何廣輝 陳松
年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration, AMD)是一種多因素誘發(fā)的與年齡相關(guān)的黃斑疾病。早期病變僅表現(xiàn)為玻璃膜疣形成,對患者視功能影響較小。進展期病變分為干性和濕性:干性AMD病變特點為緩慢進展的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞變性及光感受器細胞凋亡,最終表現(xiàn)為地圖樣萎縮,患者視力低下;而濕性AMD則以脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成為主要病變特征,由于CNV管壁結(jié)構(gòu)不完善常自發(fā)破裂導致引起視網(wǎng)膜下出血,脂質(zhì)沉積及纖維瘢痕形成,破壞RPE細胞,繼而光感受器細胞損傷,造成的永久性中心視力喪失[1]。兩種類型AMD的結(jié)局均以RPE結(jié)構(gòu)遭到破環(huán)而告終。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是維持人體血管系統(tǒng)平衡的重要因子[2],在眼底,VEGF主要由RPE分泌產(chǎn)生,正常量的VEGF對脈絡膜血管的構(gòu)建及維持穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用,但當眼部內(nèi)外環(huán)境遭受刺激,RPE分泌VEGF水平異常時,眼底病變就會產(chǎn)生[3]。VEGF家族包含5個亞族:A、B、C、D和胎盤樣生長因子(placenta growth factor,PGF),VEGF-A與眼內(nèi)新生血管生成密切關(guān)聯(lián)[4]。研究表明兩種類型AMD的發(fā)病過程中,VEGF-A水平均表達異常[5]。本文歸納近年相關(guān)文獻,就RPE與VEGF-A之間的相互關(guān)系,及二者在AMD發(fā)病進程中的相互作用進行綜述。
1.眼球發(fā)育過程中的RPE與VEGF-A 在胚胎發(fā)育第9周,VEGF-A即開始在胚眼內(nèi)表達,在此期間,視泡具有多分化潛能,每個視泡細胞均表達相同的轉(zhuǎn)錄因子,使其具有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N眼部細胞的能力[6]。在眼發(fā)育過程中早期VEGF-A的表達作用之一是促進脈絡膜發(fā)育,使脈絡膜在視杯形成時環(huán)繞在外,此后VEGF-A進一步調(diào)節(jié)脈絡膜血管化過程。視網(wǎng)膜多種細胞均可以產(chǎn)生VEGF-A,例如節(jié)細胞和Muller細胞等,但主要來自于RPE的分泌[7]。在經(jīng)過RPE細胞去VEGF化處理的鼠模型中,脈絡膜毛細血管不發(fā)育,RPE表現(xiàn)為不連續(xù)的單層結(jié)構(gòu)[8]。在產(chǎn)后第一周,RPE細胞開始與其周圍散在表達的VEGF受體(vascular endothelial growth factor recepter,VEGFR)2結(jié)合,光感受器在產(chǎn)后第7周開始形成外層和突觸,而大約在產(chǎn)后第8周,視網(wǎng)膜深層血管復合體開始發(fā)育[9]。中和RPE細胞分泌的VEGF-A將導致細胞死亡,而在體內(nèi)中和VEGF-A則導致RPE/脈絡膜復合體的短暫缺陷,包括液泡化,光感受器外層的喪失及脈絡膜毛細血管窗減少,這證實了RPE中VEGF-A自分泌的作用及脈絡膜毛細血管的旁分泌作用[10]。Byeon等[11]研究證實通過VEGFR2/PI3K/Akt等細胞因子調(diào)節(jié)的VEGF自分泌通路增強了氧化應激條件下RPE細胞的存活率。
2.體內(nèi)外VEGF-A抑制后對于RPE的影響 VEGF-A不僅影響RPE細胞的生存,而且影響RPE功能。體外研究顯示,與貝伐單抗共培養(yǎng)的RPE細胞吞噬作用明顯減弱[12]。RPE的微絨毛結(jié)構(gòu)由內(nèi)部密集的肌動蛋白束構(gòu)成,并包括EBP50和埃茲蛋白,VEGF-A在維持RPE微絨毛的結(jié)構(gòu)中發(fā)揮了重要作用[13]。先兆子癇的患者由于可溶性VEGFR1的過表達,顯示出足細胞埃茲蛋白的減少[14];與此類似的是,埃茲蛋白去除的鼠模型顯示出RPE頂部微絨毛減少及底部內(nèi)折[15],上述研究提示我們在VEGF抑制后,光感受器外節(jié)由于微絨毛結(jié)構(gòu)破壞會吞噬作用受到影響。這同樣對于目前應用抗VEGF藥物治療AMD起到提示作用,那就是過度的抗VEGF作用會影響光感受器外節(jié)的吞噬作用。
在體內(nèi),持續(xù)性的VEGF-A表達下調(diào)后,RPE和脈絡膜毛細血管均具備自我修復能力。VEGF受體絡氨酸激酶抑制因子作用導致VEGF-A阻斷時,血管窗樣結(jié)構(gòu)的自我修復受到抑制,例如脈絡膜血管叢和腎臟,只有VEGF-A阻斷被解除,毛細血管才會重新生長[16]。在全身VEGF抑制狀態(tài)下,局部RPE分泌的VEGF-A增加則對于RPE的再生起到了補償作用。此外,在氧化應激條件下,神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達增加會增強RPE生存率,對于RPE的再生也發(fā)揮了一定作用[17]。在VEGF抑制狀態(tài)下,VEGF-A表達反饋性上調(diào)在鼠類早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型中亦可觀察到,在注射抗VEGF藥物后第一天,視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF-A的水平明顯增加[18]。在單獨及聯(lián)合使用抗血管生成藥物的研究中也觀察到了補償性的VEGF-A增加[19]。在體內(nèi)其他部位,VEGF抑制將導致不同的結(jié)構(gòu)損傷,例如腦部脈絡叢血管灌注的降低,眼部視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡,以及腎小球內(nèi)皮細胞增生等[20]。在體外試驗中,VEGF抑制條件下并沒有導致細胞本身反饋性VEGF-A表達上調(diào),這可能是外界培養(yǎng)系統(tǒng)沒有完整復制體內(nèi)生長環(huán)境所致[21]。細胞本身存在VEGF-A自分泌可以維持自身增殖,如體外培養(yǎng)的腎足細胞系,隨著細胞分化,VEGF-A及VEGFR2表達均有增加, 此外,表達上調(diào)的VEGF-A使細胞凋亡率降低了40%,而VEGF抑制后將導致凋亡率提高2倍[22]。在體內(nèi),VEGF抑制的首要副作用是蛋白尿,常常繼發(fā)于腎小球毛細血管的損傷,因而對于正常的腎足細胞及RPE細胞, VEGF抑制將導致組織損傷及毛細血管滲漏[23]。所以針對于眼底局灶性的CNV,抗VEGF治療對于局部異常高分泌的VEGF-A具有良好抑制作用,從而使CNV病灶縮小,局部水腫減輕;但對于病灶區(qū)以外的正常RPE的基礎分泌VEGF-A同樣具有抑制作用,這就會為正常RPE細胞帶來損傷的風險。
RPE/脈絡膜復合體是由RPE,Bruch’s膜及脈絡膜等高分化組織構(gòu)成,其頂部和基底部的VEGF-A具有不同的功能:頂部分泌的VEGF-A具有神經(jīng)保護作用,而基底部分泌的VEGF-A具有維護脈絡膜毛細血管的作用,并且基底部分泌的VEGF-A要高于頂部[24]。
1.PGF與VEGF-A PGF主要是RPE/脈絡膜復合體基底部分泌產(chǎn)生,頂部分泌極少。在健康組織中,PGF不會產(chǎn)生任何作用,而當缺血狀態(tài)及病理性血管形成時,PGF則與VEGF-A協(xié)同發(fā)揮作用[25]。迄今為止,PGF的生理作用仍未被完全闡明,其在生理性血管生產(chǎn)成過程中的作用微乎其微,但在脈絡膜中大量分泌的PIGF則具有重要意義,即提高VEGF-A的效力[26]。因此,PIGF與VEGF-A在維持脈絡膜穩(wěn)定過程中共同發(fā)揮了作用。
2.轉(zhuǎn)錄因子對于VEGF-A及PIGF分泌的調(diào)節(jié) 在VEGF-A分泌過程中,轉(zhuǎn)錄因子NF-KB和SP-1發(fā)揮了作用。SP-1抑制VEGF-A的作用非常強,這與肺癌細胞中的研究相吻合[27]。而細胞因子誘導的RPE細胞分泌VEGF-A則不受SP-1調(diào)節(jié),證實SP-1僅是基本通路的組成部分而非決定部分[28]。p38蛋白則主要是影響RPE/脈絡膜復合體基底部的VEGF-A分泌,其不僅僅在VEGF-A的基礎分泌時發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,在高溫情況下,p38蛋白也能夠促進VEGF-A分泌;但對于氧化應激狀態(tài)下VEGF-A的高表達,p38蛋白則未發(fā)揮明確作用[29]。這提示在不同病理狀態(tài)下,相應的細胞內(nèi)信號通路參與了RPE/脈絡膜復合體頂部及基底部的VEGF分泌調(diào)節(jié)。在氧化應激狀態(tài)下RPE細胞通過自我保護機制保護光感受器,而高溫狀態(tài)時,脈絡膜循環(huán)則發(fā)生了改變,因此,VEGF的分泌是根據(jù)內(nèi)外刺激不同情況的精密調(diào)節(jié)的[30]。VEGFR-2參與了RPE/脈絡膜復合體頂部VEGF-A調(diào)節(jié),并且只存在于RPE/脈絡膜復合體中,通過VEGFR-2參與的頂部VEGF-A分泌調(diào)節(jié)顯示了RPE的自分泌作用,這顯示了RPE對抗氧化應激的自我保護功能[31]。NF-KB和SP-1不僅對VEGF-A起到調(diào)節(jié)作用,而且對于PGF也能進行調(diào)節(jié),在胚胎腎細胞中,NF-KB對于PGF的表達起到了明顯調(diào)節(jié)作用[32]。另有研究證實了RPE/脈絡膜復合體基底部PGF的調(diào)節(jié)主要通過VEGFR-2來實現(xiàn),但PGF并沒有與VEGFR-2直接捆綁,提示了VEGF-A有可能通過VEGFR-2活化來上調(diào)PGF表達,這就證實了PGF和VEGF-A協(xié)同發(fā)揮作用的觀點33],因此抑制PGF的對于病理性新生血管生成也能起到抑制作用。
3.補體調(diào)節(jié)蛋白CD46對于RPE分泌VEGF-A的調(diào)節(jié) 補體系統(tǒng)激活對于促進RPE細胞或是AMD動物模型分泌VEGF具有促進作用[34]。Vogt等[35]通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn),在人眼RPE基底部,CD46是唯一的補體激活膜限制性調(diào)節(jié)因子。而盡管CD46 與RPE萎縮之間的關(guān)系仍未能完全闡明,但CD46在人bruch’s膜表面RPE細胞維持穩(wěn)態(tài)方面起到了關(guān)鍵作用[36]。地圖樣萎縮患者的RPE表達CD46明顯下降,并且是漸進性的[37],因此,CD46是健康RPE表型的重要組成部分,而CD46缺失將導致疾病進展。研究發(fā)現(xiàn)RPE-CD46表達改變將逐漸導致視網(wǎng)膜形態(tài)改變,即從健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈貓D樣萎縮,而在疾病早期,也就是RPE細胞形態(tài)正常時,就能夠檢測出CD46表達的變化[37]。這說明在普通粘附機制作用下,存在由RPE細胞關(guān)聯(lián)蛋白構(gòu)成的功能單元,來維持RPE的正常形態(tài)而避免增生或遷移。有研究顯示,CD46陰性實驗鼠由于補體抑制不足,VEGF分泌量增加而更容易產(chǎn)生實驗性CNV,并且經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染的人CD46表達增加能夠降低補體介導的實驗鼠眼部損傷[38]。這說明在像AMD這類疾病發(fā)展過程中,CD46起到了視網(wǎng)膜保護作用。
1.濕性AMD 在濕性AMD中CNV突破RPE滲透到視網(wǎng)膜下間隙,使RPE屏障被破壞,從而使RPE得功能受損[39]。局部異常分泌增多的VEGF-A不僅僅刺激內(nèi)皮細胞增殖和遷移,促進新生血管生成,它還能起到破壞RPE屏障的作用[40]。研究發(fā)現(xiàn),在體外用VEGF-A處理單層RPE后,RPE的屏障作用減弱,增加了跨屏障的分子流動[41]。人類RPE細胞除了表達VEGF-A之外,還表達VEGF-A受體,包括VEGFR1和VEGFR2。研究顯示VEGF-A不僅在VEGFR1上游通路的激活中起到重要作用,還可以誘導VEGFR2下游通路的激活,VEGF-A可以通過自分泌或旁分泌的途徑激活RPE細胞VEGFR2的信號通路,總而促進nAMD病程不斷進展,RPE細胞不斷損傷[42]。而VEGF-A高分泌的鼠類動物模型顯示出隨著年齡增長而逐漸發(fā)展的RPE屏障功能減弱,使得緊密連接處的屏障蛋白細胞質(zhì)解聚,在此類鼠類模型中,隨著RPE屏障破壞,CNV發(fā)生發(fā)展[43]。因此,在濕性AMD的發(fā)展過程中,VEGF-A水平增高與CNV形成和RPE功能異常息息相關(guān)。
2.干性AMD 干性AMD的特征是伴隨年齡增長的RPE細胞和Bruch’s膜的結(jié)構(gòu)逐步破壞,最終造成光感受器結(jié)構(gòu)功能異常[44]。干性與濕性AMD雖然臨床特征不同,但研究顯示,兩類AMD可以交叉發(fā)生,干性AMD患者可以發(fā)展為濕性AMD[45]。遺傳學研究已經(jīng)確定此類進展性AMD的遺傳位點, 有關(guān)基因組研究分析顯示,干性和濕性AMD都與VEGF-A基因位點有關(guān)[46]。動物研究顯示,高VEGF-A表達的鼠類模型中不僅表現(xiàn)出濕性AMD的機構(gòu)特征,而且表現(xiàn)干性AMD的結(jié)構(gòu)特征,這些鼠類模型不僅表現(xiàn)出VEGF-A誘導的RPE屏障損傷,CNV形成并延伸到視網(wǎng)膜下,而且表現(xiàn)出年齡相關(guān)的RPE和視網(wǎng)膜萎縮及RPE下的層狀顆粒物沉積[47]。Ablonczy等[48]研究發(fā)現(xiàn),在高VEGF-A鼠模型中,RPE屏障破壞要早于視網(wǎng)膜異常及光感受器損傷出現(xiàn),研究結(jié)果顯示VEGF-A除了導致CNV形成之外,還通過損傷RPE屏障,影響在RPE細胞和光感受器之間的視黃酸轉(zhuǎn)運途徑,從而導致光感受器功能異常。由此可見,VEGF-A在干性AMD發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。
3.抗VEGF藥物與RPE 抗VEGF藥物已經(jīng)廣泛被用于濕性AMD的治療,并取得了不錯的臨床效果[49]。但是研究發(fā)現(xiàn),在一些病例中長期使用抗VEGF藥物治療,濕性AMD仍然會進展,并且,長時間抗VEGF藥物治療后,黃斑區(qū)會發(fā)生萎縮[50]。正常情況下,RPE分泌合理量的VEGF-A,這對于維持成年人的脈絡膜毛細血管結(jié)構(gòu)非常重要,而長期的VEGF-A抑制會損傷脈絡膜毛細血管,并影響RPE功能,從而導致黃斑萎[51]??筕EGF藥物對于RPE及黃斑的副作用與高VEGF-A表達造成RPE功能異常卻可以同時發(fā)生,長期抗VEGF藥物治療使通過干擾脈絡膜毛細血管的生理VEGF-A分泌而導致黃斑萎縮,而高VEGF表達則是通過造成RPE屏障破換影響視黃酸代謝導致RPE功能異常[52]。這就為濕性AMD的治療提出了新的問題,頻繁的抗VEGF藥物使用有時會起到反作用。
多種細胞因子參與了RPE分泌VEGF-A的調(diào)節(jié),適量的VEGF表達對于眼部的結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要,而當體內(nèi)外環(huán)境因各種刺激受到影響時,此種平衡遭到破壞,AMD就會應運而生。目前抗VEGF藥物已廣泛應用于濕性AMD的治療,但如何使局部過度表達的VEGF-A下調(diào)至正常水平并保持穩(wěn)定,而不是使之一味下調(diào),最終導致RPE功能受損,是我們面臨的新挑戰(zhàn)。未來,如果能開發(fā)新型生物活性制劑選擇性調(diào)整眼內(nèi)VEGF水平,使之高降低升,或許對于濕性乃至干性AMD的治療取得意想不到的成效。