李艷蘋，王翠翠，趙劍超，馬明遠(yuǎn)，劉小騏，高 艾

(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

0 引 言

元素在環(huán)境中的效應(yīng)與它的總量有關(guān)，更與它存在的化學(xué)形態(tài)緊密相關(guān)[1-2]。硒元素具有抗氧化、抗癌以及拮抗重金屬毒性的作用，是動(dòng)物和人體需要的有益痕量元素，但是環(huán)境中過量的硒又會(huì)致人、畜中毒[3]，以及腸胃功能紊亂、神經(jīng)功能障礙等，或?qū)ι鷳B(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅[4]?？傊?，硒元素具有“雙重性”的特點(diǎn)[5]，其生物有效性、毒性以及代謝規(guī)律與硒存在的形態(tài)密切相關(guān)，因此引起廣大學(xué)者的研究和關(guān)注。目前硒形態(tài)分析的研究已有很多報(bào)道，包括食品[6-7]、水產(chǎn)品[8]、生物樣品[9]、土壤[10]等領(lǐng)域，但在環(huán)境水領(lǐng)域，尤其是海水中的硒形態(tài)分析研究較少，開展海水及濃鹽水中硒元素的形態(tài)分析研究，可為水資源綜合利用以及海洋環(huán)境質(zhì)量評(píng)估提供分析手段[11]。

隨著痕量元素形態(tài)分析技術(shù)的發(fā)展，聯(lián)用技術(shù)已成為元素形態(tài)分析的主要手段，它是將離子色譜（IC）、毛細(xì)管電泳（CE）、高效液相色譜法（HPLC）等分離技術(shù)與原子熒光光譜法（AFS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）等檢測(cè)技術(shù)，通過在線連接整合，形成一種更快速、更有效的分離和測(cè)試技術(shù)，具有很高的選擇性和靈敏性，有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。目前使用較多的是高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (HPLC-ICP-MS)和高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HGAFS)。ICP-MS法具有較寬的線性范圍、靈敏度高、干擾少，以及可同時(shí)測(cè)定多元素或多同位素等優(yōu)點(diǎn)[12]。但由于該儀器價(jià)格昂貴、運(yùn)行費(fèi)用較高以及需要精心維護(hù)等方面，在實(shí)際應(yīng)用中受到了一定的限制[13]。HPLC-HG-AFS不僅儀器操作簡(jiǎn)單、分析成本低，而且也具有高選擇性、高靈敏性、線性范圍寬等特點(diǎn)[14-15]，目前已廣泛應(yīng)用于砷、汞、硒等元素的形態(tài)分析。如有文獻(xiàn)報(bào)道HPLC-ICP-MS測(cè)定海水中的硒形態(tài)[16]，HPLC-HG-AFS測(cè)定海水中的砷形態(tài)[14]，但是還沒有用HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行海水及濃鹽水復(fù)雜基體中有機(jī)和無機(jī)硒形態(tài)測(cè)定的研究。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-HG-AFS聯(lián)用技術(shù)對(duì)海水及濃鹽水中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸根（SeO42-）4種硒形態(tài)進(jìn)行了測(cè)定分析，對(duì)有機(jī)硒和無機(jī)硒有較好的分離效果，方法準(zhǔn)確度高、精密度好，簡(jiǎn)便快速，為海水及濃鹽水中硒形態(tài)分析的有效手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

ST3100型實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)（奧豪斯儀器公司）；Milli-Q型實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；KQ3200B型臺(tái)式超聲波儀（昆山超聲儀器公司）；6500型液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀（北京海光儀器公司）。

硒代胱氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、甲基硒代半胱氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、硒代蛋氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、硒酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（以 Se計(jì)分別為：44.2 μg/g、34.8 μg/g、39.4 μg/g、41.5 μg/g，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；檸檬酸（GR，天津市光復(fù)科技公司）；CaCl2、KCl、NaCl、MgCl2·6H2O、MgSO4·7H2O、（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；KOH（GR，天津津科精細(xì)化工研究所）；HCl（GR，天津風(fēng)船化學(xué)試劑公司）；KBH4（GR，東方化工廠）。

1.2 儀器參數(shù)

原子熒光工作參數(shù)：硒元素?zé)簦ㄖ麟娏?0 mA/輔電流40 mA）；載氣流量300 mL/min；屏蔽氣流量 900 mL/min；負(fù)高壓：300 V；載流 15% HCl；還原劑0.5% KOH+2.5% KBH4。

液相色譜工作參數(shù)：流動(dòng)相30 mmol/L檸檬酸溶液（pH 4，2% 甲醇）；Hamilton PRP-X100離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；等度洗脫；泵轉(zhuǎn)速60 r/min；流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為 100 μL；開啟紫外消解模式。

1.3 樣品處理

采用聚乙烯塑料瓶存放樣品，使用前將聚乙烯塑料瓶浸泡在硝酸溶液（1+3）中24 h，然后用純水清洗，晾干備用。海水及鹽水樣品通過0.45 μm水系微孔濾膜過濾，加硝酸至pH小于2，冷藏存放。

2 結(jié)果與討論

2.1 載流酸度的影響

考察了載流5%～25% HCl對(duì)4種硒形態(tài)SeCys2、MeSeCys、SeMet及SeO42-測(cè)定的影響。結(jié)果表明，4種硒形態(tài)在不同載流條件下的保留時(shí)間基本一致，當(dāng)載流為5% HCl時(shí)，SeCys2和 SeMet兩種硒形態(tài)沒有出峰；當(dāng)載流在10%～25% HCl范圍內(nèi)，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4種硒形態(tài)均出峰，分離效果較好；當(dāng)載流為15% HCl時(shí)，SeMet信號(hào)最強(qiáng)；隨著載流酸度增大，SeMet信號(hào)減弱，MeSeCys和SeO42-信號(hào)略有減弱；為了減少試劑消耗，綜合考慮選定15% HCl作為載流。

2.2 還原劑的影響

文獻(xiàn)[17]表明，KBH4的用量較大地影響分析的準(zhǔn)確度和靈敏度，而且KBH4的水溶液不夠穩(wěn)定，需加入適量的KOH來提高還原劑的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)在0.5% KOH的溶液中分別加入1.5%～5.5% KBH4，考察還原劑對(duì)4種硒形態(tài)測(cè)定的影響。結(jié)果表明，4種硒形態(tài)的保留時(shí)間基本不變，隨著KBH4濃度從1.5%增大至2.5%，4種硒形態(tài)信號(hào)增至最大，但隨著KBH4濃度從2.5%繼續(xù)增大至5.5%，4種硒形態(tài)信號(hào)均有不同程度的減弱，最終選定還原劑濃度為2.5% KBH4+ 0.5% KOH。

2.3 碘化鉀的影響

在0.05% KOH的溶液中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的KI，考察碘化鉀用量對(duì)硒形態(tài)測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)表明，隨著KI的增大，除SeCys2信號(hào)先增大后減弱外，其他3種硒形態(tài)峰信號(hào)逐漸增強(qiáng)，其中SeMet增強(qiáng)最為明顯，因此選定碘化鉀為0.25% 。

2.4 流動(dòng)相pH的優(yōu)化

由于流動(dòng)相的pH對(duì)硒形態(tài)的出峰順序、保留時(shí)間以及分離效果有著很大的影響[16]。分別配制不同pH的流動(dòng)相，考察了流動(dòng)相pH對(duì)硒形態(tài)測(cè)定的影響，結(jié)果如圖1所示。流動(dòng)相pH對(duì)SeO42-的分離影響較大，pH在3～7范圍內(nèi)，隨著pH的增大，SeCys2和MeSeCys的保留時(shí)間逐漸增大，SeMet的保留時(shí)間逐漸減小，而SeO42-的保留時(shí)間先減小后增大；當(dāng)pH為3，在10 min時(shí)SeO42-形態(tài)仍未出峰；當(dāng)pH為4時(shí)，SeO42-峰形更尖銳；當(dāng)pH為5時(shí)，SeO42-的保留時(shí)間最小，但與SeMet的色譜峰大部分發(fā)生重疊；綜合分離效果，選擇pH為4的檸檬酸溶液作為流動(dòng)相。

圖1 pH對(duì)硒形態(tài)保留時(shí)間的影響

2.5 流動(dòng)相濃度的優(yōu)化

對(duì)流動(dòng)相濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)流動(dòng)相濃度為10 mmol/L時(shí)，可分離出SeCys2、MeSeCys和 SeMet三種形態(tài)，SeO42-未出峰。當(dāng)流動(dòng)相濃度從20 mmol/L增至50 mmol/L，SeCys2和MeSeCys的保留時(shí)間基本不變，SeMet的保留時(shí)間先減小后增大，但變化不大，而SeO42-的保留時(shí)間逐漸變小，變化很大；當(dāng)流動(dòng)相濃度為50 mmol/L，SeMet與SeO42-色譜峰不能分開，有部分重疊；當(dāng)流動(dòng)相濃度為40 mmol/L時(shí)，SeMet色譜峰出現(xiàn)較大鼓包；當(dāng)流動(dòng)相濃度為35 mmol/L，可在6.75 min 內(nèi)完成4種形態(tài)分離，但是MeSeCys的信號(hào)明顯減弱。為了較快完成形態(tài)分離，并保證信號(hào)強(qiáng)度，選擇流動(dòng)相濃度為30 mmol/L。

圖2 流動(dòng)相濃度對(duì)硒形態(tài)保留時(shí)間的影響

2.6 基體的影響

樣品基體鹽度（S）對(duì)硒形態(tài)測(cè)定的影響見圖3。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)S在8.5～55范圍內(nèi)，SeCys2與MeSeCys的保留時(shí)間基本不變，SeMet的保留時(shí)間變化不大，SeO42-的保留時(shí)間變化較大，其中隨著鹽度的增大，SeMet的保留時(shí)間逐漸減小，SeO42-的保留時(shí)間逐漸增大。當(dāng)S在35～55之間，4種硒形態(tài)的保留時(shí)間變化較小。當(dāng)S=55時(shí)，SeCys2與MeSeCys的色譜峰不能完全分開。據(jù)保留時(shí)間和分離度的情況，當(dāng)海水樣品S≤45時(shí)，可以按照基體匹配法進(jìn)行硒形態(tài)的測(cè)定；當(dāng)海水及濃鹽水樣品S≥45時(shí)，可以考慮將樣品適當(dāng)稀釋進(jìn)行測(cè)定。

圖3 鹽度對(duì)硒形態(tài)測(cè)定的影響

2.7 4種硒形態(tài)的工作曲線

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試人工海水配制的硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以各濃度點(diǎn)對(duì)相應(yīng)的峰面積繪制工作曲線，獲得線性方程。具體結(jié)果見表1，在5～200 μg/L范圍內(nèi)4種硒形態(tài)的線性相關(guān)系數(shù)均優(yōu)于0.998，在進(jìn)樣量為100 μL，等度洗脫的模式下，SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的檢出限分別為 2.40 μg/L、0.50 μg/L、1.97 μg/L 和 0.53 μg/L，檢出限比文獻(xiàn) [18]報(bào)道的 SeCys2、SeMet、SeO42-（分別為 4 μg/L、18 μg/L 和 3 μg/L）和文獻(xiàn) [7]報(bào)道的SeCys2、MeSeCys、SeMet、SeO42-（分別為3.7 μg/L、1.7 μg/L、4.2 μg/L 和7.2 μg/L）低。SeCys2、MeSeCys、SeMet和 SeO42-的保留時(shí)間分別為 2.261 min、2.804 min、4.051 min和8.057 min，硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖4。

表1 4種硒形態(tài)的工作曲線

圖4 硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.8 海水樣品的測(cè)定、精密度及加標(biāo)回收率

對(duì)海水及人工鹽水進(jìn)行了加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)加標(biāo)前后的海水樣品分別進(jìn)行了測(cè)試，從表2可以看出，當(dāng)加標(biāo)量為 5～45 μg/L 時(shí)，SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-的加標(biāo)回收率在77.5%～119%之間，回收率良好；對(duì)海水和人工鹽水加標(biāo)樣品進(jìn)行了3次的測(cè)定，4種硒形態(tài)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%～12.5%。另外對(duì)一人工鹽水樣品進(jìn)行了7次測(cè)定，結(jié)果見表3，4種硒形態(tài)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在7.3%～11.3%之間，精密度良好。該測(cè)定方法的回收率及精密度滿足標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417—2017 《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求，其中GB/T 27417—2017標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定濃度水平＜0.1 mg/kg，回收率的偏差允許范圍為60%～120%；被測(cè)組分在1～100 μg/L之間，其實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)允許為15%～30%。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究建立了高效液相色譜-氫化物-原子熒光光譜測(cè)定海水及濃鹽水中硒形態(tài)的方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了分析條件：氫化發(fā)生反應(yīng)條件為載流15% HCl，還原劑2.5% KBH4+ 0.5% KOH，碘化鉀0.25%，色譜分離的流動(dòng)相為30 mmol/L（pH 4）的檸檬酸緩沖溶液。該方法采用Hamilton PRP-X100交換柱，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下分離和測(cè)定，精密度好，回收率高，滿足分析檢測(cè)的要求，不需進(jìn)行特殊前處理，操作簡(jiǎn)便、快速，可在8.5 min內(nèi)完成SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeO42-4種硒形態(tài)的分離，可用于海水、濃鹽水及海水綜合利用排放水中硒形態(tài)的測(cè)定。