植株比二突植株生長遲緩。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRT1.1是植株在低氮素生長條件下吸收硝酸鹽必不可少的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［12］。NRT1.1在硝酸鹽低親和與高親和模式的轉(zhuǎn)換依賴于外界環(huán)境中硝酸鹽的濃度，在蛋白的第101位點(diǎn)蘇氨酸磷酸化和去磷酸化影響著該蛋白的功能。磷酸化會改變NRT1.1的二聚化以及構(gòu)象，這個位點(diǎn)是開閉AtNRT1.1蛋白硝酸鹽高親和與低親和模式轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵氨基酸。在外界環(huán)境氮素充足的條件下，這個位點(diǎn)不被磷酸化，采取硝酸鹽低親和模式吸收硝酸鹽；當(dāng)外界的硝酸鹽濃度變低時，AtNRT1.1蛋白該位點(diǎn)的蘇氨酸被磷酸化，采用硝酸鹽高親和模式吸收硝酸鹽［14-15］。

擬南芥NRT1.1既是硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是側(cè)根中生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；NRT1.1通過調(diào)控根系的生長素分布，從而控制側(cè)根的形成和生長［16-17］。在低氮素條件下，擬南芥nrt1.1突變體植株在側(cè)根積累了大量生長素；NRT1.1朝遠(yuǎn)離側(cè)根頂端方向轉(zhuǎn)運(yùn)生長素，導(dǎo)致側(cè)根頂端的生長素含量變低，側(cè)根的生長受到抑制［18-20］。擬南芥NRT1.2蛋白是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的表達(dá)與NRT1.1基因不同，是組成型表達(dá)，但也是在根系中表達(dá)。在氮素充足的培養(yǎng)條件下，與對照相比，nrt1.2突變體植株的硝酸鹽含量下降［21-23］。在水稻和玉米中，與擬南芥NRT1.1為同源基因，功能與擬南芥相似，都具有吸收硝酸鹽的功能。水稻OsNRT1.1B是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也在水稻的根系表達(dá)，控制植株從土壤中吸收硝酸鹽［1，24-25］。OsNRT1.1B蛋白還能轉(zhuǎn)運(yùn)硒元素，把硒元素從地下部向地上部運(yùn)輸，OsNRT1.1B基因過表達(dá)的水稻植株谷粒硒元素含量比對照高1.83倍［26］。玉米中與擬南芥AtNRT1.1蛋白序列相似度達(dá)到67%的2個基因分別是ZmNRT6.4和ZmNRT6.6，只有ZmNRT6.6基因的表達(dá)響應(yīng)硝酸鹽。ZmNPF6.6也是一個硝酸鹽雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ZmNPF6.6蛋白的第104位點(diǎn)蘇氨酸的改變，影響ZmNPF6.6的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性，這個位點(diǎn)對應(yīng)擬南芥NRT1.1的第101位點(diǎn)；而第362位點(diǎn)的組氨酸改變，會導(dǎo)致ZmNPF6.6基因失去吸收硝酸鹽的功能。在低氮水培條件下，ZmNPF6.6蛋白在氮吸收高效玉米雜交種中的表達(dá)量比氮吸收低效雜交種高，而且在處理48 h后，氮吸收高效玉米吸收的硝酸鹽含量超過了氮吸收低效玉米含量的50%～60%。ZmNPF6.6基因是否是玉米中感知硝酸鹽的受體目前尚未確定，是否如同擬南芥AtNRT1.1基因一樣調(diào)控側(cè)根的生長和其他NRTs基因的表達(dá)也尚未報(bào)道［27-29］。

NRT2基因成員的表達(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，該家族成員中主要有NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4和NRT2.5基因，在根系的硝酸鹽吸收中發(fā)揮作用［19，30-31］。在 低 氮 條 件 下，主 要 是NRT2.1和NRT2.2蛋白在硝酸鹽吸收中起重要的作用，它們的表達(dá)量會迅速增加；NRT2.4和NRT2.5蛋白則是在植物處于缺氮的條件下發(fā)揮功能，NRT2.4是在植株氮素極低時才發(fā)揮功能；NRT2.5是在植株處于長時間氮素缺乏時，其表達(dá)量才開始上升，成為氮高效吸收的主要基因［9，32-33］。通過細(xì)胞定位和免疫印跡發(fā)現(xiàn)，擬南芥NRT2.1基因在根的細(xì)胞壁表達(dá)［34］。與對照相比，擬南芥nrt2.1的突變體植株硝酸鹽吸收效率降低了75%，突變體的側(cè)根長度反而比對照長；在長期低氮條件下，突變體植株生長嚴(yán)重受到影響。NRT2.1蛋白既在低氮環(huán)境中吸收硝酸鹽，又協(xié)調(diào)了根系的發(fā)育［33，35-36］。擬南芥NRT2.2基因的表達(dá)也是受到硝酸鹽的誘導(dǎo)，但是表達(dá)量不高，主要在植物的根系部位表達(dá)；nrt2.2突變體植株的硝酸鹽含量也是比對照低，影響植物從外界環(huán)境中吸收硝酸鹽［37-38］。擬南芥AtNRT2.4基因的蛋白序列與NRT2.1和NRT2.2的蛋白序列具有很高的同源性。在缺氮條件下，AtNRT2.4基因在NRT2成員中的表達(dá)量是最高的；但是氮充足條件下，會抑制它的表達(dá)［39］。在長時間缺氮條件下，擬南芥AtNRT2.5基因的表達(dá)量迅速增加，它的表達(dá)量比NRT2.1和NRT2.2基因高。在nrt2.1突變體植株中過表達(dá)NRT2.5基因，過表達(dá)植株的硝酸鹽吸收量比對照顯著提高。在nrt2.5突變體植株中，硝酸鹽含量明顯比對照低，只達(dá)到對照的63%［40-41］。NRT2.5基因在不同的植物中表達(dá)部位略有不同。在擬南芥、玉米和小麥中都在根和葉中表達(dá)，在擬南芥和小麥的種子中也有表達(dá)，在玉米雌穗、穗軸和苞葉中也有表達(dá)。玉米ZmNRT2.5基因的表達(dá)量也受到低氮的誘導(dǎo)，主要是在植株的營養(yǎng)生長時期表達(dá)，在生殖生長時期的根中反而不表達(dá)，但是在苞葉中高表達(dá)，苞葉對籽粒灌漿期的氮素分布發(fā)揮著關(guān)鍵作用［32］。

目前，對NRT2基因的蛋白修飾研究報(bào)道不是很多。通過對NRT2.1的磷酸化研究發(fā)現(xiàn)，NRT2.1存在3個磷酸化位點(diǎn)，其中一個位點(diǎn)在其N端第28個絲氨酸，植株在低氮條件下該位點(diǎn)被磷酸化；反之，在補(bǔ)充了氮的培養(yǎng)條件下，該位點(diǎn)迅速去磷酸化，可能是通過該位點(diǎn)的去磷酸化調(diào)控NRT2.1在低氮和高氮條件下硝酸鹽的吸收活性。然而，第501位點(diǎn)蘇氨酸的磷酸化，只是影響了NRT2.1硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性［33，42-43］。通過爪蟾卵母細(xì)胞和酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NRT2.1和NAR2.1蛋白互作后，才能夠形成吸收硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。擬南芥NRT2.1基因的表達(dá)量在nar2.1突變體中仍然很高，但是在細(xì)胞膜上看不見NRT2.1；NAR2.1與NRT2.1互作激活了NRT2.1的功能，NAR2.1蛋白對于NRT2.1蛋白的穩(wěn)定具有極其重要的作用［42，44-47］。然而，在其他植物中也會有例外。水稻的OsNRT2.3b和OsNRT2.4蛋白不用與OsNAR2.1互作就能發(fā)揮吸收氮素的功能。OsNRT2.3b基因主要在韌皮部表達(dá)，它的功能是通過對pH值的變化來感知，從而開關(guān)硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性；其在水稻中過表達(dá)，能提高植株的pH緩沖能力和增加氮、鐵和磷的吸收，提高了植株40%的氮素利用效率［48-49］。

玉米ZmNRT2.1和ZmNRT2.2基因的蛋白序列相似性達(dá)到98%，它們在根中的表達(dá)受到硝酸鹽的誘導(dǎo)；ZmNRT2.1基因在根中特異表達(dá)，ZmNRT2.2基因則在皮層和側(cè)根的原基表達(dá)［50-51］。通過爪蟾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，ZmNRT2.1蛋白是硝酸鹽高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的功能是從外界環(huán)境吸收硝酸鹽，ZmNRT2.1也是需要和NAR2.1互作才能發(fā)揮作用［52-54］。玉米ZmNRT2.1基因在煙草中過表達(dá)，在高氮素條件下，轉(zhuǎn)基因煙草比對照的根系生長旺盛，而且生物量也比對照高，但轉(zhuǎn)基因煙草與對照植株的硝酸鹽含量沒有明顯的差異［55］。水稻OsNRT2.1基因在水稻中過表達(dá)能增強(qiáng)植株的根長，硝酸鹽含量比對照植株高24.3%［55-56］。

植物既有對硝酸鹽的吸收，也存在對硝酸鹽外排的現(xiàn)象，但是外排的生理機(jī)制尚不清楚［19］。在沒有外界脅迫壓力下，植物硝酸鹽外排量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于吸收量。在脅迫條件下，擬南芥NAXT1蛋白可能是通過對硝酸鹽的外排，從而能夠調(diào)控細(xì)胞的滲透壓［57］。植株生長在氮素充足的土壤中，根系會很發(fā)達(dá)，側(cè)根數(shù)量很多。植株在氮素含量變低的情況下，根系會迅速往土壤深層生長，促進(jìn)根的伸長去吸收深層土壤中的氮素。土壤環(huán)境中的氮素量對植物根系的生長存在調(diào)節(jié)，適量的氮素可刺激植株側(cè)根的生長。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的信號通路與控制根系的發(fā)育是如何相互交叉在一起的，還需要進(jìn)一步的研究［18，58-59］。

1.2 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽運(yùn)輸中的作用

植物從土壤環(huán)境中獲取到氮源，需要把氮源運(yùn)輸?shù)教囟ńM織，這離不開對硝酸鹽的運(yùn)輸。因此，植物對氮素的運(yùn)輸是制約氮素利用效率提高的重要環(huán)節(jié)之一。植株從外界環(huán)境吸收的硝酸鹽需要從根部運(yùn)輸?shù)街仓甑牟煌课?，維管束組織在植株地上部和地下部的物質(zhì)運(yùn)輸中具有舉足輕重的地位［60-61］。NRT1.5基因在根系的中柱鞘細(xì)胞表達(dá)，它的功能是將硝酸鹽從中柱細(xì)胞裝載入木質(zhì)部，負(fù)責(zé)把硝酸鹽從地下部向地上部運(yùn)輸。與對照相比，nrt1.5突變體在根系積累的硝酸鹽量比對照植株高。在硝酸鹽長距離運(yùn)輸途徑中，NRT1.5基因不是植物中唯一的硝酸鹽運(yùn)輸途徑，還存在其他NRT基因或別的基因控制硝酸鹽的運(yùn)輸［62-63］。盡管NRT1.5和NRT1.8基因在進(jìn)化關(guān)系上非常近，然而二者在根和莖部位的表達(dá)量卻恰恰相反，NRT1.5基因在根中的表達(dá)量比莖部位高，NRT1.8基因則正好相反，它們在硝酸鹽信號途徑中的功能也是相反的。NRT1.8基因還可以在木質(zhì)部的薄壁細(xì)胞中特異表達(dá)。硝酸鹽經(jīng)過長距離運(yùn)輸后，需要分配到不同的組織部位中進(jìn)行同化，NRT1.8基因的功能是卸載木質(zhì)部中的硝酸鹽［64］。然而，NRT1.5控制硝酸鹽從地下部組織向地上部組織運(yùn)輸，在根系需要大量硝酸鹽時，硝酸鹽也能把儲存在葉片中的硝酸鹽向地下部組織運(yùn)輸［11］。NRT1.9基因在植株根的韌皮部伴生細(xì)胞中特異表達(dá)，負(fù)責(zé)將硝酸鹽裝載入韌皮部向下運(yùn)輸。擬南芥nrt1.9突變體植株的地上部積累了大量的硝酸鹽，NRT1.9蛋白在硝酸鹽從地下部向地上部的運(yùn)輸過程中起到負(fù)調(diào)控作用，它可能是作為一個安全閥，調(diào)控地上部和地下部硝酸鹽含量的分配。如果增加植株地上部對硝酸鹽的同化能力和葉片對多余硝酸鹽儲存的能力，能否促使植物從土壤中吸收大量的硝酸鹽，特別是在籽粒形成時期，大量儲存的氮素被再利用，并通過代謝過程成為籽粒的成分？目前，關(guān)于植物根系如何將硝酸鹽從地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控水平研究報(bào)道不多［65］。

與擬南芥AtNRT1.8蛋白同源的水稻OsNPF7.2也是硝酸鹽低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它在根的厚壁組織、皮層和葉脈中表達(dá)。它的功能可能與擬南芥的基因功能相似，負(fù)責(zé)硝酸鹽的裝載和卸載［51，66］。水稻OsNPF2.4是一個在根系部位表達(dá)的硝酸鹽雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在硝酸鹽吸收中起到重要的作用，也控制硝酸鹽的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)和再分配；與對照相比，水稻osnrt2.4突變體植株的側(cè)根數(shù)量會減少、長度也會變短，硝酸鹽吸收量也會減少，表型和功能與擬南芥NRT1.1基因相似［67-68］。水稻OsNRT2.3a是擬南芥AtNRT2.5的同源基因，OsNRT2.3a蛋白需要和OsNAR2.1互作才能調(diào)控對硝酸鹽的吸收，也控制硝酸鹽從地下部向地上部的運(yùn)輸；在水稻中過表達(dá)OsNRT2.3a基因，不僅能增強(qiáng)大田中水稻在高氮素或者低氮素條件下對硝酸鹽吸收的能力，還能提高水稻的產(chǎn)量和氮素利用效率［32，69］。

1.3 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在硝酸鹽儲存中的作用

植物在不同生長階段對氮素的需求量不同，硝酸鹽的吸收和同化存在一個動態(tài)調(diào)節(jié)。在長期的進(jìn)化過程中，植物建立了體內(nèi)多余硝酸鹽的儲存機(jī)制，存儲的硝酸鹽則可作為后期大量需求氮素的主要來源之一。植物吸收的硝酸鹽在被同化利用后，大約99%剩余的硝酸鹽被儲存在葉片的液泡中。擬南芥AtNRT1.4基因在葉片的葉柄部位和主脈處特異表達(dá)，不受硝酸鹽的誘導(dǎo)；在葉柄和葉片主脈處的硝酸鹽含量很高，且硝酸鹽還原酶活性低。nrt1.4突變體植株的葉柄和葉片主脈處的硝酸鹽含量只有對照的45%～50%。NRT1.4基因也影響了葉片的生長，突變體比對照植株的葉片寬；葉片負(fù)責(zé)硝酸鹽儲存的基因不止一個，但只有AtNRT1.4基因已被鑒定［70］。可能是因?yàn)镹RT基因數(shù)量太多，同一個基因在不同的部位發(fā)揮的作用會有所不同，且同一功能又同時存在多個NRT基因發(fā)揮同樣的作用，這使控制硝酸鹽儲存的基因鑒定及其困難。

1.4 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在籽粒中的作用

植物在營養(yǎng)生長階段體內(nèi)儲存了大量的硝酸鹽，這些硝酸鹽是植株后期生殖生長需要的氮源。這部分氮素的再利用是提高氮素利用效率和提高產(chǎn)量至關(guān)重要的一步。在籽粒形成過程中，特別是小麥和玉米葉片中氮素被再利用占據(jù)了籽粒中氮素的50%～90%［71］。擬南芥AtNRT1.7基因在葉片的葉脈韌皮部特異表達(dá)，它的功能是負(fù)責(zé)將老葉片中的硝酸鹽裝載入韌皮部，并運(yùn)輸?shù)叫律~片中，調(diào)控氮素從源到庫的再利用。擬南芥AtNRT1.6基因在生殖生長期的長角果中特異表達(dá)，在植株授粉后，AtNRT1.6基因的表達(dá)量迅速增加，其功能是參與硝酸鹽向種子的運(yùn)輸。nrt1.6突變體種子的氮含量也比對照低，突變體也出現(xiàn)胚發(fā)育不正常的現(xiàn)象，達(dá)到40%，嚴(yán)重影響結(jié)實(shí)率。在nrt1.6突變體植株種子形成過程中的1～4個細(xì)胞發(fā)育階段就會出現(xiàn)發(fā)育不正常的胚。NRT2.7基因是在種子形成的后期表達(dá)，特別是在種子的成熟后期；NRT2.7基因有助于種子胚的成熟。在nrt2.7突變體植株的胚形成過程中，早期的胚發(fā)育正常，只是在后期出現(xiàn)異常。NRT1.6和NRT2.7在種子的形成過程中，在不同的階段和部位發(fā)揮功能，確保種子中氮素的運(yùn)輸和儲存。擬南芥nrt2.7的突變體種子的硝酸鹽含量比對照低，但是氨基酸和淀粉等物質(zhì)的含量不受影響。AtNRT2.7基因在后期胚的成熟過程中是否還與硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，尚不清楚［72-74］。

2 硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因在植物育種中的利用

氮素從根系運(yùn)輸?shù)饺~片中儲存，在植株后期大量需求氮素時作為主要氮源之一［21］。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特定部位表達(dá)模式?jīng)Q定了其在植株體內(nèi)的功能。AtNRT1.7基因的功能是負(fù)責(zé)把儲存的硝酸鹽裝載入韌皮部，并轉(zhuǎn)運(yùn)到新生的葉片中；通過基因克隆等技術(shù)選擇NRT1.1基因的第2～5個跨膜結(jié)構(gòu)域和NRT1.2基因的N端第1個跨膜結(jié)構(gòu)氨基酸序列及后6個膜結(jié)構(gòu)氨基酸序列組建一個全新的NRT（NC4N）基因，再利用NRT1.7基因的啟動子使NC4N基因在特異部位表達(dá)；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把NC4N基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥、煙草和水稻中，對轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)量測定發(fā)現(xiàn)，NC4N基因提高了擬南芥、煙草和水稻的生物量，收獲的種子數(shù)量也比對照高。在這3種植株中老葉片的含氮量比對照低，不僅在植株的營養(yǎng)生長時期，而且在生殖生長時期也促進(jìn)了植株中氮素的再轉(zhuǎn)化。這證實(shí)了提高植株氮素從源到庫的轉(zhuǎn)運(yùn)，可以提高植株的氮素利用效率［75］。

在多年的進(jìn)化和馴化過程中，植物基因出現(xiàn)了自然變異和選擇壓力的變異，這些位點(diǎn)的變異可以微調(diào)這些基因功能，最終表現(xiàn)在這些基因如何參與具體的生物過程［76］。Hu等［24］通過分析秈、粳稻的OsNRT1.1B基因序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)兩者的氮吸收效率差異是因?yàn)镺sNRT1.1B基因的一個氨基酸的變異所導(dǎo)致，通過基因編輯技術(shù)改變其位點(diǎn)，則能提高粳稻的氮素利用效率。在不影響植株正常生長的前提下，通過對氮素利用途徑中多個關(guān)鍵基因的過表達(dá)和多個基因組合共表達(dá)，有利于提高產(chǎn)量［77］。NRT2需要與NAR2.1互作才能發(fā)揮氮素吸收效率，同時在水稻中過表達(dá)OsNAR2.1基因和OsNRT2.3a基因，田間測產(chǎn)表明過表達(dá)基因植株比對照增加了24.6%的產(chǎn)量；單獨(dú)過表達(dá)OsNAR2.1基因，只增加了14.1%的產(chǎn)量。Liu等［78］研究發(fā)現(xiàn)，在少施氮肥條件下，與對照植株相比較，OsTCP19基因能夠提高水稻20%～30%的氮肥利用率。然而，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥施用，OsTCP19基因在大量水稻品種中逐漸消失。OsTCP19蛋白既能抑制DLT基因的表達(dá)，也與OsABI4和OsULT1等蛋白互作，參與到ABA、發(fā)育信號等多條信號通路；在水稻的氮素利用通路中，也影響了相關(guān)的NRT基因的功能發(fā)揮。因此，通過研究與NRT互作的關(guān)鍵基因，也可能挖掘到影響農(nóng)藝性狀至關(guān)重要的基因。

3 展望

植物對氮素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存、同化和再利用是多個基因和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。硝酸鹽被根系吸收、硝酸鹽在木質(zhì)部和韌皮部裝載運(yùn)輸和在液泡中儲存等整個生物過程中，不同類型的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)雜催化結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致了吸收硝酸鹽能力和功能等方面的差異［79-80］。硝酸鹽吸收存在多個調(diào)控模塊，目前還沒有完全解析吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的信號通路。通過對植物氮素利用途徑的研究，了解這些組成部分是如何相互作用并成為一個有機(jī)整體而發(fā)揮作用，有利于找到制約植物氮素最大化利用的關(guān)鍵點(diǎn)［81］。隨著對硝酸鹽的運(yùn)輸和再利用等途徑中基因的挖掘和功能鑒定，可以利用基因編輯等技術(shù)對關(guān)鍵基因進(jìn)行編輯，通過對關(guān)鍵堿基的替換，改變基因的表達(dá)；從而改變改良品種關(guān)鍵基因的功能，提高植株對氮素的運(yùn)輸效率和數(shù)量，實(shí)現(xiàn)植物氮素利用效率的提高［10］。例如，水稻OsNRT1.1B基因在粳、秈稻間由于單核苷酸的多態(tài)性而導(dǎo)致氮素利用效率的不同，因此可以通過基因編輯技術(shù)進(jìn)行單堿基的改變［81］。目前，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)已經(jīng)很成熟，可以通過單堿基的改變，關(guān)閉限制氮素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲及同化利用相關(guān)基因的表達(dá)，從而改良水稻推廣品種的氮吸收效率，達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的目標(biāo)。

NRT基因成員中在吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的效率上存在差異，導(dǎo)致差異的原因是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的影響。通過對NRT基因轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的改造，可以提高其轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽的效率。對NRT1.7基因的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)進(jìn)行改造，提高了NRT1.7基因?qū)Φ貜睦先~片向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提高了植株的產(chǎn)量［75］。NRT基因也與其他基因互作，從而參與到其他信號通路中。NRT1.1/NRT2.1基因的表達(dá)量提高會抑制植物中光響應(yīng)調(diào)節(jié)因子FT和CO基因的表達(dá)，從而影響植株的開花時間。利用基因編輯技術(shù)在NRT1.1/NRT2.1基因的啟動子序列中插入一段序列，提高這兩個基因的表達(dá)量，從而提高植株對氮素的吸收和改變開花時間［82］。

部分NRT基因的功能已經(jīng)得到解析，但是其在某些組織中表達(dá)的生物學(xué)意義尚不清楚。例如：NRT1.1基因在植株的葉柄特異表達(dá)，其功能未能解釋。還需要通過研究該基因在葉柄處互作的蛋白種類，從而推測其功能。而且對植株中氮素的儲存研究尚未深入，除了已知的AtNRT1.4基因控制氮素的儲存，其他影響氮素儲存的基因還沒鑒定出來；需要通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)的結(jié)合，集中研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多基因突變體，將有助于鑒定NRT基因在氮素儲存中發(fā)揮的作用。利用酵母單雜交技術(shù)挖掘調(diào)控NRT基因表達(dá)的上游基因和NRT基因啟動子中的關(guān)鍵元件，最終增加NRT基因的表達(dá)量，提高植株對氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)效率。未來的研究可以通過整合信號途徑中多個NRT關(guān)鍵基因和調(diào)控因子，達(dá)到操縱硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性，增強(qiáng)植株對硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面的能力。因此，采用多基因表達(dá)的模式，利用過表達(dá)根系吸收氮素基因、組織特異表達(dá)啟動子控制籽粒灌漿時期的NRT基因和其他影響氮素在籽粒積累的基因共同組合成基因簇，提高植物的氮素利用效率［18］；再結(jié)合植物不同生長時期的氮肥施用量和田間管理，在顯著減少氮肥施用量的前提下，確保穩(wěn)產(chǎn)或增加產(chǎn)量，來減輕氮肥對環(huán)境的污染。