馬 敏,朱明川,曾 瑞,武軍艷,馬 驪,李學(xué)才,蒲媛媛,劉麗君,曾秀存,朱文英,孫萬倉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心/甘肅省干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 平?jīng)?744099)

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)北移過程中，育成了一系列能適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境且具有優(yōu)異抗寒性的新品系。油菜的抗寒性可以通過田間試驗(yàn)或室內(nèi)模擬低溫脅迫來評價(jià)，最常用的評價(jià)指標(biāo)是越冬率和春化特性。我國河北、甘肅等地在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜是以強(qiáng)冬性白菜型冬油菜與歐洲冬性甘藍(lán)型冬油菜雜交育成的，探究這些新型強(qiáng)冬性甘藍(lán)型冬油菜與陜西中部及江蘇省甘藍(lán)型冬油菜品種的抗寒性差異對選擇不同生態(tài)區(qū)的適宜品種具有重要意義。

由于每年有大量甘藍(lán)型冬油菜品種參加國家特異性、一致性和穩(wěn)定性測試及多點(diǎn)試驗(yàn)，登記品種數(shù)量逐年增加[1]。育種家為了相同的育種目標(biāo)在品種選育過程中反復(fù)使用相同或類似的優(yōu)良親本，造成品種間遺傳多樣性水平降低、遺傳背景狹窄[2-4]。少數(shù)核心親本的集中利用，使品種間的遺傳差異有明顯的減小趨勢[5]。在育成品種數(shù)量增多的同時(shí)，品種間遺傳多樣性水平降低，從農(nóng)藝性狀進(jìn)行品種鑒別的難度越來越大，對品種鑒別提出了更高要求[6]。

遺傳多樣性是生物適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)，也是生物形成多樣性的基礎(chǔ)，這種多樣性不僅包含物種植物學(xué)表征變異的豐富度，同時(shí)包含著遺傳結(jié)構(gòu)變異情況[7]。SSR標(biāo)記因具有豐富多態(tài)性、共顯性、高度可靠性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于油菜的遺傳多樣性研究。Jeromela等[8]通過利用表型數(shù)據(jù)及RAPD標(biāo)記對30份甘藍(lán)型冬油菜品種進(jìn)行了遺傳多樣性評估。臧珊等[9]利用SSR和SRAP標(biāo)記分析油菜骨干親本的遺傳多樣性，表明恢復(fù)系和保持系群體內(nèi)部遺傳變異大于群體間的遺傳變異。方彥等[10]從252對標(biāo)記中篩選出9對SSR和36對InDel標(biāo)記分析感溫性、抗寒性、品質(zhì)等性狀差異明顯的19份白菜型油菜品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。本研究以32份甘肅省推廣應(yīng)用甘藍(lán)型冬油菜與9份陜西中部及江蘇省甘藍(lán)型冬油菜品種為材料，探究其越冬率及感溫性差異，分析品種間遺傳多樣性及親緣關(guān)系，以期為甘藍(lán)型冬油菜的品種鑒別、指紋圖譜構(gòu)建及不同生態(tài)區(qū)適宜品種選擇等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試甘藍(lán)型冬油菜材料41份，其中來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)28份、天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所4份、咸陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院4份、江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院5份，詳見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

秋播試驗(yàn)：試驗(yàn)材料分別于2020年8月17日和9月4日在天水市武山縣鴛鴦鎮(zhèn)播種，小區(qū)面積6 m2，密度60萬株·hm-2，設(shè)3次重復(fù)，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，于11月20日統(tǒng)計(jì)冬前苗數(shù)，返青后于翌年3月25日統(tǒng)計(jì)冬后成活苗數(shù)，計(jì)算越冬率。

春播試驗(yàn)：2021年4月13日在蘭州市永登縣上川鎮(zhèn)播種，小區(qū)面積6 m2，密度60萬株·hm-2，設(shè)3次重復(fù)，完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，于8月14日統(tǒng)計(jì)每個品種不同生長發(fā)育階段(未抽薹、抽薹未現(xiàn)蕾、抽薹現(xiàn)蕾、開花、結(jié)角)的植株數(shù)，測量薹(株)高，計(jì)算春化率及加權(quán)平均薹(株)高。

表1 供試甘藍(lán)型冬油菜Table 1 Tested Brassica napus

1.3 DNA提取及檢測

苗期采集幼嫩心葉，蒸餾水清洗干凈，液氮冷凍，用全自動低溫組織研磨儀打碎葉片，采用改良CTAB法[11]提取基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性，用紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量濃度，后將濃度稀釋成50 ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR引物合成

從油菜基因組數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/)中選取644對均勻分布于甘藍(lán)型油菜19條染色體上的SSR標(biāo)記進(jìn)行堿基序列信息的統(tǒng)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物的合成。

1.5 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)體系總量為10 μL,其中含5 μL 2×Power Taq PCR Master Mix，2 μL ddH2O，上下游引物各0.5 μmol·L-1，模板DNA(50 ng·μL-1)2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，64℃復(fù)性40 s，72℃延伸50 s，10個循環(huán)，94℃變性40 s，55℃復(fù)性40 s，72℃延伸50 s，34個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR反應(yīng)在PCT-100TM PCR儀上完成，擴(kuò)增產(chǎn)物用30%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經(jīng)固定、銀染、水洗后在凝膠成像系統(tǒng)下掃描成像，用于后續(xù)分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.6.1 越冬率與春化率 所選甘藍(lán)型冬油菜越冬率與春化率分別采用式(1)、(2)進(jìn)行計(jì)算，加權(quán)平均薹高(株高)采用式(3)計(jì)算。采用Microsoft Office Excel 2019和IBM SPSS 19.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

越冬率=(冬后成活苗數(shù)/冬前苗數(shù))×100%

(1)

春化率=[(現(xiàn)蕾+開花+結(jié)角)植株數(shù)/總植株數(shù)]

一是水利投入規(guī)模大幅度增加?！笆晃濉睍r(shí)期，中央累計(jì)安排水利投入3 647億元，是“十五”時(shí)期的1.1倍，水利支出占中央財(cái)政總支出的比重明顯提高。2011—2012年，中央水利投入繼續(xù)大幅度增加，投入總量相當(dāng)于“十一五”時(shí)期的總和。財(cái)政性資金對水利投入的總量和增幅的明顯增加，為實(shí)現(xiàn)2011年中央1號文件提出的“多渠道籌集資金，力爭今后10年全社會水利年平均投入比2010年高出一倍”的目標(biāo)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

×100%

(2)

加權(quán)平均薹(株)高

(3)

式中,x1,x2,…,xn表示薹(株)高，w1,w2,…,wn表示x1，x2，…，xn出現(xiàn)的次數(shù)。

1.6.2 遺傳多樣性指標(biāo)分析 在電泳圖譜中，采取人工方式讀取條帶，根據(jù)不同條帶類型，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，缺失記為“9”，構(gòu)建數(shù)列二維矩陣。用DataFormater軟件[12]將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為其他軟件可識別的格式。利用Power Marker軟件計(jì)算主等位基因頻率和多態(tài)性信息含量(PIC)。用Popgen32軟件[13]計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)。利用NTSYS-PC Version2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)并繪制聚類分析圖，用DCENTER和EIGEN模塊進(jìn)行主成分分析(PCA)。利用Structure2.3.4軟件分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，估計(jì)最佳群體數(shù)K的取值范圍設(shè)置為2～10，將參數(shù)burn-in period設(shè)為10000，MCMC設(shè)為100000[14]，重復(fù)運(yùn)行5次，依據(jù)似然值最大原則選擇合適K值為群體數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型冬油菜抗寒性評價(jià)

2.1.1 越冬率 越冬率是評價(jià)甘藍(lán)型冬油菜品種抗寒性的重要指標(biāo)。越冬率調(diào)查結(jié)果表明(表2)，參試材料在武山縣鴛鴦鎮(zhèn)試點(diǎn)，越冬率為15.56%～94.81%?！?網(wǎng)-295’、‘QL-GAU-30’等品種油菜越冬率均大于80%，抗寒性強(qiáng)，‘天油14號’等品種越冬率為69.12%～78.52%，陜西中部及江蘇省冬油菜越冬率均低于25%，抗寒性最弱。不同生態(tài)區(qū)甘藍(lán)型冬油菜的抗寒性差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，根據(jù)越冬率大小，供試冬油菜可劃分為強(qiáng)冬性、冬性、半冬性、弱冬性等4種類型。

2.1.2 感溫性 參試的41份甘藍(lán)型冬油菜春播后感溫性出現(xiàn)嚴(yán)重分化，田間表現(xiàn)為未現(xiàn)蕾、現(xiàn)蕾、開花、成熟等4種狀態(tài)，部分材料生長發(fā)育狀態(tài)如圖1所示(見 9頁)。甘藍(lán)型冬油菜生長過程中，先抽薹后現(xiàn)蕾，以現(xiàn)蕾作為作物通過春化階段的性狀標(biāo)志?！?網(wǎng)-295’、‘QL-GAU-30’等27個甘藍(lán)型冬油菜春化率為5.5%～36.36%，陜西中部和江蘇省的甘藍(lán)型冬油菜全部通過春化(表3，見6頁)。根據(jù)春化率大小，供試冬油菜可劃分為強(qiáng)冬性、冬性、半冬性和弱冬性等4種類型。

圖1 部分材料春播后田間表現(xiàn)Fig.1 Field performance of some materials after spring sowing

將春化率、越冬率與加權(quán)平均薹(株)高進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(表5，見7頁)，三者間有密切關(guān)系。春化率與加權(quán)平均薹(株)高存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.881，越冬率與春播條件下加權(quán)平均薹(株)高和春化率均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.874和-0.964。

2.2 甘藍(lán)型冬油菜遺傳多樣性評價(jià)

2.2.1 供試引物的篩選 利用分布于甘藍(lán)型油菜基因組19條染色體上的644對引物對41份甘藍(lán)型冬油菜材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖2所示(見 9頁)，篩選出分布于17條染色體上98對多態(tài)性高且條帶清晰的引物(表略)，C06和C07染色體沒有篩選出多態(tài)性引物，占所用引物比例15.2%。

注：M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～41:分別為1～41號參試材料的擴(kuò)增結(jié)果。Note:M:Molecular weight standard;1～41.Amplification results of Participating materials 1～41,respectively.圖2 部分引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of partial primers

表2 甘藍(lán)型冬油菜越冬率比較Table 2 Comparison of overwintering rates of winter Brassica napus

2.2.2 遺傳多樣性分析 由表6可知(見 8頁)，在41份參試材料中共檢測出多態(tài)性引物98對，分布在17條染色體上，平均每條染色體約6對，材料間分子標(biāo)記的多態(tài)性比例為72%。對不同染色體進(jìn)行比較，A01、A04、A05、A06、C04染色體的多態(tài)性比例均超過80%，由此可推測41份甘藍(lán)型冬油菜在這5條染色體上的多態(tài)性差異比較豐富。多態(tài)信息含量(PIC)可以反映微衛(wèi)星DNA變異程度的高低，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該引物為高度多態(tài)信息引物[15]。本研究中，98對引物PIC變幅為0.2691～0.5578(均值0.3958)，位于A04和A05染色體上的SSR引物多態(tài)性豐富，遺傳變異程度高。

表3 參試冬油菜春播后不同生長發(fā)育階段的植株數(shù)所占比例及春化率比較Table 3 The proportion of plant numbers and vernalization rate of winter rapeseed in different growth stages after spring sowing

表4 不同生長發(fā)育階段的植株加權(quán)平均薹(株)高/cmTable 4 Weighted average bolt (plant) height of each growth and development stage

表5 春化率與植株加權(quán)平均薹(株)高和越冬率的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis vernalization rate of with weighted average bolt (plant) height and overwintering rate

在98對引物中，主等位基因頻率范圍為0.5244～0.8084(均值0.7015)；有效等位基因數(shù)(Ne)變幅為1.5165～2.6517(均值1.9323)。期望雜合度(He)最大為0.6088(A04染色體)，最小為0.2902(C05染色體)，均值為0.4313；Shannon信息指數(shù)(I)最大為1.1251(A04染色體)，最小為0.5218(C05染色體)，均值為0.8126；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)最大為0.6012(A04染色體)，最小為0.2866(C05染色體)，均值為0.4255。

2.2.3 聚類分析 通過NTSYS2.1軟件分析，計(jì)算出參試材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS)在0.68～0.97之間，均值為0.82。采用UPGMA法基于遺傳相似系數(shù)對41份甘藍(lán)型冬油菜進(jìn)行聚類分析(圖3)，在GS值為0.73時(shí)，41份材料被分為9類，在第一類中，‘天油16’無法與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育成材料區(qū)分，其原因可能是與之遺傳背景相似，由于環(huán)境或人為因素而存在一定的基因流，也可能是標(biāo)記檢測的位點(diǎn)少所致；‘CFLD-328’、‘低2網(wǎng)-129’的相似系數(shù)最大，均為0.97，說明這兩者可能是同種異名的材料；‘17-2251’與‘寧R101’的相似系數(shù)相同，春播條件下田間表現(xiàn)更接近弱冬性，陜西中部和江蘇品種之間能被區(qū)分開，說明其存在遺傳分化。

圖3 41份甘藍(lán)型冬油菜SSR標(biāo)記遺傳相似聚類圖Fig.3 Genetic similarity clustering map of 41 Brassica napus SSR markers

2.2.4 遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用Structure軟件對41份甘藍(lán)型冬油菜材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=2～6時(shí)，lnP(D)值隨假定亞群K值的增大而不斷增大，參照Evanno等[16]的方法，由ΔK值確定41份甘藍(lán)型油菜材料的最優(yōu)群體數(shù)K值，當(dāng)K=3時(shí)似然值最大，即所分析的甘藍(lán)型冬油菜材料從遺傳結(jié)構(gòu)上可劃分為3個類群，其群體結(jié)構(gòu)圖如圖4所示。

表6 SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性信息Table 6 Amplification polymorphism information of SSR primers

注：綠色表示第1類群包括26份甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)材料，藍(lán)色表示第2類群包括5份天水材料，紅色表示第3類群包括10份陜西省及江蘇省材料。Note:Green means the first group that includes 26 materials from Gansu Agricultural University.Blue means the second ground that includes 5 materials from Tianshui.Red means the third group that includes 10 materials from Shaanxi and Jiangsu Provinces. 圖4 基于SSR標(biāo)記的41份參試材料群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 Population genetic structure of 41 Brassica napus varieties based on SSR markers

2.2.5 主成分分析 用NTSYS軟件構(gòu)建不同品種的二維主成分分析圖以明晰41份參試冬油菜之間的親緣關(guān)系。如圖5所示，第一類群包括26份材料，表現(xiàn)為春化率低、越冬率高、大部分抽薹后只進(jìn)行營養(yǎng)生長；第二類群共4份材料，包括‘低2-808’、‘16-2444’、‘天油14號’、‘天油16號’；第三類群10份材料中除‘17-2251’都可全部通過春化，在甘肅省可作為春油菜種植。主成分分析結(jié)果與聚類圖的表現(xiàn)基本一致。

圖5 41份參試材料的主成分分析二維散點(diǎn)圖Fig.5 Two dimensional scatter plot of principal component analysis for 41 Brassica napus cultivars

3 討 論

3.1 甘藍(lán)型冬油菜越冬性與感溫性差異

西北地區(qū)極端低溫天氣頻發(fā)，甘藍(lán)型冬油菜北移過程中，由于越冬前后油菜生長期短，越冬期漫長，越冬率逐漸降低[17]。為適應(yīng)低溫，形成了特異的生長發(fā)育特性，有機(jī)物向根部積累，形成根頸大、根冠比高等特點(diǎn)[18-20]，這是油菜越冬期抵御低溫環(huán)境的重要屏障，也是形成強(qiáng)抗寒能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。強(qiáng)抗寒性品種冬前匍匐生長，根部發(fā)達(dá)，抗寒較弱的品種地上部生長迅速，而根部較弱[21]。本研究中，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)新育成強(qiáng)冬性甘藍(lán)型油菜越冬率均高于陜西中部和江蘇省甘藍(lán)型冬油菜，表明油菜抗寒性可能與其地理環(huán)境有關(guān)，西北地區(qū)緯度高，冬季寒冷，在長期人工育種選擇與自然選擇中，抗寒性伴隨著選擇而進(jìn)化[22]。

油菜由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)入生殖生長必須經(jīng)歷一段時(shí)間的持續(xù)低溫,才能通過春化階段開花結(jié)果。根據(jù)春化所需的低溫及持續(xù)時(shí)間不同,分為冬性、春性、半冬性等3種類型。春性強(qiáng)的類型通過春化階段要求的溫度較高，時(shí)間較短，冬性品種則相反，半冬性品種介于冬性與春性之間。不同類型甘藍(lán)型油菜在冬播時(shí)，越冬率不同反映其抗寒性差異，而在北方春播時(shí)則能充分反映其春化特性。本研究中參試材料的春化特性存在顯著差異，表現(xiàn)為春化率低、未現(xiàn)蕾的植株比例高等特性。陜西中部和江蘇省的9份甘藍(lán)型冬油菜與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)新育成的一系列強(qiáng)冬性甘藍(lán)型油菜和天水育種材料存在較大差異，植株全部通過春化作用，甚至完成整個生育期，且部分表現(xiàn)為早熟。

甘藍(lán)型冬油菜春播后，通過觀察田間植株生長發(fā)育特性即可對其抗寒性進(jìn)行劃分[21]。春化率與不同生長發(fā)育特性的加權(quán)平均薹(株)高建立多元回歸方程結(jié)果表明，春化率低時(shí)，春播難以抽薹現(xiàn)蕾進(jìn)入生殖生長，加權(quán)平均薹高也較低；春化率越高，則成熟期的加權(quán)平均株高越高。春化率與越冬率相關(guān)性分析顯示出兩者呈顯著負(fù)相關(guān)。冬油菜春播時(shí)春化特性表現(xiàn)出極顯著的變異性，這些變異與春化結(jié)果的差異性可以反映出抗寒性強(qiáng)弱的變異，可用于評價(jià)甘藍(lán)型冬油菜的抗寒性。

3.2 甘藍(lán)型冬油菜遺傳多樣性差異

群體的遺傳多樣性水平越高說明對新環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[23]。98對多態(tài)性好的SSR引物共檢測出443個基因型，個體間存在共有基因型的現(xiàn)象，多態(tài)性比率為72%。41份品種在A01、A04、A05、A06、C04染色體這5條染色體上的多態(tài)性差異比較豐富，其中A04染色體的平均Shannon信息指數(shù)最高、期望雜合度最大、平均Nei’s基因多樣性指數(shù)最大，表明位于A04染色體上的SSR引物多態(tài)性豐富，遺傳變異程度高。遺傳多樣性結(jié)果表明參試材料間有豐富的多態(tài)性，反映出材料間的遺傳差異，研究中發(fā)現(xiàn)特異性的條帶有利于后續(xù)進(jìn)一步研究。

聚類分析與群體遺傳結(jié)構(gòu)特征體現(xiàn)了一定的區(qū)域性分布，這與王艷紅等[24]的研究結(jié)果相近，然而也有個別材料沒有聚到一起，可能是因?yàn)橥挥N單位的材料抗寒性強(qiáng)弱不同，不能完全代表各個地區(qū)的特征。陜西中部和江蘇省冬油菜品種均為雜交種，遺傳多樣性水平較高，與許鯤等[25]的研究結(jié)果相同，即雜交種整體多樣性水平要高于常規(guī)品種。利用SSR分子標(biāo)記能較好區(qū)分甘肅省甘藍(lán)型冬油菜與陜西中部及江蘇省甘藍(lán)型冬油菜品種的遺傳差異，進(jìn)一步印證了不同生態(tài)類型甘藍(lán)型油菜品種間的遺傳差異大于相同生態(tài)類型品種間的研究結(jié)果[26]。本研究在41份甘藍(lán)型冬油菜中獲得的SSR標(biāo)記有助于探究參試材料的親緣關(guān)系,也可用于繪制指紋圖譜，為準(zhǔn)確鑒定甘藍(lán)型冬油菜品種、選配雜交親本組合、推動油菜育種與新品種保護(hù)提供分子生物學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

甘藍(lán)型冬油菜越冬性與春化結(jié)果的差異性反映出抗寒性強(qiáng)弱的變異，聚類劃分為強(qiáng)冬性、冬性、半冬性及弱冬性等4種類型。甘肅省生產(chǎn)應(yīng)用甘藍(lán)型冬油菜與陜西中部及江蘇省現(xiàn)推廣應(yīng)用甘藍(lán)型冬油菜品種的越冬率、春化率和加權(quán)平均薹(株)高之間顯著相關(guān)。遺傳多樣性分析和聚類分析表明，參試材料存在較豐富的遺傳多樣性，且陜西中部及江蘇省甘藍(lán)型冬油菜遺傳多樣性水平整體高于甘肅省生產(chǎn)應(yīng)用甘藍(lán)型冬油菜。