鄭 旭，趙文靜，繆美華，劉興滿

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港 222006）

烏桕屬大戟科（Euphorbiaceae）多年生高大落葉喬木，在我國栽培和利用歷史已有1000 多年，廣泛分布于黃河流域以南各地區(qū)[1-2]。烏桕是集能源、藥用、材用、觀賞于一體的多用途樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值、推廣應(yīng)用價值。此外，烏桕樹冠高大整齊，葉色秀麗，秋葉深紅、紫紅或金黃，可用于行道樹、園景樹，也可孤植、叢植或列植于廣場綠地或森林公園的池畔、水旁等地方，形成良好的觀賞效果[3]。

類黃酮屬于植物次生代謝產(chǎn)物，是一類多酚類化合物。目前植物界鑒定出的類黃酮物質(zhì)超過8000 種，依據(jù)結(jié)構(gòu)上的差異可以分為黃酮類、黃酮醇類、花色素苷類、黃烷酮類等[4-5]。目前關(guān)于烏桕皮油和梓油等資源開發(fā)利用[6-8]、抗逆機(jī)理[9]、繁育[10-12]、遺傳學(xué)[13-15]等方面研究較多，但烏桕秋葉色類黃酮成分及其含量變化的報道較少。本研究以‘連桕1 號’‘云臺紅桕’和‘云臺金桕’為研究對象，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析烏桕葉片中類黃酮成分及其含量，研究其類黃酮成分的差異及轉(zhuǎn)色前后變化特征，為烏桕觀賞品種選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘連桕1 號’‘云臺紅桕’‘云臺金桕’為研究品種，分別選擇3 株樹齡12 年、生長健壯、長勢一致、秋季轉(zhuǎn)色后葉色分別為紫紅色、鮮紅色和金黃色的植株，于2021 年9 月14 日、11 月10 日10：00 取樣2 次，重復(fù)3 次，選取樹冠中部相同部位葉片。材料來源于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛實驗基地烏桕種質(zhì)資源庫。

1.2 方法

1.2.1 定性分析。用2 mL 70%v/v 甲醇水溶液提取約100 mg 植物材料樣品，每次使用超聲波提取30min，共2 h，并在35℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓，將混合提取物濃縮至幾乎干燥。在分析之前，將殘余物溶解在200μL 50%甲醇溶液中，并轉(zhuǎn)移到配有插入裝置的小瓶內(nèi)。

利用超高效液相色譜（Vanquish，UPLC，Thermo,USA）和高分辨質(zhì)譜（Q Exactive，Thermo，USA）聯(lián)用技術(shù)對烏桕葉片中類黃酮成分進(jìn)行定性與定量分析。色譜柱：Waters HSS T3（50×2.1mm，1.8μm）；流動相：A相為超純水（含0.1%甲酸），B 相為乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL；洗脫梯度：0min 水/乙腈（90∶10 V/V），2.0min 水/乙腈（90∶10V/V），6.0 min 水/乙腈（40∶60 V/V），9.0min 水/乙腈（40 ∶60V/V），9.1min 水/ 乙 腈（90 ∶10V/V），12.0min 水/乙腈（90∶10V/V）。采用電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓-2800 V；溫度350℃；離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為單離子檢測（SIM）模式；掃描方式為負(fù)離子。

1.2.2 定量分析。標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、二氫楊梅素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氫槲皮素、槲皮苷、二氫山奈酚、木犀草素、槲皮素、柚皮苷查爾酮、柚皮素和山奈酚購于sigma公司，所有標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%。建立兒茶素、二氫楊梅素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氫槲皮素、槲皮苷、二氫山奈酚、木犀草素、槲皮素、柚皮苷查爾酮、柚皮素和山奈酚13 種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計算（表1），重復(fù)3次，計算各成分含量。

表1 13 種類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果分析

2.1 3 個烏桕品種葉片類黃酮鑒定

利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對3個烏桕品種秋葉類黃酮成分進(jìn)行定性分析，根據(jù)各成分保留時間、預(yù)期分子量和檢測分子量，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品總離子流圖，對其主要成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，共檢測到13 種類黃酮成分（表2），分別是兒茶素（289.0718）、二氫楊梅素（319.0463）、表兒茶素（289.0722）、蘆丁（609.1471）、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷（463.0885）、二氫槲皮素（303.0499）、槲皮苷（447.0932）、二氫山奈酚（287.0563）、木犀草素（285.0407）、槲皮素（301.0348）、柚皮苷查爾酮（271.1611）、柚皮素（271.0611）和山奈酚（285.0408）。

圖1 類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖

表2 3 種烏桕葉類黃酮質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖2 樣品類黃酮總離子色譜圖

2.2 3 個烏桕品種葉片類黃酮含量

由表3 可知，葉片轉(zhuǎn)色前，‘連桕1 號’中葉片類黃酮含量占其類黃酮總量1%以上（含1%）的主體成分共5 種，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占57.12%、27.79% 和10.022%，合 計94.932%?！婆_紅桕’中類黃酮含量1%以上的主體成分共5 種，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占53.389%、31.659%和7.836%，合計92.884%?！婆_金桕’中類黃酮含量1%以上的主體成分共4 種，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占52.125%、28.406%和15.623%，合計96.154%。槲皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷和蘆丁為3個品種共有主體成分?！婆_紅桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量較多。

表3 3 個烏桕品種葉片轉(zhuǎn)色前后類黃酮含量

3 個烏桕品種葉片主體成分中，蘆丁含量相差不大，但‘連桕1 號’和‘云臺金桕’中蘆丁含量分別是‘云臺紅桕’的1.46 倍和1.98 倍?！B桕1 號’和‘云臺紅桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量均為是‘云臺金桕’的1.12 倍和?！B桕1 號’中槲皮苷含量分別是‘云臺紅桕’和‘云臺金桕’的1.76 倍和1.26 倍?！B桕1 號’和‘云臺紅桕’中槲皮素含量為‘云臺金桕’的1.62 倍和1.42 倍。

轉(zhuǎn)色后，‘連桕1 號’中含量占其類黃酮總量1%以上（含1%）的主體成分共4 種，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占53.214%、30.748%和11.031%，合計94.993%。‘云臺紅桕’中主體成分有6 種，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占48.074%、31.659%和8.513%，合計88.246%。‘云臺金桕’中主體成分共6 種，槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁分別占45.108%、26.995%和12.029%，合計84.132%。槲皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷和蘆丁為3 個品種共有主體成分。槲皮素主要存在于‘云臺金桕’。山奈酚在‘連桕1 號’中含量較少。

3 個烏桕品種葉片主體成分中，‘連桕1 號’和‘云臺金桕’中蘆丁含量分別是‘云臺紅桕’的1.38 倍和1.46 倍?！B桕1 號’和‘云臺紅桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量相差不大，但‘連桕1 號’和‘云臺紅桕’中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量分別是‘云臺金桕’的1.17 倍和1.22 倍。‘連桕1 號’槲皮苷含量為‘云臺紅桕’和‘云臺金桕’的1.18 倍和1.21 倍。‘云臺金桕’中槲皮素含量分別是‘連桕1 號’和‘云臺紅桕’的2.82 倍和1.89 倍。3 個烏桕品種中山奈酚含量相差不大。

2.3 3 個烏桕品種葉片類黃酮分類

由表4 可知，3 個烏桕品種葉片中類黃酮成分主要為槲皮甘類、槲皮素類、蘆丁類、兒茶素類和其他類型。除其他類外，3 個烏桕品種葉片轉(zhuǎn)色后槲皮甘類、槲皮素類、蘆丁類和兒茶素類含量較轉(zhuǎn)色前均有不同幅度的提高。3 個烏桕品種轉(zhuǎn)色前與轉(zhuǎn)色后含量較高的均為槲皮甘類、槲皮素類和蘆丁類。其中‘連桕1 號’轉(zhuǎn)色前各分類占類黃酮總量的57.120%、31.627%和10.022%，轉(zhuǎn)色后各分類占類黃酮總量的53.214%、34.663%和11.031；‘云臺紅桕’轉(zhuǎn)色前各分類占類黃酮總量的53.389%、37.332%和7.836%，轉(zhuǎn)色后各分類占類黃酮總量的48.047%、48.883%和8.513%；‘云臺金桕’轉(zhuǎn)色前各分類占類黃酮總量的52.125%、31.142%和15.623%，轉(zhuǎn)色后各分類占類黃酮總量的45.108%、39.681%和12.029%。

表4 3 個烏桕品種葉片類黃酮分類

3 結(jié)論與討論

本研究利用超高效液相色譜和液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對3 個烏桕品種葉片中類黃酮含量進(jìn)行定性定量分析，共檢測出13 種類黃酮成分，其中槲皮甘類1 種、槲皮素類3 種、蘆丁類1 種、兒茶素類2 種、其他成分6種。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得各成分含量0.997 以上，表明試驗所建立的類黃酮成分定量分析方法能有效定量各成分含量。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，烏桕葉中存在槲皮素、山奈酚、沒食子酸乙酯等15 種化合物[16-17]，霍光華等[18]研究發(fā)現(xiàn)，烏桕葉中主要類黃酮物質(zhì)為槲皮素、山奈酚及其組成的甙。本研究檢測到的兒茶素、二氫楊梅素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等13 種類黃酮成分，其中槲皮苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷和蘆丁為3 個烏桕品種共有的主體成分。

顧雪等[19]從烏桕葉片中檢測到4 種類黃酮物質(zhì)，分別為槲皮素、槲皮苷、山奈苷及異槲皮苷，從烏桕葉片乳汁中分離出山奈酚、異槲皮苷和槲皮素。銀杏中主要類黃酮物質(zhì)為槲皮素、山奈酚和異鼠李素[20]。蘆丁是黃色系大葉櫸葉片中主要成分[21]。本研究‘云臺紅桕’葉片轉(zhuǎn)色后槲皮素含量占類黃酮總量的40.883%，高于連桕號、‘云臺金桕’的34.663%、30.681%，說明槲皮素類為‘云臺紅桕’葉片轉(zhuǎn)色后呈現(xiàn)紅色的主要色素成分。槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷在3 個烏桕品種葉片轉(zhuǎn)色后，不僅相對含量較高，而且其占類黃酮總量百分比亦較高，如‘云臺紅桕’葉片轉(zhuǎn)色后槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量和百分比均高于‘連桕1號’和‘云臺金桕’，說明槲皮素類尤其是槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷是決定‘云臺紅桕’轉(zhuǎn)色后葉片呈現(xiàn)紅色的主要色素成分。該結(jié)論與Mattivi 等[22]及張瓊等[23]研究結(jié)果基本一致。在3 個烏桕品種中，蘆丁類含量占比在‘云臺金桕’葉片轉(zhuǎn)色后最高，其次為‘連桕1 號’，‘云臺紅桕’最少，說明蘆丁是‘云臺金桕’葉片轉(zhuǎn)色后呈現(xiàn)黃色的主要色素成分。在3 個烏桕品種葉片轉(zhuǎn)色后，‘云臺金桕’葉片中蘆丁相對含量最高，且百分比最高，說明蘆丁是‘云臺金桕’葉片變黃的主要色素成分。該結(jié)論與Li 等[24]研究結(jié)果基本一致。

3 個烏桕品種類黃酮成分類型主要為槲皮甘類、槲皮素類、蘆丁類和兒茶素類?！B桕1 號’葉片轉(zhuǎn)色后槲皮甘類高于‘云臺紅桕’和‘云臺金桕’，‘云臺紅桕’葉片轉(zhuǎn)色后槲皮素類高于‘連桕1 號’和‘云臺金桕’，‘云臺金桕’葉片轉(zhuǎn)色后蘆丁類高于‘連桕1 號’和‘云臺紅桕’。

本研究明確了烏桕葉片轉(zhuǎn)色前與轉(zhuǎn)色后類黃酮成分、含量及變化特征，為烏桕觀賞新品種選育提供一定的科學(xué)依據(jù)。