★ 鄧茂芝 洪燕 周云峰 吳喆 鄧杰華 黃炳泉(.宜春市檢驗(yàn)檢測(cè)中心 江西 宜春336000;.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 南昌 33009)
橘紅顆粒(膠囊、片)是由化橘紅、陳皮、法半夏等藥味制成的復(fù)方制劑,具有化痰止咳、清肺的功效,收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部[1]。橘紅顆粒方中的法半夏為天南星科植物半夏塊莖的炮制加工品,具有燥濕化痰的療效[2-3]。近年來(lái),隨著半夏野生資源減少、需求量增大、人工栽培技術(shù)滯后等問(wèn)題日益凸顯[4],正品半夏的供給越來(lái)越難以滿足市場(chǎng)的需要,以致出現(xiàn)半夏同屬或同科偽品混用、冒充現(xiàn)象[5-8]。雖然已有快速檢查半夏藥材和虎掌南星藥材中水麥冬酸的方法報(bào)道[9],但是該方法僅針對(duì)半夏原藥材是否摻偽品進(jìn)行鑒別檢查。虎掌南星為天南星科植物虎掌的干燥塊莖[10],外觀與半夏類似,常規(guī)性狀鑒別難以分辨,易帶入以半夏為原料的中藥復(fù)方制劑中,給該類制劑的安全有效用藥帶來(lái)隱患。目前,橘紅顆粒(膠囊、片)的質(zhì)量研究主要集中在有效成分柚皮苷的鑒別或含量測(cè)定方面[11-12],而中藥成方制劑中開(kāi)展半夏真實(shí)性的檢查尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究以虎掌南星的特征性成分水麥冬酸為定性指標(biāo),采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCMS/MS)建立橘紅顆粒(膠囊、片)中水麥冬酸快速檢查方法,篩查制劑是否存在以虎掌南星代替投料的行為。該方法的建立為控制制劑中半夏原料的質(zhì)量奠定基礎(chǔ),更是為提高橘紅顆粒(膠囊、片)的藥品質(zhì)量提供監(jiān)管手段。
H-class/xevo超高效液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)waters公司);KH-250DB超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
水麥冬酸(批號(hào):112042-202002,質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;法半夏對(duì)照藥材(批號(hào):DSTYF000101)、虎掌南星對(duì)照藥材(批號(hào):DST210910-109)均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;橘紅制劑樣品32批次,其中橘紅顆粒26批(樣品序號(hào)1~26),橘紅膠囊3批(樣品序號(hào)27~29),其余為橘紅片,樣品信息見(jiàn)表1;缺法半夏的橘紅顆粒陰性樣品、含虎掌南星的橘紅顆粒陽(yáng)性樣品由江西海爾思藥業(yè)股份有限公司提供。
表1 樣品信息
色 譜 柱:Waters ACQUITY UPLC?CSHTMC18柱(1.7 μm× 2.1 mm×100 mm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2 μL;流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.03%氨水溶液,梯度 洗脫:0~2 min 5%A~5%A,2~2.5 min 5%A~75%A,2.5~4 min 75%A~75%A,4~5 min 75%A~5%A,5~8 min 5%A~5%A;流速:0.2 mL/min。質(zhì)譜掃描模式:ESI+;數(shù)據(jù)采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);水麥冬酸的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 206→125和m/z 206→171。
水麥冬酸對(duì)照品溶液:取水麥冬酸對(duì)照品適量,加20%甲醇溶液制成1 mL約含300 ng的對(duì)照品溶液。
供試品溶液:取本品約2 g,置100 mL量瓶中,加入20%甲醇溶液約80 mL,超聲30 min,放冷至室溫,加20%甲醇溶液至刻度,搖勻,取續(xù)濾液,即得。
陰性樣品溶液:稱取不含法半夏的橘紅顆粒樣品約2 g,按供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。
陽(yáng)性樣品溶液:稱取含虎掌南星的橘紅顆粒樣品約2 g,按供試品溶液的處理方法制備陽(yáng)性樣品溶液。
對(duì)照藥材溶液:稱取半夏、法半夏和虎掌南星對(duì)照藥材各約0.1 g(按處方量換算),按供試品溶液的處理方法制備對(duì)照藥材溶液。
將“2.2”項(xiàng)下配制的各種溶液依照“2.1”項(xiàng)的條件依次進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn),虎掌南星對(duì)照藥材溶液、陽(yáng)性樣品溶液均出現(xiàn)與水麥冬酸對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰,而法半夏對(duì)照藥材和陰性樣品均無(wú)與水麥冬酸對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰,說(shuō)明橘紅顆粒中法半夏和其他藥味對(duì)虎掌南星的水麥冬酸的測(cè)定無(wú)干擾。
圖1 MRM監(jiān)測(cè)圖
取水麥冬酸對(duì)照品溶液,逐級(jí)稀釋成一系列溶液依次測(cè)定。以信噪比S/N約為3對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限,最低檢出濃度為6.6 μg/L。
取“2.2”項(xiàng)配制的水麥冬酸對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄水麥冬酸離子對(duì)m/z 206→171的峰面積,水麥冬酸峰面積的RSD為3.46%,表明精密度良好。
平行取陽(yáng)性樣品6份,按制備供試品溶液方法處理,記錄峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算含量,含量RSD為4.11%,表明重復(fù)性較好。
取一份重復(fù)性項(xiàng)下的陽(yáng)性樣品溶液,分別在0、1、2、4、8 h記錄峰面積,比較峰面積的波動(dòng)性,峰面積RSD為3.87%,提示在8 h內(nèi)樣品溶液較穩(wěn)定。
對(duì)收集的32批橘紅顆粒(膠囊、片)樣品依次測(cè)定,均未檢出水麥冬酸成分。對(duì)于保留時(shí)間與對(duì)照品一致的樣品,在與對(duì)照品濃度相近時(shí),比較離子豐度比(K)是否與對(duì)照品溶液相一致,如不一致,可確定未檢出,判斷依據(jù)見(jiàn)表2。
表2 離子豐度比允許偏差
敬勇等[13]采用高效液相色譜法對(duì)半夏中的虎掌南星偽品進(jìn)行了檢查分析,本研究初期借鑒了該法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行定性檢測(cè),但發(fā)現(xiàn)要達(dá)到原藥材的取樣量,按處方量需稱取橘紅顆粒樣品18 g左右,且考慮到該法樣品前處理較復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、雜質(zhì)峰干擾較多,最后采用樣品需求量少、靈敏度高、分析速度快的UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行測(cè)定,可有效檢出陽(yáng)性樣品中的水麥冬酸。
為使水麥冬酸的質(zhì)譜響應(yīng)達(dá)到最佳水平,需探索優(yōu)化液相和質(zhì)譜條件。通過(guò)考察乙腈-0.1%甲酸、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)、乙腈-0.03%氨水溶液4個(gè)流動(dòng)相體系和質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式、掃描模式,最終選擇乙腈-0.03%氨水溶液流動(dòng)相體系、MRM監(jiān)測(cè)和正離子掃描。水麥冬酸的檢測(cè)離子對(duì)為m/z 206→125和m/z 206→171,其裂解規(guī)律為在正離子模式下水麥冬酸的母離子206[M+H+NH3]+失去一分子NH3和一分子H2O后成子離子171[M+H+NH3-NH3-H2O]+,該子離子進(jìn)一步失去一分子CH3CH2OH裂解成子離子125[M+H+NH3-NH3-H2O-CH3CH2OH]+。
水麥冬酸的極性較強(qiáng),在反相色譜系統(tǒng)中保留時(shí)間較短,在對(duì)方法的耐用性考察時(shí)發(fā)現(xiàn)不同型號(hào)的C18柱、柱溫、流速等對(duì)水麥冬酸的峰形和測(cè)定結(jié)果幾無(wú)影響,只會(huì)稍微影響其出峰時(shí)間。從樣品測(cè)定結(jié)果可知,市售樣品未含有水麥冬酸而陽(yáng)性樣品可檢出,說(shuō)明所建方法可有效甄別橘紅顆粒(膠囊、片)中虎掌南星冒充法半夏投料的行為,但對(duì)于可檢出的最低摻入量沒(méi)有進(jìn)行研究,此項(xiàng)工作將進(jìn)一步深入展開(kāi)。
總之,所建方法快速、準(zhǔn)確,能在一定程度上獲悉橘紅顆粒(膠囊、片)中法半夏的投料情況,并作為橘紅顆粒(膠囊、片)中法半夏藥味的質(zhì)量控制方法。