楊秀秀，田 藝，楊忠強

（清華大學 化學系 有機光電子與分子工程教育部重點實驗室，北京 100084）

1 引 言

液晶是介于液態(tài)和晶態(tài)之間的一種特殊物質形態(tài)，它既具有液態(tài)的流動性，又具有晶態(tài)的取向性，呈現(xiàn)光電學各向異性［1］。1998年，美國威斯康星-麥迪遜大學Nicholas L.Abbott課題組首次提出了液晶生物傳感概念［2］。其檢測原理在于液晶分子具有較大的長徑比，可以形成長程有序的取向，而目標物會誘導局部液晶分子發(fā)生取向轉變，繼而被體相液晶放大至微米級別，在偏光顯微鏡下傳導為肉眼可見的光學信號。例如，呈現(xiàn)特異的顏色、亮度和圖案，從而實現(xiàn)對目標物的檢測［3-5］。液晶獨特的光學特性使其在開發(fā)簡單、便攜、免標記、免復雜儀器檢測方面具有重要的研究價值。目前常用的液晶生物傳感器根據(jù)使用液晶體系的不同主要分為3類：基于液晶-固體界面、液晶-水相界面和液晶液滴的生物傳感器［6-7］。相較前兩類體系，基于液晶液滴體系發(fā)展較晚，但因液滴具有較大的比表面積，加之液晶液滴獨特的取向變化和光學性質，使其獲得與日俱增的關注。本文綜述了液晶液滴制備的研究進展及其在生物檢測應用中的成果和發(fā)展趨勢。

2 液晶液滴的取向

液晶檢測常用的小分子液晶為4-氰基-4’-戊基聯(lián)苯（5CB），如圖1（a）所示，這是因為5CB在室溫下具有向列相，并且市售易獲得。液晶液滴有兩種常見取向，例如在液滴兩極出現(xiàn)點缺陷的兩極取向和液滴中心出現(xiàn)點缺陷的徑向取向，其取向示意圖如圖1所示［8］。已有研究表明，液晶液滴的大小會顯著影響液晶液滴的點缺陷和取向，對于直徑大于3 μm的液晶液滴，呈現(xiàn)兩極取向（圖1（b）~（d））；而對于直徑約為700 nm的小液晶液滴，呈現(xiàn)徑向取向（圖1（e）~（g））［8］。另一方面，一些化學和生物物質在液晶液滴表面的吸附和反應可能改變液晶液滴表面錨定能和內部液晶彈性能，誘導液晶液滴取向發(fā)生轉變［6］。例如，當兩親分子在液晶表面吸附，液晶液滴會發(fā)生由兩極取向至徑向取向的轉變［8-9］。使用偏光顯微鏡或者流式細胞儀對液晶液滴兩極和徑向取向的光學信號轉變進行監(jiān)測，即可實現(xiàn)檢測的目的。

圖1 液晶分子結構及液晶液滴取向示意圖。（a）液晶5CB的分子結構；（b）、（c）兩極取向，（e）、（f）徑向取向及兩種取向對應的示意圖（d）、（g）；（b）、（e）液晶液滴在偏光顯微鏡下的圖像；（c）、（f）液晶液滴在明場下的光學顯微圖像。比例尺為5 μm［8］。Fig.1 Structure of liquid crystal（LC）molecule and ori?entation of LC droplets.（a）Molecule structure of 5CB；（b，c）Bipolar orientation，（c，f）radial orien?tation and their corresponding schematic figures（d）and（g）；（b），（e）Polarized light microscopy images；（c），（f）Bright field optical microscopy images.The scale is 5 μm［8］.

值得一提的是，液晶液滴的取向受尺寸大小影響，并且液晶液滴尺寸具有均一性是保證液晶液滴取向發(fā)生同步轉變的關鍵，所以液晶液滴的制備方法會影響其檢測性能。另外，由于液晶分子本身對目標物不具有特異識別能力，因此，需要對液晶液滴表面進行特殊修飾，賦予其特異響應性。綜上，如何可控制備具有精確尺寸和表面化學的液晶液滴成為提高液晶液滴傳感器檢測性能的關鍵。

3 液晶液滴的制備

3.1 超聲法制備液晶液滴

2006年，Nicholas L.Abbott課題組首次報道了利用超聲的方法，實現(xiàn)了液晶液滴的制備［10］。將5CB和水溶液按1∶100體積比混合，10 W超聲處理60 s，即得到了液晶液滴乳液。該工作選取純水和帶正電荷的磷脂水溶液（700 μmol/L 1，2-二月桂?；?sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿（DLEPC））作為分散劑，所用物質的分子結構如圖2所示。由此制備的液晶液滴乳液分別記作5CB-H2O和5CB-DLEPC。

上述得到的液晶液滴，尺寸范圍為1~10 μm。在5CB-H2O液滴界面上的液晶分子維持平行取向，液晶液滴呈現(xiàn)兩極取向（圖2（b））。而對于分散劑為兩親分子DLEPC的液晶液滴體系，DLEPC的疏水烷基鏈可以插入液晶相中，誘導液晶分子形成垂直于界面的取向，使液滴呈現(xiàn)徑向取向（圖2（c））。另外，一些體積較大、且自身有強組裝作用的兩親分子，為促進其在液晶液滴表面的吸附，有報道采用大功率的針尖超聲法混合處理液晶和兩親分子，獲取尺寸范圍在1~5 μm的兩親分子修飾的液晶液滴［11-12］?？傊?，超聲法制備液晶液滴，操作簡單，但是液晶液滴尺寸不夠均一。

圖2 （a）DLEPC的結構式；（b）5CB-H2O液晶液滴和（c）5CB-DLEPC液晶液滴的取向示意圖和光學顯微照片。比例尺為2 μm［10］。Fig.2（a）Structure of DLEPC；Schematic illustrations and optical micrographs of（b）5CB-H2O emulsions and（c）5CB-DLEPC emulsions.The scale bar is 2μm［10］.

3.2 超聲渦流法制備液晶液滴

為了提高液晶液滴的尺寸單分散性，2011年，Nicholas L.Abbott課題組利用連續(xù)超聲和渦流處理制備液晶液滴［9］。首先將2~10 μL液晶加入到1 mL緩沖溶液中，進行10 s的超聲處理，然后在2 500 r/min的渦流條件下處理10 s，經(jīng)過12個循環(huán)后即得到乳白色液晶液滴乳液。該體系中的液晶液滴具有兩極取向，直徑大約4~8 μm。該方法與之前方法相比，所獲得的液晶液滴均一性有所提高，且操作相較于后續(xù)介紹的微流控和膠囊模板法簡單，但仍未能達到尺寸單分散分布。

3.3 微流控法制備液晶液滴

隨著微流控技術的逐漸發(fā)展，使用微流控法制備液晶液滴的技術也獲得越來越多的關注。早在2000年，美國西北大學David A.Weitz課題組首次實現(xiàn)利用簡易微流控裝置制備出液晶液滴［13］。2011年，韓國慶北大學Soo-Young Park課題組利用改進的微流控法成功制備出用于生物檢測相關的液晶液滴，其微流控裝置如圖3所示［14］。該工作使用質量分數(shù)為0.2%聚（1丙烯酸-b-4-氰基聯(lián)苯-4-氧十一烷基丙烯酸酯）（PAA-b-LCP）溶液作為連續(xù)相，5CB作為分散相。連續(xù)相從兩側通道進入，分散相由中間通道進入，兩相在交匯處相遇，形成由PAA-b-LCP包裹的液晶液滴（圖3（a））。通過控制連續(xù)相和分散相的流速，則能得到具有不同尺寸（33~50 μm）且尺寸較均一的液晶液滴（圖3（b）~（d））。

圖3 （a）利用微流控裝置得到液晶液滴的示意圖；在控制通道內連續(xù)相的流速為（b）0.2、（c）0.15和（d）0.1 mL·h-1和分散相流速為0.01 mL·h-1條件下得到液晶液滴的圖像。比例尺為100 μm［14］。Fig.3（a）Schematic illustration of the formation of LC droplets through microfluidic system；LC droplets in the channel were made at flow rates of（b）0.2，（c）0.15，and（d）0.1 mL·h-1 of the continuous phase with a constant flow rate of the dispersed phase of 0.01 mL·h-1.Scale bar is 100 μm［14］.

綜上所述，微流控法制得的液晶液滴尺寸可調、分散窄，同時微流控技術具有快速分析、易集成和重復性好等優(yōu)點，使其在液晶傳感領域顯示出巨大的應用前景［15］。但是，在微流控體系中，液體的流動會對液晶取向產生干擾。其次，微流控方法仍然難以制備小尺寸液晶液滴（<10 μm）。

3.4 膠囊模板法制備液晶液滴

針對缺乏精確可控制備小尺寸（<10 μm）單分散液晶液滴的方法，以及裸露的液晶液滴存在聚并和粘附等問題，在2008年，澳大利亞墨爾本大學Frank Caruso課題組報道了一種基于層層自組裝模板法制備液晶液滴的策略，實現(xiàn)了小尺寸液晶液滴的可控制備［16］。

首先以直徑約為5 μm的二氧化硅顆粒為模板，將其表面接枝3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）實現(xiàn)胺官能化修飾。隨后，將聚電解質多層膜（PEMs）層層組裝到APTS官能化的二氧化硅顆粒表面。之后，利用氫氟酸將二氧化硅顆?？涛g掉，得到空心的PEMs膠囊。最后，將5CB滲透到PEMs膠囊中，即得到了PEMs包裹的液晶液滴（圖4（a））。

該工作研究了兩種類型的PEMs膠囊：聚（4-苯乙烯磺酸鈉）（PSS）和聚烯丙胺鹽酸鹽（PAH）組成的PEMs，及聚甲基丙烯酸（PMA）和聚乙烯基吡咯烷酮（PVPON）組成的PEMs。因為APTS官能化的二氧化硅帶正電荷，因此，首先使用帶負電荷的陰離子聚電解質（PSS或PMA）作為第一層，PAH或PVPON作為第二層，以此類推，層層組裝。該方法可通過改變二氧化硅模板的大小，得到納米/毫米尺寸的單分散液晶液滴。另外，PMA/PVPON層還可以通過暴露在pH 7.5的溶液中破壞體系中氫鍵，以去除PEMs層，得到“裸”液晶液滴（圖4（b）、（c））。

圖4 （a）用于制備單分散液晶液滴的方法示意圖；（b）由二氧化硅顆粒模板制備的5CB-填充的（PMA/PVPON）4膠囊和（c）將PMA/PVPON層解組裝后獲得的5CB液滴在明場下的光學顯微照片［16］。Fig.4（a）Schematic representation of the procedure used to prepare monodisperse emulsion droplets；Bright field optical micrograph of（b）5CB-filled（PMA/PVPON）4 capsules made from silica particles tem?plates and（c）naked 5CB droplets obtained after disassembly of PMA/PVPON layers［16］.

該工作首次提出具有尺寸和表面化學可控的液晶液滴制備方法。液晶液滴表面包裹的半滲透性膠囊殼既可以阻止液滴聚并，又可以通過官能化進而實現(xiàn)液晶液滴的定點錨定?；赑EM選擇的多樣性，該制備方法有助于后續(xù)生物響應性液晶液滴傳感器的設計。

3.5 超重力技術制備液晶液滴

上述液晶液滴的制備方法均受限于小量的實驗體系，不能滿足尺寸小、分布窄液晶液滴大量制備的需求。為此，在2017年，中國清華大學Zhongqiang Yang課題組提出利用超重力技術實現(xiàn)大量、單分散液晶液滴快速、簡易的制備［17］。利用超重力機制備液晶液滴的實驗裝置如圖5所示。其工作原理是在超重力環(huán)境中，使兩相在多孔介質或孔道中產生流動接觸，利用由此形成的巨大剪切力將液體撕裂成微納米級的膜、絲和滴，并不斷重復該過程，直至形成粒徑約為950 nm的液晶液滴。該方法與上述幾種制備方法相比，可以保證液晶液滴具有較好的均一性，制備出大量液晶液滴。該工作為液晶液滴的簡易、可控制備提供了一個新的技術平臺，有望滿足液晶液滴乳液領域工業(yè)化生產的需求。

圖5 超重力機實驗裝置示意圖及其制備出的液晶5CB液滴的偏光圖像［17］Fig.5 Schematic illustration of the high gravity equip?ment setup and 5CB droplets prepared by high gravity technique under polarized light［17］

4 液晶液滴生物傳感器的檢測應用

對于液晶液滴，一些兩親分子在液晶液滴的吸附可以誘導液晶液滴發(fā)生由兩極取向至徑向取向的轉變，此時，若向體系中加入可以將兩親分子解組裝的分子，則液晶液滴會出現(xiàn)由徑向取向至兩極取向的轉變［18］。利用上述液晶液滴的取向轉變，即可實現(xiàn)對特定目標物的檢測。例如，目前通過液晶液滴生物傳感器已經(jīng)實現(xiàn)了對細菌、病毒、蛋白質以及生物分子間相互作用的檢測［9，19-23］。

4.1 液晶液滴檢測和區(qū)分細菌和病毒

2009年，Nicholas L.Abbott課題組報道了利用液晶液滴實現(xiàn)了對不同類型的細菌（革蘭氏陰性和陽性細菌）和病毒（包膜和非包膜型）的檢測區(qū)分［19］。該工作中使用PMA/PVPON膠囊模板法制備得到液晶液滴，隨后通過將液滴置于pH 7.5的溶液中除去PMA/PVPON外殼，得到尺寸約為4.7 μm的裸液晶液滴。研究發(fā)現(xiàn)，如圖6所示，當裸液晶液滴與大腸桿菌（革蘭氏陰性細菌）和A/NWS/Tokyo/67（包膜型病毒）接觸后，會發(fā)生由兩極取向至徑向取向的轉變（圖6（a）、（c）和（f））；而當液晶液滴與枯草芽孢桿菌和黃體微球菌（革蘭氏陽性細菌）以及M13輔助噬菌體（非包膜型病毒）接觸后，液晶液滴保持兩極取向（圖6（b）、（d）、（e）和（g））。研究發(fā)現(xiàn)，當革蘭氏陰性細菌和包膜型病毒與液晶液滴接觸后，其表面的兩親性磷脂會遷移并吸附到液晶液滴表面，由此誘導液晶液滴發(fā)生取向轉變。該體系中的液晶液滴可以靈敏地響應出濃度低至104pfu·mL-1的病毒。該研究結果為檢測、區(qū)分細菌和病毒提供了一種新方法。

圖6 病毒和細菌與裸液晶液滴相互作用以及對應液晶液滴取向的示意圖。（a）徑向取向；（b）兩極取向；在偏光顯微鏡下，液晶液滴與（c）大腸桿菌、（d）枯草芽孢桿菌、（e）黃體微球菌、（f）A/NWS/Tokyo/67病毒和（g）M13輔助噬菌體接觸后的圖像［19］。Fig.6 Schematic of the interaction of viruses or bacteria with naked liquid crystal emulsions.The cartoons depict of（a）radial and（b）bipolar configurations of LC droplets；Polarized light microscopy image of naked 5CB droplets with（c）E.coli.，（d）B.subtilis，（e）M.luteus，（f）A/NWS/Tokyo/67 and（g）M13 helper phage［19］.

2011年Nicholas L.Abbott課題組進一步提出利用液晶液滴對大腸桿菌內毒素進行實時、高靈敏的檢測［9］。內毒素是一種存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁中的細菌脂多糖，對宿主具有毒性，其主要成分為磷脂A（圖7（a））。當前通常使用“鱟試劑”方法實現(xiàn)對內毒素的檢測，但是該方法重復性差且危害鱟生物資源等。

圖7 （a）內毒素的主要組成磷脂A；（b）、（c）液晶液滴在無內毒素時，分別處于明場和偏振光下的顯微圖像及其（d）對應的兩極取向示意圖，紅色箭頭表示液晶液滴在液晶-水相界面處的缺陷；（e）和（f）在含有1 μg/mL內毒素的溶液中，液晶液滴分別處于明場和偏振光下的顯微圖像及其（g）對應的徑向取向示意圖［9］。Fig.7（a）Lipid A portion of endotoxin；（b）Bright-field and（c）polarized light micrographs of an LC droplet in endotox?in-free water and（d）corresponding schematic illustration of the bipolar configuration.The red arrows indicate boojums at the aqueous-LC interface of the droplet；（e）Bright-field and（f）polarized light micrographs of an LC droplet after exposure to endotoxin from E.coli（1 μg/mL）in water and corresponding（g）schematic illustration of the radial configuration［9］.

為解決上述問題，該工作通過超聲渦流法制備得到直徑為4~8 μm的液晶液滴，其在明場和偏光顯微鏡下呈現(xiàn)兩極取向（圖7（b）~（d））。隨后在水中加入濃度為1 μg·mL-1來自大腸桿菌的內毒素后，液晶轉變?yōu)閺较蛉∠颍▓D7（e）~（g））。該研究還發(fā)現(xiàn)液晶液滴的尺寸在大腸桿菌內毒素誘導液晶液滴由兩極缺陷至中心缺陷的轉變起著重要的作用。其中，直徑大于10 μm的液晶液滴對pg·mL-1濃度下內毒素的存在不敏感，維持兩極缺陷；而直徑處于2~6 μm區(qū)間的液晶液滴對pg·mL-1濃度下的內毒素取向轉變響應率超過90%。進一步通過使用氟化硼二吡咯（BODIPY）標記大腸桿菌內毒素的方法證實了內毒素位于液晶液滴的中心缺陷處，并且在短短數(shù)十秒內，液晶液滴表面的磷脂A即可遷移至液滴中心。這表明液晶取向的轉變是由大腸桿菌內毒素在液滴缺陷處驅動的。該方法對大腸桿菌內毒素的檢測靈敏度，比由表面錨定能量變化驅動液晶取向轉變的液晶-水相平面體系高出6個數(shù)量級。并且，與鱟試劑法相比，該工作利用液晶液滴檢測內毒素，具有免標記、快速、生態(tài)友好且易操作等優(yōu)點［24］。

上述液晶液滴體系檢測的大腸桿菌需要使用偏光顯微鏡對大量單個液晶液滴進行成像觀察，該過程繁瑣且耗時。因此，2021年Nicholas L.Abbott課題組與美國威斯康辛-麥迪遜大學Victor M.Zavala課題組合作，將液晶液滴傳感器與機器學習方法結合，實現(xiàn)了對內毒素不同細菌來源的分類及定量［25］。來自不同細菌的內毒素可能具有不同的磷脂A結構，例如來自銅綠假單胞菌、大腸桿菌和明尼蘇達沙門氏菌的磷脂A分別具有5條、6條或7條疏水的碳鏈。內毒素的不同結構會影響液晶液滴的取向轉變行為，由此導致液晶取向變化帶來的光側散射強度和前向散射強度不同。通過流式細胞儀測量液晶液滴的光散射數(shù)據(jù)，結合機器學習技術，從而實現(xiàn)在8個數(shù)量級（0.01 pg·mL?1~1 μg·mL?1）范圍內對細菌來源的分類和內毒素濃度的定量，有望應用于水質監(jiān)測。該工作不僅提供了一種簡單、精確的內毒素檢測方法，而且將液晶體系與機器學習技術結合，實現(xiàn)高效、精確的數(shù)據(jù)處理［26-27］。

2020年，美國威斯康辛-麥迪遜大學David M.Lynn課題組報道了利用液晶液滴實現(xiàn)對細菌群體感應信號和毒性的監(jiān)測［20］。許多細菌往往通過化學信號實現(xiàn)群體感應來調整群體行為，這些化學信號的強度在一定范圍內會隨著細菌群落的尺寸成比例增加。因此，若能實現(xiàn)對特定細菌化學信號的檢測，就能實現(xiàn)對細菌群體感應和毒性的監(jiān)測。該工作以致病性革蘭氏陰性細菌銅綠假單胞菌產生的具有兩親性的化學信號分子N-?；?l-高絲氨酸內酯（AHL）為研究對象，探索液晶液滴對其響應性。首先通過渦流法制備得到尺寸小于10 μm的液晶液滴，隨后利用流式細胞儀測量液晶液滴側散射強度與前向散射強度來確定液晶液滴取向。研究發(fā)現(xiàn)AHL可以吸附在液晶液滴表面，誘導液晶發(fā)生由兩極取向至徑向取向的轉變（圖8（a）），表明液晶液滴可以對細菌生長培養(yǎng)物產生的AHL做出響應性。隨著細菌產生AHL的量不斷增加，發(fā)生取向改變的液晶液滴百分比也不斷增加（圖8（b））。該研究結果表明，液晶液滴體系為細菌群體感應和毒性的檢測以及細菌群落的原位監(jiān)測提供了一個新平臺。

圖8 （a）利用液晶液滴實現(xiàn)對細菌群體感應檢測的示意圖；（b）液晶液滴在37°C下培養(yǎng)6 h（白色條帶）、12 h（黑色條帶）和24 h（灰色條帶）90 min后從兩極取向轉變?yōu)閺较蛉∠虻陌俜直?。第I-VI列顯示了使用LB培養(yǎng)基對照（I）或使用指定菌株和條件的結果。結果是3個獨立實驗的平均值［20］。Fig.8（a）Schematic illustration of using LC droplets to sense bacterial quorum；（b）Percentage of LC drop?lets transformed from bipolar to radial after 90 min of incubation with cultures grown at 37 °C for 6 h（white bars），12 h（black bars），and 24 h（gray bars）.Columns I~VI show results of using an LB medium control（I）or using the indicated bacterial strains and conditions.Results are the average of 3 independent experiments［20］.

4.2 液晶液滴檢測酶活性

2009年，Nicholas L.Abbott課題組利用磷脂L-二棕櫚酰磷脂酰膽堿（L-DLPC）修飾的液晶液滴實現(xiàn)對磷脂酶A2（PLA2）的酶活性檢測［28］。該實驗過程如圖9所示，首先通過模板法制備了直徑約為8.0 μm的液晶液滴，然后兩親性磷脂自發(fā)吸附到液晶液滴表面，誘導液晶液滴由兩極取向轉變?yōu)閺较蛉∠?。再將上述L-DLPC修飾的液晶液滴與PLA2混 合 后，PLA2將L-DLPC水解導致其在液晶液滴表面解吸附，引起液晶液滴發(fā)生由徑向到兩極取向的轉變，實現(xiàn)對PLA2酶活性的檢測。與之前報道的基于液晶-水相平面界面的檢測體系相比，液晶液滴體系對PLA2的響應速度提高了約5倍［21］。

圖9 （a）L-DLPC修飾的5CB液滴（直徑8.0 μm）分散在TBS緩沖液（pH 8.9，5 mmol/L CaCl2）中，與1 nmol/L濃度的PLA2接觸，經(jīng)歷從徑向到兩極取向轉變的示意圖；（b）、（c）液晶液滴在與1 nmol/L PLA2接觸后，取向轉變過程中在明場和偏光顯微鏡下對應的圖像［28］。Fig.9（a）Schematic illustration of process by which L-DLPC-decorated 5CB droplets（diameter of 8.0 μm）dispersed in TBS buffer（pH 8.9，5 mmol/L CaCl2）in contact with 1 nmol/L con?centration of PLA2 undergo anchoring transitions from radial to bipolar configurations；（b），（c）Cor?responding bright-field，and polarized images indi?cated changes in the optical appearance of the LC droplets in contact with 1 nmol/L PLA2［28］.

2014年，中國淡江大學Chih-Hsin Chen課題組報道了利用寡肽修飾的液晶液滴檢測蛋白酶活性［29］。該工作首先設計了含有酶切位點的兩親性寡肽，讓其吸附在液晶液滴表面，誘導液晶液滴形成徑向取向。隨后將液滴與蛋白酶接觸，酶解作用破壞了兩親性寡肽在液晶液滴表面的吸附，導致液滴恢復兩極取向，由此實現(xiàn)了對α-糜蛋白酶和胰蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的檢測。2019年，Zhongqiang Yang課題組報道了通過設計兩親性多肽，利用液晶液滴實現(xiàn)對胰蛋白酶的檢測［30］。該工作不僅為構建多肽修飾的液晶液滴提供了簡單、通用的方法，而且可以通過設計合成特定多肽序列，實現(xiàn)對特定酶活性以及生物分子間相互作用的檢測。

以上利用液晶液滴檢測酶活性的方法都是基于酶解反應破壞兩親分子在液滴表面的吸附，誘導液晶液滴發(fā)生取向變化實現(xiàn)的。除此之外，還可以利用酶解反應引起環(huán)境pH的變化，間接影響兩親分子在液晶液滴表面的吸附，進而誘導液晶取向發(fā)生轉變。目前已經(jīng)實現(xiàn)對溶血素、青霉素酶等酶活性的檢測［31-32］。

4.3 液晶液滴檢測蛋白及分子間相互作用

液晶液滴體系還可用于蛋白-蛋白相互作用的研究。2011年，新加坡國立大學Kun-Lin Yang課題組首次報道了將液晶液滴傳感器與抗原-抗體相互作用結合，實現(xiàn)蛋白免疫分析［22］。該工作選擇了抗人免疫球蛋白G（AIgG）和抗人血清白蛋白（AHSA）作為模型抗體。首先將液晶5CB與聚乙烯亞胺（PEI）溶液混合，通過渦流法制備尺寸約為61 μm的PEI修飾的液晶液滴。接著將戊二醛（GA）通過靜電作用吸附到包裹PEI的液晶液滴表面，以此引入后續(xù)固定抗體蛋白的醛基。最后將GA修飾的液晶液滴與一定濃度IgG或HSA混合培養(yǎng)一段時間，GA與蛋白形成酰胺鍵共價連接，即得到兩極取向的、IgG或HSA修飾的液晶液滴。兩親分子Tween 20可以吸附到液晶液滴表面，誘導液晶液滴呈現(xiàn)徑向取向（圖10（a））。

在Tween 20存在的條件下，將IgG修飾的具有徑向取向的液晶液滴與一定濃度的AIgG接觸后，IgG與AIgG的結合會干擾吸附在液滴表面的Tween 20，導致液晶液滴由徑向取向轉變?yōu)閮蓸O取向（圖10（b）和（c））。而將IgG修飾的液晶液滴與AHSA接觸后，由于IgG與AHSA之間不會發(fā)生特異性結合，Tween 20依然穩(wěn)定地吸附在液晶液滴表面，液滴的徑向取向不會改變（圖10（d））。若要實現(xiàn)對AHSA的檢測，則可選擇與其有特異性結合的HSA修飾的液晶液滴。以上實驗通過液滴取向的轉變，實現(xiàn)對特定蛋白的檢測，最低響應濃度低至0.01 μg·mL-1AIgG和0.02 μg·mL-1AHSA。該工作首次提出利用液晶液滴實現(xiàn)蛋白免疫分析，與傳統(tǒng)需要蛋白質標記或復雜免疫分析儀器相比，該方法具有簡單、免標記的優(yōu)勢。后續(xù)研究將AIgG修飾在液晶液滴表面，實現(xiàn)對IgG的檢測［33-34］。上述工作表明，通過選擇合適的抗原、抗體，利用液晶液滴傳感器可實現(xiàn)對一系列蛋白的特異性檢測，為開發(fā)簡易、便攜式和低成本的免疫分析提供了新平臺。

圖10 （a）對液晶液滴進行化學修飾和蛋白固定的示意圖；IgG修飾的液晶液滴在加入AIgG（b）之前和（c）之后，以及（d）加入AHSA之后，在偏光顯微鏡下的圖像［22］。Fig.10（a）Schematic illustration of the LC droplet dur?ing chemical functionalization and protein immo?bilization；Polarized light images of LC droplets：IgG-LC droplets（b）before and（c）after the ad?dition of AIgG，（d）IgG-LC droplets after the addition of AHSA［22］.

2015年，Soo-Young Park課題組報道了利用微流控法制備PAA-b-LCP修飾的液晶液滴，用以研究抗生物素和生物素之間的相互作用［35］。后續(xù)還有利用液晶液滴研究膜相關細胞色素c與線粒體心磷脂之間相互作用的研究［36］。

目前，液晶液滴除了檢測特定蛋白、研究蛋白間相互作用，還可用來研究蛋白的二級結構。2019年，印度科學教育研究所Santanu K.Pal課題組報道了利用聚賴氨酸（PLL）修飾的液晶液滴研究纖維連接蛋白在液滴表面的不同二級結構［23］。修飾在液晶液滴表面帶正電荷的PLL可以與帶負電荷的纖維連接蛋白產生一定的相互作用，誘導其發(fā)生二級結構的變化，聚集形成纖維樣蛋白，同時伴隨著液滴由徑向到兩極取向的轉變。如果在體系中加入鈣離子，則可以阻斷纖維連接蛋白和PLL相互作用的位點，使得蛋白無法發(fā)生聚集，從而保持液晶液滴的兩極取向。該工作首次提出將液晶液滴體系用于研究蛋白的二級結構變化，不僅為蛋白質的聚集化檢測提供了一個新的方法，還加深了蛋白在界面相互作用的理解。

4.4 細胞可穿戴的液晶液滴傳感器及細胞環(huán)境的檢測

2013年，Nicholas L.Abbott課題組首次報道了細胞可穿戴的液晶液滴傳感器［37］。

首先，制備直徑約為6.5 μm的PEI/聚（4，4-二甲基氮內酯）（PVDMA）膠囊，隨后灌入液晶E7，即得到了部分填充的液晶膠囊。細胞實驗證明，單個細胞表面可以通過靜電作用沉積、吸附多個液晶膠囊。這些固定在細胞表面的液滴呈現(xiàn)兩極取向，加入50 μmol/L有細胞毒性的小分子陽離子型表面活性劑溴化十六烷基三甲銨（HTAB）后，HTAB可以穿過膠囊外殼，吸附到液晶液滴表面，誘導液晶由兩極取向轉變?yōu)閺较蛉∠颍▓D11）。上述結果表明，固定在細胞上的液晶膠囊可用于實時檢測細胞培養(yǎng)環(huán)境中是否存在細胞有害物質，為在單細胞水平實時、局部監(jiān)測化學環(huán)境提供了新方法。

圖11 （a）將填充液晶的膠囊錨定到細胞上的示意圖；（b）、（c）加入HTAB后0和3 min時，液晶膠囊在偏光顯微鏡下的圖像，其中HTAB沿著左下方箭頭指示的方向緩慢擴散。比例尺為10 μm（放大圖中比例尺為5 μm）［37］。Fig.11（a）Schematic illustration of LC-filled capsules are anchored to cells；Polarized light images of（b）and（c）capsule-decorated cells after 0 and 3 min addition of HTAB.Experiment in which HTAB was allowed to diffuse slowly along the direction indicated by arrows in lower left.Scale bars are 10 μm（5 μm for insets）［37］.

2019年，中國清華大學Jin-Ming Lin課題組在液晶E7中摻雜4-戊基-4’-聯(lián)苯羧酸（PBA），并封裝在PSS和聚烯丙基胺（PAAM）聚合物微膠囊中，得到尺寸為2~3 μm的液晶液滴［38］。然后將其固定在細胞上，用以研究人臍靜脈內皮細胞、骨髓瘤細胞、人原發(fā)性膠質母細胞瘤細胞、人結腸癌細胞和人乳腺癌細胞釋放NH3的情況。當體系在生理pH下時，E7中摻雜的PBA會自組裝在液晶-水相界面上，脫質子的羧基留在水相中，而疏水部分嵌入E7中，誘導液晶液滴形成徑向取向。然而當體系中有NH3存在時，其與羧基的結合降低了液晶-水相界面的電荷密度，影響PBA在液晶液滴表面的組裝，從而誘導液晶液滴轉變?yōu)閮蓸O取向。不同細胞釋放NH3的量不同，直接影響液晶液滴取向的轉變速度，因此該體系可用于區(qū)分細胞系和探索細胞異質性。通過進一步設計，該方法可擴展到細胞微環(huán)境中其他物質的檢測，在生物醫(yī)學研究中具有潛在應用價值。

除了將液晶液滴固定在細胞表面，對細胞外環(huán)境進行監(jiān)測，還可將液晶液滴通過細胞內化，實現(xiàn)對細胞內環(huán)境的檢測［39］。2021年，David M.Lynn課題組報道了使用模板法制備尺寸約為5 μm、填充液晶E7的液晶液滴。隨后以HeLa細胞和3T3細胞作為模型細胞系，將液晶液滴加入細胞培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)3T3細胞可以將液晶液滴內化。被內化的液晶液滴未顯示出細胞毒性，并且液晶液滴可以維持兩極取向。在細胞外環(huán)境加入和除去表面活性劑Triton X-100后，細胞內部的液晶液滴可以快速、可逆地進行取向轉變的響應。該工作為實時監(jiān)測細胞內環(huán)境提供了新思路和新平臺。

4.5 液晶液滴傳感器用于其他生物分子的檢測

2017年，Santanu K.Pal課題組研究了DNA與吸附在液晶液滴表面的PLL之間的相互作用，并實現(xiàn)了對DNA的檢測［40］。首先，通過超聲法，制備了尺寸約為10~40 μm的液晶液滴，PLL在液晶液滴表面吸附并誘導液晶液滴呈現(xiàn)徑向取向。隨后向其中加入單鏈或雙鏈DNA，DNA與PLL的靜電吸引作用可以進一步誘導液晶液滴發(fā)生向兩極取向的轉變，其可能與DNA-PLL復合物的形成有關。該工作中構建的液晶液滴傳感器雖然對DNA具有響應性，但是由于DNA與PLL之間靜電吸引作用不具有特異性，因此體系無法區(qū)分DNA單、雙鏈，也無法利用DNA堿基互補配對實現(xiàn)對特定序列DNA單鏈的檢測。

2022年，Zhongqiang Yang課題組將DNA納米技術的可編程性與液晶液滴的傳感特性相結合，構建了具有特異響應性的DNA修飾的液晶液滴［12］。首先將DNA與含有18個碳的疏水烷基鏈共價連接，得到兩親分子DNA-C18。隨后，通過大功率的針尖超聲法處理DNA-C18和液晶5CB的混合物，得到尺寸在1~5 μm DNA-C18修飾的液晶液滴。其中，DNA-C18的疏水烷基鏈插入液晶相中，親水的DNA向外伸展在水相溶液中。與以往報道的兩親分子誘導液晶液滴產生徑向取向不同，DNA-C18修飾后的液晶液滴仍保持兩極取向，其可能與DNA-C18在液晶液滴表面較低的修飾密度有關。利用DNA序列的可編程性，針對兩親分子DNA-C18中的DNA部分，該工作設計并合成了具有特異識別功能的DNA核酸適配體（DNA aptamer）序列，得到具有特異響應性的液晶液滴。當體系加入與DNA aptamer有特異作用的待檢測物后，DNA-C18修飾的液晶液滴發(fā)生聚集或者分散，以此實現(xiàn)對Hg2+、凝血酶和DNA酶等物質的特異性檢測。結合DNA aptamer技術的發(fā)展，該體系有望對更多化學/生物分子進行特異性檢測［41-42］。

2013年，Soo-Young Park課題組通過構建具有pH響應的、PAA-b-LCP修飾的液晶液滴，實現(xiàn)對葡萄糖的檢測［43］。由于PAA在不同pH下具有特定構象，誘導PAA-b-LCP修飾的液晶液滴在pH較高時（pH=12）呈現(xiàn)徑向取向，而在pH較低時（pH=2）呈現(xiàn)兩極取向，實現(xiàn)液晶液滴對pH的響應。將葡萄糖氧化酶（GOx）共價固定到PAA鏈上后，通過GOx氧化葡萄糖前后的pH變化帶來液晶光學信號的改變，即可實現(xiàn)在3 min內對濃度低至0.03 mmol/L葡萄糖的檢測。該液晶傳感器與已有報道的針對葡萄糖檢測的其他生物傳感器相比，具有成本低、簡單及光學信號肉眼可見等優(yōu)點，有望未來應用于人體葡萄糖水平的監(jiān)測。

此外，液晶液滴傳感器還被用于檢測乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制型農藥［44-45］、膽酸［11，46-47］和尿素［48］等。

5 液晶液滴復合材料的制備及其在生物傳感中的應用

為了提高傳統(tǒng)液晶液滴溶液體系的便攜性和材料成型問題，2016年，美國中佛羅里達大學Jiyu Fang課題組將液晶液滴嵌入水凝膠膜材料中，通過引入水凝膠體系的成型性和生物分子可滲透性等特點，實現(xiàn)了對肝臟和腸道疾病臨床診斷的生物標志物脫氧膽酸（DCA）和膽酸（CA）的免標記檢測［49］。

首先通過針尖超聲法得到尺寸在1~5 μm、殼聚糖（CHI）穩(wěn)定的5CB乳液。之后加入十四烷基硫酸鈉鹽（SC14S），其帶負電荷的親水頭通過靜電作用留在帶正電的CHI層中，而疏水尾部則插入液晶液滴中誘導液滴形成徑向取向。隨后將乳液灌注在玻璃基底上形成乳液膜，再將其浸入AgNO3溶液中。通過Ag+觸發(fā)CHI的凝膠化反應，形成鑲嵌液晶液滴的CHI水凝膠膜（圖12），并且凝膠化過程不會改變液晶液滴的取向。所得的鑲嵌液晶液滴的水凝膠膜抗拉強度約為125 kPa，楊氏模量約為64 kPa。具有良好機械性能的水凝膠膜可被切割成所需形狀和尺寸，用于后續(xù)檢測實驗。

圖12 （a）液晶5CB和CHI的化學結構式；（b）~（e）向CHI/SC14S復合穩(wěn)定的5CB乳液中添加Ag+，以觸發(fā)凝膠化而形成鑲嵌5CB液滴的水凝膠膜的過程示意圖［49］。Fig.12（a）Chemical structures of 5CB and CHI;（b）~（e）Schematic illustrations of the formation process of 5CB dropletembedded CHI hydrogel films by the Ag+ion-triggered fast gelation of CHI/SC14S-stabilized 5CB emulsion［49］.

將鑲嵌5CB液滴的水凝膠膜浸入200 μmol/L DCA溶液后，在偏光顯微鏡下可以觀察到5CB液滴逐漸由徑向取向轉變?yōu)閮蓸O取向（圖13（a）~（f））。該取向轉變源于滲透到水凝膠中的DCA破壞/取代了SC14S在液滴表面的吸附。研究發(fā)現(xiàn)，鑲嵌5CB液滴的水凝膠膜對DCA和CA的響應時間受待檢測物的濃度和種類的影響。例如，在100 μmol/L的條件下，鑲嵌5CB液滴的水凝膠膜對DCA的響應時間為30 s，而對CA則為4 min。利用該體系對DCA和CA響應性的不同，即可實現(xiàn)特異性定量檢測（圖13（g））。

圖13 （a）~（f）將鑲嵌5CB液滴的CHI水凝膠膜浸入200 μmol/L DCA溶液（a）0 s、（b）8 s、（c）12 s、（d）17 s、（e）20 s和（f）23 s后的偏光顯微圖像；（g）鑲嵌5CB液滴的水凝膠膜對DCA和CA的響應時間隨濃度變化的關系圖［49］。Fig.13（a）~（f）Polarized microscope images of 5CB droplet-embedded CHI hydrogel sheets taken at 0 s（a），8 s（b），12 s（c），17 s（d），20 s（e）and 23 s（f）after the addition of 200 μmol/L DCA；（g）Response time of the embed?ded 5CB droplets as a function of DCA and CA concentrations，respectively［49］.

該便攜式鑲嵌液晶液滴的水凝膠膜材料易制備、成本低、穩(wěn)定性好、使用方便，為實時檢測DCA和CA提供了新方法，未來可能應用于點對點檢測和遠程理療中。

6 液晶液滴的表面固定及其應用

針對現(xiàn)有液晶液滴存在流動性、難以固定觀察其取向等問題，2010年，Nicholas L.Abbott課題組設計了一種聚合物膠囊包裹的液晶液滴，其可通過弱/可逆離子相互作用或者強/共價相互作用錨定到基底表面，在復雜媒介或流動條件下依然保持體系穩(wěn)定性［50-51］。

首先通過膠囊模板法制備以帶正電的PEI為最外層、PEI/PVDMA聚電解質層層包裹的、直徑約為4.9 μm的液晶液滴。該液晶液滴通過弱且可逆的陰陽離子相互作用固定到帶負電的羧基官能化的基底表面。若用5 mol/L NaCl溶液對固定液晶液滴后的基底進行沖洗，液滴表面與基底間離子相互作用被破壞，導致液晶液滴從基底表面脫落。如果液晶液滴表面的伯胺與氨內酯官能化的基底表面反應，形成強的共價鍵而將液晶液滴固定在基底表面，在5 mol/L NaCl溶液或Triton X-100溶液沖洗的條件下，液晶液滴仍能穩(wěn)定固定在基底上。另外，使用帶正電的胺功能化的基底可以通過靜電排斥作用防止帶負電的液晶液滴在基底上的非特異性吸附。

為探究該固定化液晶液滴的長期保存性，研究人員進行了干燥實驗。實驗結果表明，大多數(shù)液晶液滴中的液晶在干燥時不會從聚合物膠囊中泄漏。并且液晶液滴至少可以干燥保存6個月，再次將其放入水環(huán)境中后，液晶液滴可以恢復其響應性，例如對水溶性兩親性分子十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）做出取向轉變響應（圖14）。

圖14 （a）將干燥的液晶液滴（紅色）制備的“檢測試紙”浸入待檢測溶液（藍色）的設計示意圖；（b）~（e）將固定在玻璃基底上、干燥的液晶液滴浸沒在5 mmol/L DTAB溶液（b）~（c）前和（d）~（e）后的明場和偏光顯微鏡光學圖像［51］。Fig.14（a）Schematic illustration showing the design of LC droplet-based“test strips”consisting of dried caged LCs（red）that can be dipped into aqueous analyte solutions（blue）；（b）~（e）Bright-field and polarized light microscopy images of dried caged LC droplets immobilized on a multilayer-coated glass chip before（b）~（c）and after（d）~（e）in?sertion into 5 mmol/L DTAB solution［51］.

上述研究結果表明，聚合物膠囊包裹的液晶液滴可以通過靜電作用或共價作用固定在基底表面。由此得到的固定化液晶液滴可以在干燥條件下長期保存，解決了液晶液滴在表征、穩(wěn)定性和存儲性等問題。同時，該工作為液晶液滴的錨定提供了新方法，將其檢測應用范圍擴展到復雜、流動的體系中，進一步提升其實際應用價值。

上述方法是采用非特異性相互作用固定液晶液滴，2022年，Zhongqiang Yang課題組則報道了利用DNA堿基特異性識別作用，實現(xiàn)液晶液滴在圖案化基底表面的固定［12］。該工作首先通過針尖超聲法得到DNA修飾的液晶液滴。結合微接觸印刷技術，在基底特定圖案處修飾DNA單鏈，隨后加入與其序列互補的DNA修飾的液晶液滴，通過堿基互補配對作用實現(xiàn)液晶液滴的固定和圖案化（圖15）。液晶在液晶相和各向同性相之間的轉變，賦予了圖案溫度響應性：在溫度升至液晶相轉變點以上時，液晶液滴在偏光顯微鏡下的明亮圖案消失；溫度降至轉變點以下時，圖案重現(xiàn)。另外，通過升高溫度打開DNA雙鏈的方法，將液晶液滴從基底表面除去，圖案消失；降低溫度，圖案重現(xiàn)，實現(xiàn)圖案的可重復印刷。該工作將液晶液滴與DNA序列可編程性、微接觸印刷技術相結合，實現(xiàn)液晶液滴的圖案化，為表面信息可視化、產品防偽提供了新方法。另外，結合DNA核酸適配體的發(fā)展，該工作為檢測試劑盒的設計提供新思路。

圖15 將DNA修飾的液晶液滴用于可重復圖案印刷的示意圖。（a）將DNA修飾的液晶液滴加到DNA修飾的金基底表面；（b）通過堿基互補配對固定在金基底上的液晶液滴形成特定圖案以及（c）對應的偏光顯微圖像；（d）通過在60 °C下加熱，破壞堿基互補配對，將形成的液晶液滴圖像擦去及其（e）對應的、在室溫下拍攝的偏光顯微圖像［12］。Fig.15 Schematic illustration of repeatable printing pat?terns with DNA modified LC droplets.（a）Add DNA modified LC droplets on the surface of DNA modified gold substrate；（b）Formation of specific pattern through the base-pair complemen?tation rule and（c）corresponding polarized image；（d）Experimental repeatability through breaking base-pair at 60 °C and（e）corresponding polarized image taken at room temperature［12］.

7 結論與展望

近年來，基于液晶液滴的生物傳感器得到了迅速發(fā)展，當前可以實現(xiàn)對以下幾類生物相關的檢測：（1）DNA和蛋白質等生物大分子；（2）病毒和細菌等微生物；（3）生物分子之間的相互作用；（4）酶抑制型農藥、膽酸和尿素等生物相關小分子。并且，液晶液滴通過對表面的功能化，實現(xiàn)了液晶液滴在固體基底表面的固定化，解決了其表征、抗干擾和便攜性等問題［12，50-51］。

然而，目前液晶液滴傳感器仍面臨著一些亟待解決的問題。首先，液晶液滴的檢測靈敏度和準確性受液晶液滴尺寸大小和均一性的影響。當液晶液滴尺寸大于10 μm時，會顯著降低液晶液滴的檢測靈敏度。而當液晶液滴尺寸不夠均一時，會導致液晶取向轉變無法同步發(fā)生，給檢測帶來誤差。因此，制備小于10 μm且尺寸均一的液晶液滴是提高液晶液滴檢測性能的前提和基礎。其次，因為液晶本身不具有對待檢測物的特異性識別功能，因此，如何對液晶和液晶液滴界面進行通用、簡單的特異性化學/生物修飾，賦予其特異響應能力，是當前研究的重點。同時，考慮到人眼難以快速、準確處理大量液晶光學圖像，將液晶液滴傳感器與深度學習技術結合，將進一步提升其精準性和實用性。最后，當前對于液晶液滴的制備，其尺寸的精確控制和大規(guī)模生產難以同時滿足，需要進一步通過工程技術改進液晶液滴的制備工藝，推動其產業(yè)化發(fā)展。