韋高猛 黃勇平 劉王睿 唐毓金

(右江民族醫(yī)學院 1附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 百色 533000；2研究生院；3骨科)

前列腺癌(PCa) 是歐美發(fā)達國家男性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率位居第一位，死亡率僅次于肺癌，居于第二位〔1〕。近年來，隨著我國人口老齡化的加重及飲食習慣改變等原因，PCa的發(fā)病率及死亡率逐年增高〔2〕。而且相當一部分PCa患者發(fā)現(xiàn)時已屬于晚期，失去了根治性手術治療的機會〔3〕。前列腺特異性抗原(PSA)是PCa早期篩查最主要的標志物，其也普遍作為PCa的分期、預后和監(jiān)測指標〔4〕，但是隨著研究的不斷深入，PSA被認為僅對前列腺組織特異，而不是對PCa組織特異，PSA 升高不一定考慮PCa，許多良性前列腺增生(BPH)、前列腺炎、留置尿管及肛門指診等患者都表現(xiàn)出PSA升高，導致相當比例不必要的穿刺活檢，加重了患者的經(jīng)濟負擔并造成極大痛苦〔5〕。

DJ-1又稱PARK7，具有促進癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移，并抑制細胞凋亡、抗氧化等多種功能。近期多項研究表明，DJ-1蛋白通過激素受體信號的調(diào)節(jié)、氧化應激及細胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié)來參與機體惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后〔6〕。DJ-1可通過抑制p53-B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)凋亡途徑避免紫外線誘導腫瘤細胞凋亡〔7〕。DJ-1還可以通過調(diào)節(jié)p53-蛋白激酶B(Akt)通路來參與腫瘤細胞的形成與發(fā)展〔8〕。另外，DJ-1還可通過負性調(diào)節(jié)抗腫瘤抑癌基因磷酸酶基因(PTEN)來實現(xiàn)腫瘤的形成與發(fā)展〔9〕，如通過 PTEN/PI3K/Akt途徑抑制肺癌、肝癌細胞的凋亡，并參與肺癌、肝癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移〔10,11〕。目前關于DJ-1基因在PCa中作用的研究較少，其分子機制也尚未明確。本研究通過檢測 DJ-1在PCa組織和PCa細胞系的表達情況，探究其在PCa的進展及預后中的臨床意義，通過沉默DJ-1表達探究其對PCa細胞的增殖及侵襲的影響。

1 資料和方法

1.1資料來源 收集2015年1月至2018年12月間在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科診療的50例BPH和51例PCa組織標本。PCa患者納入標準：(1)患者組織均經(jīng)病理證實；(2)單一PCa未合并其他腫瘤的患者；(3)標本由前列腺穿刺活檢術、前列腺電切術或PCa根治術中獲得，術前患者均未接受內(nèi)分泌治療、化療或者放療；(4)術后定期隨訪時間半年以上。PCa組年齡50～84歲，平均66.3歲；Gleason評分≤6分20例，Gleason評分為7分16例，Gleason評分≥8分15例。PCa患者納入標準：(1)患者組織均經(jīng)病理證實；(2)不合并其他惡性腫瘤患者。BPH組年齡53～83歲，平均65.2歲；與PCa患者年齡相匹配。

1.2診斷與治療 51例PCa患者術前均給予前列腺活檢、影像學檢查〔B超、CT、磁共振成像(MRI)〕，確定腫瘤位置、直徑、數(shù)目、有無淋巴轉(zhuǎn)移及有無骨轉(zhuǎn)移等；抽血檢查PSA確定數(shù)值，用Gleason評分進行分級，并采用AJCC第8版的TNM分期系統(tǒng)。且患者均經(jīng)PCa根治術或去勢等進行進一步治療。

1.3細胞系 LNCaP細胞：購自于上海生命科學研究院細胞所。

1.4主要試劑 siRNA-NC、DJ-1-siRNA(Shanghai Genechem Co.,Ltd公司)；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國Gibco公司產(chǎn)品)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(鼎國)；彩色預染蛋白分子量標準(10～170 kD，Thermo)；ECL化學發(fā)光試劑盒(GENVIEW)；兔源DJ-1多克隆抗體(KPL)；免疫組化試劑盒(Affinity)。Transwell小室(Corning公司)，CCK8試劑盒(福州邁新)。

1.5方法

1.5.1免疫組化(SP)法檢測DJ-1在PHD及PCa組織中的表達 將組織切成厚度約為5組織的切片，常規(guī)脫蠟、水化，過氧化氫溶液浸泡滅活內(nèi)源性的過氧化氫酶，用0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液進行微波修復，Ⅰ抗封閉，Ⅱ抗孵育，滴加二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，自來水沖洗并用蘇木素復染，脫水、透明、樹膠封片，最后進行鏡檢。病理切片分別由2位高年資病理醫(yī)師進行判斷，最后將結(jié)果匯總。分別在每張玻片上隨機選擇5個高倍鏡視野，細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的可判定為陽性表達。根據(jù)細胞染色的強弱程度評分可分為0～3分:其中0分為胞質(zhì)黃色顆粒;1分為高于背景和陰性對照的淡棕黃色顆粒;2分為介于強弱之間且染色清晰的棕黃色顆粒;3分的為陽性染色強并有大量深棕色顆粒。根據(jù)陽性細胞百分比評分可分為0～4分:0%評為0分，1%～25%評為1分，26%～50%評為2分，51%～75%評為3分，>75%評為4分。陽性細胞染色百分比×染色強度=免疫反應性評分(IRS)〔12〕。

1.5.2生物信息學分析 本研究納入癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)計劃數(shù)據(jù)庫中492例PCa患者和152例配對癌旁正常組織，通過Studentt檢驗分析DJ-1轉(zhuǎn)錄組水平的表達差異。通過R軟件分析和預測DJ-1相關的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)、細胞外RNA調(diào)控網(wǎng)絡及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡。

1.5.3LNCaP細胞培養(yǎng)及細胞轉(zhuǎn)染 PCa LNCaP細胞株分別置于含10%胎牛血清、5 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境條件為恒溫培養(yǎng)箱中5% CO2、37℃及飽和濕度。將LNCaP細胞傳代到6孔板，密度為20%。對傳代細胞分為空白對照(CON)組、LNCaP-NC(NC)組、LNCaP-siRNA(KD)組。CON組：不予感染慢病毒；NC組：用陰性對照慢病毒感染；KD組用LNCaP-siRNA重組慢病毒感染。將加入病毒的細胞移入指定的培養(yǎng)箱繼續(xù)進行培養(yǎng)3 d，在倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率并拍照。

1.5.4RT-qPCR檢測DJ-1的mRNA在各組細胞中的表達水平 采用Trizol法分別提取總RNA并置于-80℃下保存，使用核酸蛋白檢測儀分別檢測RNA的濃度及純度。以RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件為42℃ 60 min 72℃ 10 min，生成的cDNA立刻進行Real-time PCR 擴增。以 GAPDH 作為內(nèi)參照，DJ-1擴增引物序列：上游引物 ：5′-CCGTGATGTGGTCATTTGTC-3′；下游：5′-TTCATGAGCCAACAGAGCAG-3′。內(nèi)參基因β內(nèi)Actin上游引物：5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′；下游：5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′。PCR條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s；59℃ 20 s；72℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.5.5Western印跡法檢測DJ-1蛋白在各組細胞中的表達水平 根據(jù)細胞量的多少，每管細胞加100～500 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的可溶性蛋白裂解液(RIPA)裂解液，于冰上裂解30 min，在4℃下12 000 r/min離心10 min后用BCA法檢測蛋白濃度。進行電泳并轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后用5%脫脂奶粉溶液封閉。4℃下Ⅰ抗(DJ-1 兔抗人多克隆抗體及內(nèi)參照GAPDH抗體)孵育過夜，次日取出PVDF膜，PBS洗膜5次后二抗室溫孵育1 h，再洗膜5次后顯影，用圖像分析軟件Image J對圖像進行灰度分析。

1.5.6CCK-8技術分析轉(zhuǎn)染后對LNCaP細胞增殖的影響 在96孔板中設立CON、NC、KD 3組，向每板孔中種入細胞懸液，密度為5 000個細胞/孔；置于培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h；各組細胞在檢測時間點時，滴加CCK-8溶液，再將細胞放置培養(yǎng)箱內(nèi)培育3 h。置于酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔吸光度值，選擇450 nm波長，并記錄結(jié)果。

1.5.7平板克隆形成實驗分析轉(zhuǎn)染后對LNCaP細胞增殖的影響 將轉(zhuǎn)染好的細胞用0.25%胰酶消化后，按照密度為500個細胞/孔種到6孔板中，3～4 w后終止培養(yǎng)，并棄去培養(yǎng)基，用4%的甲醛固定15 min，添加適量結(jié)晶紫染色液染色10～30 min，洗除染色液后室溫干燥并拍照、計數(shù)。

1.5.8細胞劃痕實驗分析轉(zhuǎn)染后對LNCaP細胞遷移的影響 收集各組對數(shù)生長期細胞，將生長狀態(tài)良好的細胞接種到6孔培養(yǎng)板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察見細胞鋪滿單層后，用200 μl的槍頭輕輕劃痕，每孔劃3～5道；吸出培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清除細胞碎片，再次加入培養(yǎng)基并拍照，此時記時為0 h；培養(yǎng)48 h后再次取點拍照，并計算細胞間距離的均值。

1.5.9Transwell實驗分析轉(zhuǎn)染后對LNCaP細胞侵襲的影響 準備好將Transwell插入物放入24孔板中以進行浸潤性檢查。將各組細胞接種在無血清培養(yǎng)基中，然后接種在每個Transwell室中。隨后，在24孔板腔中添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將底部的細胞用4%的聚甲醛固定15 min，擦除上腔室中的細胞，用PBS洗滌，然后將細胞用結(jié)晶紫染料染色，風干后用顯微鏡拍攝LNCaP細胞，并計數(shù)。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單方差分析、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1DJ-1在BPH及PCa標本中的表達差異 DJ-1主要表達在細胞質(zhì)中，DJ-1在BPH組織呈陰性表達，在前列腺癌旁組織中低表達或陰性，而在前列腺癌組織中的表達水平較高，顯示為棕黃色顆粒(圖1)。BPH-1組IRS為2.2±0.57，PCa組IRS為3.7±0.51，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Gleason評分≥8分的15例患者IRS的平均值為7.9±0.9，Gleason評分=7分的16例患者IRS平均值為4.7±0.6，Gleason評分≤6分的20例患者IRS平均值為2.7±0.6，存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2PCa中DJ-1蛋白表達與AHYMUM臨床病理特征的關系 DJ-1蛋白在前列腺癌Ⅲ～Ⅳ期患者中的表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，在Gleason 評分≥7患者中的表達顯著高于Gleason 評分<7分患者，在總PSA值≥20 ng/ml患者中表達顯著高于總PSA值<20 ng/ml患者，在轉(zhuǎn)移灶數(shù)≥4個患者中表達顯著高于轉(zhuǎn)移灶數(shù)<4個患者中的表達(P<0.05)。見表1。

表1 DJ-1表達水平與AHYMUM臨床病理特征的相關性

2.3生物信息學預測 PCa組織中DJ-1 mRNA表達量(8.690±0.324)顯著高于癌旁正常組織(8.175±0.474，P<0.001)，而DJ-1的甲基化修飾水平(中位數(shù)0.035)顯著低于癌旁正常組織(中位數(shù)0.039，P<0.05)，可能作為后續(xù)研究的切入點。此外，我們通過生物信息學方法預測到DJ-1的PPI，DJ-1可能與PCa相關的關鍵基因密切相關，如：雄激素受體(AR)，抑癌基因第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)，氧調(diào)節(jié)的關鍵基因希佩爾-林道基因(VKL)等。并預測到DJ-1相關的以DNA結(jié)合方式的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子激活、相關lncRNA、靶向的miRNA等，為后續(xù)機制研究奠定基礎。見圖2。

2.4DJ-1表達與PCa患者生化復發(fā)的關系 對51例PCa患者進行隨訪，血清 PSA 水平連續(xù)兩次≥0.2 ng/ml被認定為生化復發(fā)，高表達患者26例，低表達患者25例。表明DJ-1高表達與PCa患者生化復發(fā)顯著相關(HR=2.4，P=0.032)。見圖3。總生存期由于隨訪時間較短未獲得。

2.5DJ-1 siRNA重組慢病毒轉(zhuǎn)染LNCaP細胞獲得高轉(zhuǎn)染效率 經(jīng)過慢病毒感染后，將細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。NC組、KD組在感染24 h后，可見到部分細胞內(nèi)出現(xiàn)熒光，細胞融合率為60%～70%，生長狀態(tài)良好。3 d后再次顯微鏡下觀察，可見細胞融合率為80%～90%，生長狀態(tài)良好，細胞數(shù)達到實驗要求(約1×106個/孔)，熒光亮度強且范圍最大，感染效率達80%以上。見圖4。

2.6Western印跡和RT-qPCR檢測沉默DJ-1基因后LNCaP細胞DJ-1蛋白表達水平 CON組(0.42±0.12，1.01±0.12)與NC組DJ-1蛋白及mRNA表達水平(0.41±0.11，1.03±0.07)比較，無明顯差異(P>0.05)。KD組中DJ-1蛋白及mRNA表達水平(0.09±0.07，0.26±0.14)均明顯低于NC組(P<0.01)。見圖5。

2.7沉默DJ-1基因后對PCa LNCaP細胞的增殖和克隆形成的影響 CCK-8實驗顯示 DJ-1基因沉默后，相對于NC組和CON組，KD組PCa INCaP細胞增長速度明顯降低(P<0.01)。與此同時，平板克隆形成實驗顯示，DJ-1的沉默抑制PCa LNCaP細胞的增殖和克隆形成(P<0.05) 。見表2、圖6。

2.8沉默DJ-1基因后對PCa LNCaP細胞的侵襲和遷移的影響 KD組侵襲細胞數(shù)明顯低于CON組和NC組(P<0.01)，而CON組和NC組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。KD組細胞劃痕愈合相較于CON和NC組顯著減慢；細胞的遷移能力受到抑制(P<0.001)。見表2、圖7、圖8。

3 討 論

隨著我國人口老齡化的加速、生活環(huán)境的改變和飲食結(jié)構(gòu)等因素的改變，PCa的發(fā)病率和死亡率迅速增長，其增長率已經(jīng)居于腫瘤之首位，有可能超過膀胱癌成為泌尿系統(tǒng)最常見腫瘤〔13〕。PCa的早期癥狀并不明顯，因而大部分患者就診時往往已處于中、晚期，失去了根治手術的最佳時機，所以了解PCa的發(fā)生和發(fā)展的潛在機制，有利于早期診斷，愈后評估和選擇針對性的治療策略。

DJ-1是Nagakubo等〔14〕近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的絲裂原依賴性癌基因。有學者對2 000名受試者進行研究發(fā)現(xiàn)，相比于非癌癥患者，DJ-1在癌癥患者中高表達，且高表達的DJ-1與癌癥的轉(zhuǎn)移，分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關〔15〕。Qiu等〔16〕研究表明DJ-1在肝癌組織中高表達，并且表達水平與總生存期負相關性。Kawate等〔17〕發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者DJ-1的表達水平與患者的腫瘤分級密切相關，分級越高，DJ-1的表達水平越高，DJ-1可能是乳腺癌的候選血清標記物。Zheng等〔18〕經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)，DJ-1在結(jié)腸癌組織中高表達，且與腫瘤大小和臨床分期有關，進一步研究后發(fā)現(xiàn)DJ-1表達與PI3K-p110α、p-AKT、HIF-1α表達呈正相關，認為DJ-1通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT-HIF-1α通路介導結(jié)腸癌細胞存活。DJ-1高表達還可通過PTEN-AKT通路促進結(jié)腸癌細胞的生長與侵襲〔19〕。本研究結(jié)果說明DJ-1與PCa的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，這和DJ-1在人體其他類型腫瘤中的表達相一致。

本研究結(jié)果均提示沉默DJ-1基因表達可有效抑制PCa LNCaP細胞的增殖。沉默DJ-1后LNCaP細胞的增殖受到抑制的具體機制目前尚不明確，可能與下列機制有關：LNCaP細胞對AR高度依賴性〔20〕，通過基因組編輯衍生的AR和AR敲除后可以使LNCaP細胞克隆表現(xiàn)出明顯不同的生物學特性和致瘤特性〔21〕，DJ-1在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用，是AR依賴轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子〔22〕。DJ-1蛋白可在Nrf2驅(qū)動的抗氧化保護中起到正性調(diào)控的作用，DJ-1的下調(diào)可使Nrf2活性降低，進而弱化AR的轉(zhuǎn)活化，抑制LNCaP 細胞增殖〔23,24〕。DJ-1還可通過抑制VHL介導的低氧誘導因子(HIF)2α泛素化，進而改變AR信號，引起PCa細胞的增殖、轉(zhuǎn)移〔25〕。Qin等〔26〕最新研究結(jié)果顯示，沉默DJ-1表達可增強JNK和Bcl2的磷酸化，并增強自噬效應蛋白(Beclin)1和B細胞淋巴瘤(Bcl)2的解離，通過JNK-Bcl2-Beclin1信號通路降低AR活性，抑制前列腺癌LNCaP細胞的增殖。

本研究結(jié)果均提示沉默DJ-1基因表達能顯著抑制前列腺癌LNCaP細胞的侵襲和遷移能力。研究表明，降低DJ-1表達可增加PTEN表達活性，抑制Akt的活化，從而減弱上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)活性，腫瘤細胞的侵襲、遷移被抑制〔27,28〕。Qiu等〔29〕發(fā)現(xiàn)DJ-1的下調(diào)使PTEN表達水平顯著上調(diào)，并通過PTEN/PI3K/Akt信號通路抑制甲狀腺癌K1、TPC-1細胞的增殖、遷移和侵襲。在胰腺癌中，通過抑制DJ-1的表達，可上調(diào)抑癌基因PTEN水平，影響PTEN-PI3K/Akt通路的活性，進而抑制胰腺癌細胞增殖、遷移，誘導細胞凋亡，并可降低胰腺癌細胞對化療藥物的耐藥性〔30,31〕。另外，通過沉默DJ-1表達可上調(diào)p53及其下游凋亡蛋白Bax的表達水平,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，從而使EMT活性降低〔32〕。當DJ-1表達水平降低時使p53活性增強，恢復了細胞周期阻滯功能，上調(diào)下游的bax-caspase通路，并抑制Akt途徑活性，從而使卵巢癌細胞的侵襲、遷移能力明顯減弱。DJ-1的過表達還可直接激活Akt通路，進而上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，增強胃癌細胞SGC7901的體外侵襲、遷移和體內(nèi)腹膜轉(zhuǎn)移能力〔33〕。本研究與上述實驗結(jié)果一致。表明DJ-1對前列腺癌LNCaP細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關，具體調(diào)控機制仍需進一步研究。