張文文，楊海波，馬 玲，安明遠，申佳麗，曹云娥

(寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

近年來設施西瓜普遍出現過度施用化肥、農藥及高復種指數等現象，由此導致了土壤肥力下降、連作障礙及生態(tài)功能退化等一系列問題[1-2]，嚴重地制約了我國設施西瓜產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

生物炭有較大的比表面積、豐富的化學官能團和較強的離子交換能力，從而具有高效的土壤改良作用[3]。隋陽輝等[4]發(fā)現高施量生物炭可有效促進土壤養(yǎng)分固持，低施量生物炭可顯著提高玉米單株干物質積累。李大偉等[5]研究表明土壤添加生物碳可顯著提高番茄產量和氮素利用率。有研究證明，覆蓋白三葉草能夠有效減少氮肥的投入、改善土壤的微生態(tài)環(huán)境并抑制田間雜草生長[6-7]。李青梅等[8]研究表明，覆蓋白三葉有利于增加土壤微生物多樣性并提高土壤有機質和碳氮含量。作為“土壤改良工程師”，蚯蚓具有提高作物品質、調控土壤生物群落、增加土壤肥力、調節(jié)土壤pH及改變化感物質組成等作用,為緩解設施土壤連作障礙提供了可行性[9-10]。目前利用蚯蚓開展連作障礙改良的研究主要是采用蚯蚓堆肥,曹云娥等[11]從蚯蚓堆肥中篩選獲得的生防菌暹羅芽孢桿菌可有效抑制瓜類枯萎病并具有防病促生能力。Zhao等[12]研究發(fā)現，添加蚯蚓堆肥可以顯著提高土壤細菌多樣性，同時可降解因連作積累的酚酸類自毒物質。另外，有研究表明蚯蚓堆肥可顯著改善土壤質量，從而提高植株的抗性[13]。然而，“作物-蚯蚓”種養(yǎng)模式對連作障礙土壤影響的研究鮮有報道。

本研究從土壤微生態(tài)角度出發(fā),探究生物炭、三葉草與“西瓜-蚯蚓”種養(yǎng)模式對根際土壤細菌群落結構和土壤理化性質的影響，結合PICRUSt分析預測挖掘新的功能類群，旨在確定更加合理的設施種植模式,為解決設施西瓜連作土壤改良提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

試驗于2021年3月17日至6月21日在寧夏銀川賀蘭園藝產業(yè)園(106.33°E,38.58°N)日光溫室內進行，溫室長80 m、跨度8 m、高4 m,東西走向。供試土壤類型為砂壤土，pH值7.67,電導率0.89 mS·cm-1，全氮含量0.15 g·kg-1，有效磷含量11.15 mg·kg-1，速效氮含量13.83 mg·kg-1，速效鉀含量523.67 mg·kg-1。

1.2 供試材料與試驗設計

供試西瓜品種為‘惠玲’，供試蚯蚓為‘赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)’，購買于寧夏萬輝生物環(huán)?？萍加邢薰?，三葉草為‘白三葉(TrifoliumrepensL.)’，生物炭購買于上海海諾炭業(yè)有限公司。

設施蚯蚓種養(yǎng)結合是本課題組經長期研究提出的一種新型且有效的栽培模式：兩條壟規(guī)格為0.4 m×7.0 m(寬×長)。一壟作為養(yǎng)殖壟，用腐熟1個月后的牛糞作為蚯蚓培育壟，蚯蚓投放量為1 670 kg·hm-2，壟上布置2條滴灌管，滴頭間距0.3 m，每日滴水，使養(yǎng)殖壟的濕度達到 55%；另一壟作為栽培壟，將蚯蚓消解牲畜糞便及蔬菜秸稈產生的蚯蚓糞作為西瓜栽培基質，每茬拉秧結束后，種植壟與養(yǎng)殖壟互換，蚯蚓隨滴灌帶水源切換移動到另一壟，蚯蚓不再繼續(xù)投放。覆蓋三葉草：西瓜定植兩周后用水管灑濕空地，平整土地后，將稱重后的種子進行灑施，然后耙蓋上土壤。

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，共設置8個處理，每個處理3個重復，具體處理如表1所示。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.3 土壤樣品采集與理化指標測定

在西瓜拉秧期采用五點取樣法，在每個處理中隨機選擇5株，將西瓜連根拔起后，抖落根際土壤，剔除雜物后混合制樣，每個處理取2份。一份置于室內自然風干，用于測定土壤理化性質，另一份裝入10 mL離心管內置于液氮中保存，用于測定土壤微生物。

用電導率儀測定電導率 (水∶土=5∶1，質量比，下同)；用酸度計測定pH，用凱氏定氮儀測定土壤全氮含量；用等離子體發(fā)射光譜儀測定土壤全磷、全鉀、速效磷和速效鉀含量；用重鉻酸鉀容量法測定有機質含量[14]。

1.4 微生物高通量測序

根據QIAampDNAMiniKit(QIAGENN.V.，德國)說明書對土壤微生物群落總DNA 進行提取，DNA濃度和純度利用Nano Drop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量；用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴增細菌16SrRNA V3-V4區(qū)段。采用IlluminaMiseqPE300測序平臺對PCR擴增產物進行測序。

使用美吉生物云平臺對測序數據進行質控，使用FLASH 1.2.7軟件進行拼接。使用UPARSE軟件，質控后的序列進行 OTU 聚類并剔除嵌合體，OTU相似度設置為97%。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫，設置比對閾值為70%[15]。為了預測微生物群落的代謝功能，使用PICRUSt從16S rRNA數據生成功能圖譜。

1.5 數據分析

采用Excel 2010進行數據整理及表格制作，采用SPSS 24.0軟件進行顯著性(P<0.05)檢驗，利用QIIMEI 1.80軟件進行α多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理土壤根際化學性質

由表2看出。CK處理土壤pH最高(7.99)，電導率最低(0.61 mS·cm-1)。BT處理有機質含量最高(124.34 g·kg-1)，CK處理有機質含量最低(65.76 g·kg-1)，CK比BT處理有機質含量降低了89.08%；T處理與V處理速效氮含量無顯著差異且高于其他處理；BTV處理土壤速效磷含量最高，BT處理次之。BV處理速效鉀含量顯著高于其他處理；TV處理土壤全氮含量最高(0.79 g·kg-1)，較CK處理高75.56%。

2.2 不同處理根際土壤細菌多樣性指數

不同處理模式細菌多樣性指數如表3所示，除TV處理外，其他處理間Shannon指數無顯著差異，BV處理的Chao1指數顯著高于除B處理之外的其他處理，漲幅為2.06%～9.00%。表明添加生物炭后物種豐富度明顯提高。除了B處理為96.97%，其他處理土壤樣本覆蓋度差異較小,平均值均在97%以上,說明西瓜根際土壤樣本微生物文庫覆蓋度高。

表2 不同處理土壤化學性質Table 2 Soil chemical properties under different treatments

表3 不同處理根際土壤細菌的Alpha多樣性分析Table 3 Alpha diversity analysis of rhizosphere soil bacteria under different treatments

2.3 不同處理土壤細菌DNA測序分析

依據物種Venn圖分析各處理根際土壤樣品測得的總OTU數目為7910個(如圖1)，其中共有的OTU數為2 315個，約占總數的29.27%。V處理獨有的OTU數目最多，為131個，約占1.71 %；CK處理獨有OTU數目最少，為73個，約占0.09%；處理B、T、BV、TV、BT和BVT特有的OTU數分別為107、107、128、114、95和101個，分別約占總數目的1.14%、1.14%、1.37%、1.22%、1.01%和1.07%。

2.4 不同處理根際土壤細菌群落結構及優(yōu)勢物種差異

通過數據庫對比對不同處理的土壤細菌進行分類水平注釋，一共得到了45門、156綱、376目、608科、1 211屬和2 553種。構建門水平分類細菌的群落結構如圖 2所示，在不同處理中占主要優(yōu)勢的菌門有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、綠彎菌門 (Chloroflexl)、厚壁菌門(Firmicutes)和酸桿菌門(Acidobacteriota)，其它相對豐度大于1%的主要菌門有芽單孢菌門(Gemmatimonadota)、擬桿菌門 (Bacteroidota)和髕骨細菌門(Patescibacteria)。結果表明，不同處理并沒有改變細菌門水平上的主要組成，但提高了變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等的相對豐度，其中BTV處理的變形菌門、放線菌門、厚壁菌門的豐度值分別較CK增加47.85%、30.47%、27.15%，酸桿菌門較CK降低了48.36%。

采用主成分分析法對西瓜根際土壤細菌群落組成進行分析可知(圖3)，PC1軸和PC2軸對西瓜根際土壤樣本組成差異的貢獻值分別為36.31%和17.12%，兩者共解釋53.43%。PC1可將BTV處理與其他處理相隔開來，說明BTV處理的菌群組成與其他處理相比有明顯不同，并且CK、T、BT與V的處理散點距離極近，表明上述4個處理的菌群組成非常相近。而PC2可將BV、TV處理與其他處理相隔開來，說明BV、TV處理的菌群組成與其他處理也存在較大差異。

通過構建進化分支圖對不同處理利用組間差異顯著影響的物種進行分析(LDA閾值3.5)(圖4，見180頁)。結果表明，門、綱、目、科和屬分類水平中，不同處理中都存在顯著優(yōu)勢物種。門水平分類中，CK處理的鞘脂單胞菌門(Gemmatimonadota)，TV處理的放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，BV處理的放線菌門(Actinobacteriota)與BTV處理的變形菌門(Proteobacteria)均為各處理的顯著性優(yōu)勢菌門。綱水平分類中，T處理的脫鹵球菌綱(Dehalococcoidia)，V處理的厭氧繩菌綱(Anaerolineae)和綠彎菌綱(Chloroflexia)，TV處理的芽孢桿菌綱(Bacilli)和擬桿菌綱(Bacteroidia)，BT處理的(Vicinamibacteria)和酸微菌綱(Acidimicrobiia)與BTV處理的放線菌綱(Actinobacteria)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)均為顯著優(yōu)勢綱。目水平分類中，V處理的熱微菌目(Thermomicrobiales)，TV處理的芽孢菌目(Bacillales)、假諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)與鏈霉菌目(Streptomycetales)，BTV處理的棒狀桿菌目(Corynebacteriales)、微球菌目(Micrococcales)、假單孢菌目(Pseudomonadales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)與伯克氏菌目(Burkholderiales)均為顯著優(yōu)勢目?？扑椒诸愔?，T處理的放線菌科(Actinomarinales)，TV處理的芽孢桿菌科(Bacillaceae)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)與鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，BT處理的鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，BTV處理的假諾卡氏菌科(Pseudomonadaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)與微球菌科(Micrococcaceae)均為顯著優(yōu)勢科。屬水平分類中，V處理的鞘脂單胞菌屬(Sphingomona)，TV處理的芽孢桿菌屬(Bacillus)，BT處理的Vicinamibacteraceae，BTV處理的紅球菌屬(Rhodococcus)與假單胞屬(Pseudomonas)均為顯著優(yōu)勢屬。

2.5 功能預測分析

采用PICRUSt 2對細菌16s擴增子測序數據進行功能預測分析(表4，見181頁)。結果發(fā)現，基于KEGG數據庫進行比對注釋，不同處理土壤樣品中6類重要的一級生物代謝通路細菌相對豐度差異顯著。BTV較BV處理顯著增加了新陳代謝通路細菌的相對豐度，TV較V處理顯著增加了遺傳信息處理、環(huán)境信息處理及生物體系統通路細菌的相對豐度，TV較T處理顯著增加了人類疾病通路細菌的相對豐度，BV較V處理顯著增加了細胞過程通路細菌的相對豐度。

針對不同土壤處理細菌基因二級功能層進行預測分析。如圖 5所示(見 181頁)，各處理土壤微生物群落均有全局概覽通路、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、能量代謝、膜運輸、氨基酸代謝、細胞運動、翻譯、傳染病、細菌、內分泌系統等46個子功能，其中全局概覽通路(40.22%～40.73%)、碳水化合物代謝(9.14%～9.33%)、輔助因子和維生素代謝(8.13%～8.29%)為主要子功能。具體而言，BTV處理的碳水化合物代謝、能量代謝、膜運輸、氨基酸代謝、核苷酸代謝、運輸和分解代謝等38個二級功能預測基因拷貝數最多，V處理的多糖生物合成和代謝的預測基因拷貝數最多，B處理的感官系統的預測基因拷貝數最多，TV處理的翻譯的預測基因拷貝數最多。

圖1 不同處理土壤細菌OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram illustrating OTU distribution of bacteria of different soil

圖2 不同處理土壤門水平上物種相對豐度分布Fig.2 Relative read abundance of rhizobacteria community structures at the phylum level in different samples

圖3 不同處理土壤細菌群落結構分析Fig.3 Analysis of soil bacterial community structure in different land use types

3 討 論

本研究表明，生物炭、三葉草和蚯蚓種養(yǎng)施用于土壤后，土壤pH值顯著降低。尤其是添加三葉草后，土壤pH降為7.72，分析認為與三葉草促進了土壤有機酸和腐殖酸的形成，進而導致土壤pH降低[16]；各處理土壤電導率均顯著增加，原因可能是與生物炭和三葉草本身含有較多的可溶性鹽或與有機質分解釋放的鹽分有關。生物炭、三葉草及蚯蚓種養(yǎng)可顯著增加土壤養(yǎng)分，其中，BTV處理土壤有機質和速效磷含量顯著提高，BV處理土壤速效鉀含量顯著提高。劉爽等[17]研究表明，玉米-鵝種養(yǎng)模式下土壤速效磷、速效鉀與有機質含量分別提高了368.78%、92.19%和39.34%。邱海燕[18]研究結果表明，生物炭表面含有堿性基團，能夠改善土壤酸堿環(huán)境，土壤速效氮、磷、鉀也會隨之增加。生物炭可改善土壤肥力，增強其對有機質的吸附能力，從而提升土壤有機質含量[19]，這些試驗都與本試驗的結果相一致。TV處理土壤全氮含量較CK處理增加了75.56%，分析認為有以下兩方面原因：(1)蚯蚓對有機質的分解使得物料總量減少，導致全氮含量的相對增加，(2)白三葉草具有固氮作用，可提高土壤含氮量[20]。

圖4 不同處理細菌群落分布Fig.4 Taxon with statistical differences between different bacterial communities

表4 土壤細菌群落的一級功能代謝通路在不同處理中的相對豐度信息Table 4 Variations in composition of soil bacterial functional communities in the different use types

圖5 不同處理土壤樣品預測功能基因二級功能層熱圖Fig.5 Heat map of predicted functional profiles predicted for different plants (hierarchy level 2)

生物炭、三葉草與蚯蚓種養(yǎng)改變了土壤的營養(yǎng)環(huán)境，從而影響根際土壤細菌群落的多樣性[21]。本研究發(fā)現，含有蚯蚓處理的Shannon和Simpson指數均顯著增加，主要原因可能是蚯蚓活動及其分泌物較多，促進了細菌生長和繁殖，從而增加土壤細菌多樣性，這與石琪晗等[22]的研究結果一致。B處理細菌Ace和Chao1指數顯著高于其他處理，這與郭振等[23]的研究結果一致。已有研究表明，生物炭可緩解土壤細菌與作物兩者對營養(yǎng)元素的競爭關系，從而促進了細菌數量生長與繁殖[24]。本研究表明，施用不同添加物后并沒有改變門水平上的細菌主要組成，但提高了變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等的相對豐度。V、BV、TV、BTV處理的變形菌門的相對豐度顯著升高，而厚壁菌門的相對豐度下降。放線菌門主要降解纖維素以及芳香族化合物，對于土壤的礦化起十分重要的作用。變形菌門和放線菌門都是土壤中的有益菌門，在作物中可促進對氮的吸收[25]；另外，酸桿菌屬嗜酸性細菌門，適宜生長于可溶性有機碳含量較低的酸性土壤中[26]。

以往研究關于設施土壤細菌群落的高通量測序分析各處理，主要集中于細菌群落結構，對其功能的研究開展較少。本研究通過PICRUSt功能預測發(fā)現，一級功能層預測基因拷貝數整體趨勢為TV>BV>BTV>V>BT>T>B>CK。在不同處理模式下的西瓜土壤細菌群落均涉及到了六類一級代謝功能通路，其中新陳代謝功能的相對豐度均大于78%，這說明新陳代謝通路在細菌群落中極為重要，這與劉坤和等[27]的研究結果基本一致。BTV處理的新陳代謝功能顯著的高于其它處理，這可能與“生物炭—三葉草—蚯蚓種養(yǎng)—西瓜”的復合生境有關。BV、TV處理中豐度較高的有細胞過程和環(huán)境信息處理這兩類功能基因，說明施入生物質炭后，土壤細菌具有選擇性，土壤細菌功能轉向代謝方向，從而調節(jié)對土壤有機質的保存能力。各處理二級功能層預測基因拷貝數整體趨勢為BTV>BV >V>BT>TV>T>B>CK，其中涉及到相對豐度>1%的通路有 18 類，其中全局概覽通路、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶維生素代謝和能量代謝為主要功能通路。碳水化合物代謝與土壤中溶磷和固氮有關，利于作物的磷、氮循環(huán)[28]。輔酶維生素和能量代謝功能均與細菌固碳和光合作用有關[29]。氨基酸代謝有助于細菌對氨基酸的利用及微生物的繁殖[30]。BTV、BV處理中氨基酸代謝功能顯著高于其它處理，表明蚯蚓種養(yǎng)方式改善了土壤理化性質，有效地促進了土壤微生物生長。目前PICRUSt2功能預測著重于菌群功能進行分析，且具有十分強大的應用性，但其預測范圍有較大的局限性，后續(xù)研究中需要與熒光原位雜交技術和宏基因組技術相結合進一步闡明生物炭、三葉草與蚯蚓種養(yǎng)對細菌群落功能差異的影響。

4 結 論

(1)添加生物炭有助于增加土壤有機質含量，較CK提高了76.41%。三葉草的添加有助于提高壤速效氮、全氮含量，分別提高55.82%、66.67%。蚯蚓種養(yǎng)模式能夠提高土壤速效養(yǎng)分。生物炭、三葉草配合蚯蚓種養(yǎng)有利于提高土壤養(yǎng)分，同時可以顯著降低土壤pH值，達到改良堿性土壤的效果。

(2)BTV處理的Shannon指數最高，BT處理的Simpson指數較T處理高出56.52%，而B處理Ace、Chao1指數均最高。

(3)不同土壤處理并沒有改變細菌門水平上的主要組成，但提高了變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等的相對豐度，其中BTV處理的變形菌門、放線菌門、厚壁菌門的豐度值分別較CK增加47.85%、30.47%、27.15%，酸桿菌門較CK降低了48.36%。

(4)PICRUSt功能分析預測表明，在不同土壤處理模式下的土壤細菌群落均涉及到了6類一級代謝功能通路與48類二級功能代謝通路，其中BTV處理的新陳代謝功能和氨基酸代謝功能顯著高于其它處理，BV和TV處理的細胞過程和環(huán)境信息處理功能基因豐度顯著增加。

綜上所述，從改善連作土壤養(yǎng)分與提高細菌群落多樣性的角度來看，生物炭、三葉草配合蚯蚓種養(yǎng)的綜合效果優(yōu)于其他處理。