李明凌，王森山，郝亞楠，秦亞龍，陳明娟，孫元星

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

基因多效性是生物體中普遍存在的一種現(xiàn)象，具體是指生物體某一基因發(fā)生突變往往會(huì)導(dǎo)致其他性狀的改變[1]。近年來(lái)，有關(guān)昆蟲體色基因的多效性已成為研究熱點(diǎn)。大量試驗(yàn)表明昆蟲體色的突變往往會(huì)在行為、生理和生活史等方面表現(xiàn)出多效性作用，并具有穩(wěn)定的種群遺傳特征[2-5]。例如，與正常型果蠅Drosophilasimulans相比，黃化型果蠅的抗紫外能力和交配成功率均顯著下降[6-7]；而?；页嵋苟闟podopteralittoralis的黑化幼蟲較正常型對(duì)白僵菌的抗性明顯增強(qiáng)[8]。此外，研究表明體色相關(guān)基因發(fā)生突變還會(huì)影響昆蟲對(duì)食物的利用效率，進(jìn)而影響生長(zhǎng)發(fā)育，如黑化型天幕毛蟲Malacosomadisstria幼蟲較正常型在取食相同食物后雄蟲體型較小[9]。目前，有關(guān)昆蟲體色相關(guān)基因多效性的研究主要集中于鱗翅目及膜翅目，而在鞘翅目中的研究相對(duì)較少。

異色瓢蟲Harmoniaaxyridis屬鞘翅目(Coleoptera)、瓢蟲科(Coccinellidae)，是一種重要的捕食性天敵，在生物防治中應(yīng)用廣泛[10]。該瓢蟲成蟲鞘翅斑型多樣，不同色型之間的生物學(xué)特性存在明顯差異，是研究體色與環(huán)境適應(yīng)機(jī)理的理想模式材料[11]。研究表明，異色瓢蟲蛹及成蟲的黑化程度與環(huán)境適應(yīng)(主要為溫度)密切相關(guān)[12-13]。近年來(lái)，部分研究還發(fā)現(xiàn)異色瓢蟲黑化相關(guān)基因具有明顯的多效性，如一種異色瓢蟲淺色突變體gr與野生型相比，其幼蟲的取食量和抗紫外能力均顯著降低[14]；在3齡幼蟲期沉默黑化相關(guān)基因可顯著降低成蟲的產(chǎn)卵量及卵孵化率[15]。

人工飼料在捕食性天敵的規(guī)?；a(chǎn)中具有十分重要的作用。應(yīng)用高效人工飼料飼養(yǎng)天敵不僅可以降低生產(chǎn)成本，而且可以長(zhǎng)時(shí)間維持天敵種群數(shù)量的穩(wěn)定[16-18]。目前，異色瓢蟲的非昆蟲源人工飼料主要以脊椎動(dòng)物蛋白為主，其中以基于豬肝的飼料居多[19]。研究表明，相關(guān)飼料基本可以滿足異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)需求，但仍存在存活率較低、發(fā)育歷期延長(zhǎng)等諸多不利影響[20]?；隗w色相關(guān)基因具有多效性的理論基礎(chǔ)，篩選合適的表型個(gè)體對(duì)提高人工飼料的飼養(yǎng)效率具有重要意義。目前尚不明確不同黑化程度異色瓢蟲個(gè)體取食人工飼料后的適合度是否存在差異。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)體色黑化程度截然相反的異色瓢蟲個(gè)體，黑化型(ML)與淺色型(GR)。黑化型自二齡起，幼蟲蟲體各部分黑化程度明顯加深，成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的黑化程度及斑點(diǎn)面積較野生型(WT)均增大(待發(fā)表)；淺色個(gè)體幼蟲蟲體呈金麒麟色，成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的黑化程度及斑點(diǎn)面積均較野生型減小，且與野生型相比其生物學(xué)特性具有明顯差異[21]。同時(shí)，經(jīng)一系列自交、回交及側(cè)交試驗(yàn)證實(shí)，上述兩個(gè)體色異常個(gè)體為具有穩(wěn)定遺傳特性的突變體。本試驗(yàn)基于上述兩個(gè)突變體，通過(guò)人工飼料飼喂并測(cè)定其生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)參數(shù)及成蟲繁殖力，并與野生型進(jìn)行比較，旨在明確二者取食人工飼料后的適合度差異。本研究結(jié)果對(duì)探究黑化相關(guān)基因的多效性及篩選更具規(guī)模化生產(chǎn)潛力的天敵具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

異色瓢蟲黑化(ML)和淺色突變體(GR)均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的種群，分別將兩對(duì)成蟲飼養(yǎng)于直徑為5 cm的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，每天提供充足的桃蚜并收集卵。將卵孵育在直徑為3 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)并提供浸透水的棉球用以保濕，待卵孵化后，收集1齡幼蟲用于后續(xù)試驗(yàn)。桃蚜種群飼養(yǎng)在室內(nèi)盆栽的辣椒苗上。以上供試?yán)ハx均飼養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，RQX-250；溫度(25 ± 1)℃，光周期 L∶D=16∶8，相對(duì)濕度60 %)，并在相同條件下飼養(yǎng)黃底野生型異色瓢蟲(WT)作為對(duì)照。兩個(gè)突變體及野生型異色瓢蟲各發(fā)育階段的典型形態(tài)特征如圖1 所示。

1.2 人工飼料配制

按照 Sun 等[22]所述配方及方法(稍有優(yōu)化，成分見(jiàn)表1)配制人工飼料，且將所得人工飼料分裝到1.5 mL離心管中并保存于-20 ℃ 冰箱，用于后期飼喂試驗(yàn)。

表1 異色瓢蟲基礎(chǔ)人工飼料配方

1.3 人工飼料飼喂

將黑化、淺色和野生型初孵幼蟲單頭飼養(yǎng)在3 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)(黑化與淺色型分別飼養(yǎng)60頭幼蟲，野生型飼養(yǎng)40頭)，提供新鮮的人工飼料和浸透水的棉球用以保濕。每天觀察和統(tǒng)計(jì)幼蟲的發(fā)育和存活情況直到化蛹及羽化，飼料每?jī)商旄鼡Q1次。待成蟲羽化后，收集成蟲(羽化后24～36 h)并稱量(SY204電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司，精確至0.1 mg)。分別計(jì)算1齡發(fā)育至后續(xù)各階段的存活率，并計(jì)算蛹-成蟲的羽化率。在蛹期，收集未能正常羽化的蛹(5 d后仍未羽化)及鞘翅畸形的新羽化成蟲，于相同光照條件下用松下DMC-GH5數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.4 繁殖力測(cè)定

篩選體型正常的個(gè)體，并進(jìn)行配對(duì)，因淺色型新羽化成蟲畸形個(gè)體比例較大，每種表型分別飼養(yǎng)6對(duì)。上述配對(duì)成蟲分別飼養(yǎng)于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每天提供充足的桃蚜并及時(shí)清理培養(yǎng)皿以保證適宜的飼養(yǎng)環(huán)境。待到雌蟲開(kāi)始產(chǎn)卵時(shí)，每天收集卵并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵量，隨后將卵轉(zhuǎn)移至直徑為3 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)加浸透水的棉球用以保濕，并統(tǒng)計(jì)孵化的幼蟲數(shù)。共統(tǒng)計(jì)10 d。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，存活率及羽化率采用2×2聯(lián)表法進(jìn)行分析。發(fā)育歷期、新羽化成蟲體質(zhì)量、產(chǎn)卵量及卵孵化率采用單因素方差分析進(jìn)行比較，并用Tukey HSD 法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率與羽化率

發(fā)育至2齡，黑化型的存活率為100%，顯著高于淺色型(83.30%)及野生型(91.90%)，而淺色型與野生型間無(wú)顯著差異。發(fā)育至3、4齡的存活率在3種表型間均無(wú)顯著差異。發(fā)育至蛹期，淺色型的存活率(70.00%)顯著小于野生型(89.20%)，而黑化型與野生型及淺色型均無(wú)顯著差異。發(fā)育至成蟲，黑化型的存活率(74.07%)顯著高于淺色型，但與野生型(86.50%)差異不顯著(圖2-A)。

3種表型異色瓢蟲的蛹-成蟲羽化率存在顯著差異。其中黑化型的羽化率為100.00%，顯著高于野生型(67.00%)和淺色型(43.00%)，淺色型與野生型的羽化率無(wú)顯著差異(圖2-B)。此外，黑化型羽化成蟲表型全部正常，畸形率(0)顯著低于淺色型(21.4%)與野生型(12.1%)(圖 2-B)。野生型與淺色型畸形個(gè)體的典型表型如圖2-C所示。

2.2 發(fā)育歷期

在1齡發(fā)育過(guò)程中，淺色型的平均發(fā)育歷期(2.8 d)顯著長(zhǎng)于野生型(2.3 d)與黑化型(2.6 d)。3齡時(shí)，黑化型的平均發(fā)育歷期(5.5 d)顯著高于淺色型(4.8 d)和野生型(4.9 d)。4齡時(shí)，黑化型和淺色型發(fā)育歷期均顯著長(zhǎng)于野生型。黑化型幼蟲-成蟲的總發(fā)育歷期為27.15 d，顯著長(zhǎng)于野生型(24.50 d)，但二者均與淺色型(25.9 d)無(wú)顯著差異。此外，2齡及蛹期的發(fā)育時(shí)間在3種表型間均無(wú)顯著性差異(表2)。

2.3 新羽化成蟲體質(zhì)量

3種表型異色瓢蟲新羽化雌雄成蟲體質(zhì)量均存在顯著性差異。其中，黑化型雌成蟲的平均體質(zhì)量(0.018 9 g)顯著高于淺色型(0.014 6 g)，但與野生型(0.016 3 g)無(wú)顯著差異(圖3-A)。黑化型雄成蟲平均體質(zhì)量(0.016 6 g)也顯著高于淺色型(0.013 5 g)，且高于野生型(0.013 3 g)，而淺色型與野生型間無(wú)顯著性差異(圖3-B)。

2.4 繁殖力

黑化、淺色和野生型異色瓢蟲在10 d內(nèi)的日平均產(chǎn)卵量分別為30.4、21.8和25.3粒，黑化型相對(duì)較高但無(wú)顯著性差異；卵孵化率分別為 34.4%、30.5%和46.1%，雖野生型相對(duì)較高，但與其他二者均無(wú)顯著差異(表3)。

表3 不同表型異色瓢蟲成蟲的繁殖力

3 討 論

本研究測(cè)定了異色瓢蟲兩個(gè)體色突變體取食人工飼料后的適合度。結(jié)果表明，黑化型對(duì)人工飼料表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，其1齡幼蟲存活率及蛹-成蟲羽化率均高達(dá)100%，顯著高于淺色和野生型，幼蟲發(fā)育至成蟲的存活率也顯著高于淺色型，且與野生型無(wú)顯著差異。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)黑化型的新羽化成蟲均正常，而野生型及淺色型羽化成蟲中均有部分畸形個(gè)體。上述結(jié)果可能是由以下幾方面的原因造成的。首先，蛹能否正常羽化主要取決于蛹體的營(yíng)養(yǎng)水平。研究表明，異色瓢蟲幼蟲期取食蚜蟲較取食花粉具有更高的羽化率，這主要是因?yàn)榛ǚ鬯瑺I(yíng)養(yǎng)不及蚜蟲造成的[23]。由此推定黑化型的蛹體可能具有更多的營(yíng)養(yǎng)積累。已有研究表明，黑化相關(guān)基因在異色瓢蟲各個(gè)發(fā)育階段均有組成型表達(dá)，其發(fā)生突變可能會(huì)影響整個(gè)發(fā)育階段的食物利用效率，從而影響低齡幼蟲存活和成蟲羽化[24]。其次，瓢蟲取食人工飼料后體內(nèi)可能產(chǎn)生某些有害成分，并隨生長(zhǎng)發(fā)育不斷積累，而黑色素具有免疫防御功能，能降低這些物質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的不利影響[25]。研究表明，黑色素在異色瓢蟲蛹期時(shí)含量最高[24]。因此，黑化型體內(nèi)積累的黑色素可在蛹期為變態(tài)發(fā)育提供良好環(huán)境。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)取食同種人工飼料后，黑化型新羽化雌雄成蟲體質(zhì)量均顯著高于淺色型，且雄蟲體質(zhì)量顯著高于野生型。這進(jìn)一步表明，黑化個(gè)體的取食量或食物利用效率較其他兩種表型有明顯提高。已有研究表明，淺色突變體對(duì)桃蚜的捕食量及新羽化成蟲體質(zhì)量均顯著低于野生型[21]，該研究結(jié)果可進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。另外，黑化型1齡-成蟲的發(fā)育歷期(27.2 d)顯著長(zhǎng)于淺色(25.9 d)和野生型(24.5 d)。上述發(fā)育歷期延長(zhǎng)也是黑化途徑異常所表現(xiàn)出的一種多效性影響。張道偉等[26]發(fā)現(xiàn)，異色瓢蟲體內(nèi)黑色素缺乏會(huì)導(dǎo)致4齡幼蟲發(fā)育歷期縮短，提前化蛹。成蟲體質(zhì)量與體內(nèi)資源分配密切相關(guān)，從而在很大程度上決定其繁殖力[27-28]。在本試驗(yàn)中，黑化型取食桃蚜后的日平均產(chǎn)卵量最高(30.4粒)，淺色型最低(24.8粒)，野生型居中(25.3粒)。上述結(jié)果表明，應(yīng)用人工飼料飼養(yǎng)黑化型異色瓢蟲，所得成蟲在田間取食蚜蟲后將具有相對(duì)較高的繁殖力，可快速擴(kuò)大種群，具有良好的應(yīng)用潛能。

綜上所述，3種表型異色瓢蟲取食人工飼料后，黑化突變體的適合度最高，而淺色突變體的適合度最低，表明黑化程度對(duì)異色瓢蟲的人工飼料利用效率具有明顯影響。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示異色瓢蟲黑化相關(guān)基因的多效性作用及其機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為后續(xù)篩選適于室內(nèi)規(guī)?；曫B(yǎng)的天敵昆蟲提供參考。