鐘曉霞， 劉志云,2， 周曉容,2， 黃金秀,2

(重慶市畜牧科學(xué)院1，重慶 402460) (農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，重慶 402460)

菜籽粕是油菜籽榨油之后的副產(chǎn)物，其粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)35%～45%，富含礦物質(zhì)元素、維生素和氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[1]。但菜籽在熱榨或溶劑提取制油過程中，菜籽蛋白嚴(yán)重變性，導(dǎo)致消化吸收率低[2]，制約了菜籽粕的深度利用，造成蛋白資源的浪費(fèi)。研究表明，菜籽蛋白經(jīng)蛋白酶作用，可得到許多分子鏈長(zhǎng)度不等的、易溶解、易吸收的低分子小肽混合物[3]，且具有抗氧化[4]、提高免疫力[5]、降血壓[6]、抗腫瘤[7]等功能活性。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)通過微生物發(fā)酵菜籽蛋白可獲得功能性菜籽多肽，而且與酶水解法制備相比，可以節(jié)省大量昂貴的酶制劑，降低生產(chǎn)成本[8]，已成為菜籽粕高值化利用的新途徑之一。何榮海等[9]以枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕得到具有抗氧化活性的菜籽肽，金晶[10]以枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕得到具有ACE抑制活性的菜籽肽。

本研究實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離篩選到一株產(chǎn)堿性蛋白酶和中性蛋白酶的特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)，能夠在菜粕平板上良好生長(zhǎng)，具有分解菜籽蛋白的潛力。影響菜粕發(fā)酵獲得菜籽肽的因素包括發(fā)酵基質(zhì)的pH值、料水比、KH2PO4添加量、葡萄糖添加量[11]；發(fā)酵的溫度、時(shí)間、菌種接種量、轉(zhuǎn)速等[9]。由于菌株的特異性，不同菌株發(fā)揮作用所需條件不盡相同[12]。因此本研究擬以篩選到的特基拉芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，以多肽得率為篩選條件，采用單因素和正交分析法對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的組成和發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳發(fā)酵基質(zhì)組成和發(fā)酵工藝，提高菜籽多肽得率。以期為菜籽粕的深度利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料與試劑：菜籽粕，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.89%，含水量7.54%；2，2-二苯甲基苦味酰基苯肼基(DPPH)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ATBS)，分析純；Gly-Gly-Tyr-Arg，色譜純。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂20 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min，不加瓊脂作液體培養(yǎng)基使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 特基拉芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽多肽的工藝優(yōu)化

初始發(fā)酵基質(zhì)：準(zhǔn)確稱取2 g過60目菜籽餅(發(fā)酵底物)，加入30 mL蒸餾水，121 ℃高溫高壓21 min。冷卻至室溫，備用。發(fā)酵條件為0.25 mL/g發(fā)酵底物的接種量，37 ℃，150 r/min發(fā)酵36 h。

1.2.1.1 發(fā)酵基質(zhì)的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察發(fā)酵料水比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，KH2PO4添加量(0、1、3，5、7、9 mg/mL)，葡萄糖添加量(0、1、3、5、7、9 mg/mL)，發(fā)酵初始pH(4、5、6、7、8、9、10)對(duì)菜籽多肽得率的影響，考察某一單因素時(shí)，其他發(fā)酵條件不變。

1.2.1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在發(fā)酵基質(zhì)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察轉(zhuǎn)速(120、150、180、210、240 r/min)，接種量(0.05、0.15、0.25、0.35、0.45 mL/g發(fā)酵底物)，發(fā)酵溫度(33、35、37、39、41 ℃)，發(fā)酵時(shí)間(12、24、36、48、60 h)對(duì)多肽得率的影響，考察某一單因素時(shí)，其他發(fā)酵條件不變。選取各因素的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)范圍，采用正交分析法進(jìn)行優(yōu)化。

表1 L9(43)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 最優(yōu)條件下發(fā)酵制備菜籽肽

在最優(yōu)的發(fā)酵條件下開展驗(yàn)證試驗(yàn)，以未接種菌液在相同條件下發(fā)酵的樣品作為對(duì)照組，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)多肽得率、發(fā)酵上清液的氨基酸含量和體外氧化活性。

1.2.3 發(fā)酵液處理

將培養(yǎng)好的發(fā)酵產(chǎn)物取出，2～4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，上清液定容至50 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾上清液，除去不溶物和細(xì)菌，備用。

1.2.4 多肽得率的測(cè)定

根據(jù)所報(bào)道的文獻(xiàn)[13]，配置試劑。多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：將Gly-Gly-Tyr-Arg用5% TCA分別配制成0、0.312 5、0.625、1.25、2.5和5 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0.9 mL不同稀釋梯度的溶液置于5 mL離心管中，加入雙縮脲試劑3.6 mL，混勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定OD值。在0～5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，多肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=19.042x+0.021 9(x為吸光值，Y為多肽濃度，mg/mL)，R2=0.999 9，線性關(guān)系良好。

取0.75 mL定容后的發(fā)酵液，加入0.75 mL 10%的三氯乙酸水溶液，旋渦混勻，靜置30 min，然后在10 000 r/min離心10 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移到10 mL比色管中，用5%三氯乙酸定容至10 mL，搖勻，取0.9 mL上述溶液置于5 mL離心管中，加入雙縮脲試劑3.6 mL，混勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液于540 nm下檢測(cè)OD值。

多肽得率=(待測(cè)液中肽含量×發(fā)酵液定容體積)/發(fā)酵底物總質(zhì)量×100%

1.2.5 菜籽多肽體外抗氧化活性研究1.2.5.1 DPPH清除率的測(cè)定

根據(jù)所報(bào)道的文獻(xiàn)[14, 15]，用無(wú)水乙醇將DPPH配制成0.12 mmol/L的溶液，并避光保存。將待測(cè)樣品配制成不同梯度濃度的溶液；分別與DPPH溶液按1∶1的比例混合均勻，放置于常溫下避光反應(yīng)30 min。最后，反應(yīng)結(jié)束后在 517 nm下檢測(cè)樣品的吸光值。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)還需要設(shè)置空白組和對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行。

DPPH清除率=(1-(AS-AC)/A0)×100%

式中:As表示樣品組(樣品和DPPH)吸光值；Ac表示對(duì)照組(樣品和無(wú)水乙醇)吸光值；A0表示空白組(DPPH和樣品溶解液)吸光值。

1.2.5.2 ABTS 自由基清除活性測(cè)定

根據(jù)所報(bào)道的文獻(xiàn)[16, 17]，室溫下，在黑暗環(huán)境中用2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液與7.0 mmol/L的 ABTS水溶液反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生ABTS自由基溶液。使用前，用pH 7.4的0.2 mol/L PBS 緩沖液稀釋 ABTS母液，使其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光值為 0.7±0.02。移取50 μL不同濃度的稀釋樣品與150 μL ABTS 溶液于96孔酶標(biāo)板上混勻，室溫下避光反應(yīng)6 min后，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值

ABTS自由基清除率=[1-(A1-A3)/(A2-A4)]×100%

式中:A1表示樣品組(樣品和ATBS)；A2表示控制組(超純水)；A3表示樣品空白組(樣品+PBS溶液)；A4為空白組(超純水+PBS)。

1.2.5.3 鐵還原抗氧化能力(FRAP)測(cè)定

根據(jù)所報(bào)道的文獻(xiàn)[18]，配置FRAP檢測(cè)試劑，標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：將1 mL不同濃度的FeSO4溶液加入到10 mL比色管中，加入5.0 mL FRAP 工作液，37 ℃下避光反應(yīng)20 min，在593 nm處測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光度。在0～1 mmol/L的濃度范圍內(nèi)FeSO4還原力標(biāo)曲回歸方程為：Y=3.549 1x+0.007(x為FeSO4濃度，mmol/L；Y為吸光度)，R2=0.999 9，線性關(guān)系良好。

樣品測(cè)定：按照建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表示：基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的0～1 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，以1 mmol/L的FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算FRAR值。

1.2.5.4 還原力測(cè)定

根據(jù)所報(bào)道的文獻(xiàn)配制試劑[19]，在5 mL離心管中依次加入0.2 mL不同濃度的稀釋樣品，在依次加入1 mL 0.2 mol/L PBS磷酸緩沖液(pH 6.6)和1 mL 1%鐵氰化鉀，迅速混勻，50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，冷卻并加1 mL 10% 三氯乙酸(TCA)，混勻后以3 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，測(cè)定各樣品在700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。用蒸餾水作為無(wú)還原能力對(duì)照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 8作圖，SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用T-檢驗(yàn)比較分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特基拉芽孢桿菌發(fā)酵制備菜籽多肽的優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵基質(zhì)的優(yōu)化

對(duì)發(fā)酵基質(zhì)的料液比、pH值、KH2PO4添加量、葡萄糖添加量進(jìn)行優(yōu)化，由圖1所示，隨著料液比的提高，多肽得率也隨之顯著提高，在料液比為1∶25時(shí)多肽得率較高；隨著發(fā)酵基質(zhì)pH的提高，發(fā)酵上清液多肽得率先升高后略微降低，在pH 8時(shí)多肽得率較高；隨著KH2PO4添加量的提高，多肽得率持續(xù)降低，對(duì)菜籽多肽得率起到反向作用，故發(fā)酵基質(zhì)中不添加KH2PO4；隨著葡萄糖的添加量的提高，多肽得率先下降后提高，但相較于不添加，多肽得率提高不顯著，考慮生產(chǎn)成本等問題，故在發(fā)酵基質(zhì)中不添加葡萄糖。

最終以料水比為1∶25，初始pH為8，不添加KH2PO4緩沖鹽和葡萄糖的發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

圖1 發(fā)酵基質(zhì)對(duì)菜籽多肽得率的影響

2.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化2.2.2.1 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

在優(yōu)化發(fā)酵基質(zhì)的基礎(chǔ)上，對(duì)菜籽粕的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，由圖2所示，隨著接種量的增加，多肽得率先增加后降低，接種量為0.35 mL/g發(fā)酵底物時(shí)，多肽得率最高；隨著溫度的增加，多肽得率先增加后降低，發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，多肽得率最高；隨著轉(zhuǎn)速的增加，多肽得率增加，轉(zhuǎn)速為240 r/min時(shí)，多肽得率較高；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，多肽得率增加，發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，多肽得率較高。

圖2 發(fā)酵條件對(duì)菜籽多肽得率的影響

2.2.2.2 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

由表2可知，最佳發(fā)酵條件0.35 mL/g的接種量、37 ℃、240 r/min，發(fā)酵42 h。各因素對(duì)多肽得率的影響時(shí)間>溫度>轉(zhuǎn)速>接種量。

表2 發(fā)酵條件正交優(yōu)化結(jié)果

2.2.3 最優(yōu)條件下發(fā)酵制備菜籽肽

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行4組平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組的多肽得率分別為2.9%、2.1%、2.1%、2.15%，平均值為2.3%；菜籽多肽得率分別為21.00%、22.15%、20.75%、21.5%，平均值為21.4%，較對(duì)照組提高了9.3倍。由表3可知，發(fā)酵上清液中氨基酸含量較對(duì)照組顯著提高9.55倍，必需氨基酸提高13.68倍，非必需氨基酸提高8.13倍，其中異亮氨酸、賴氨酸和組氨酸分別提高了18.24、20.46、30.98倍。

表3 發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸含量/mg/100 mL

由圖3可知，在同一稀釋濃度下，發(fā)酵后上清液DPPH自由基和ATBS自由基清除活性、鐵總抗氧化能力、還原力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在試驗(yàn)濃度范圍，隨著菜籽多肽濃度的增大，其抗氧化活性顯著增強(qiáng)，且具有一定的量效關(guān)系，經(jīng)計(jì)算，菜籽多肽的50% DPPH自由基清除率為0.053 mg/mL，50% ATBS自由基清除率為0.087 mg/mL，發(fā)酵上清液稀釋20倍后的鐵總抗氧化活性為FRAR值為0.25±0.01。

圖3 發(fā)酵對(duì)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵基質(zhì)對(duì)菜籽多肽得率的影響

發(fā)酵基質(zhì)的料水比、KH2PO4添加量、葡萄糖添加量、初始pH均能對(duì)菜籽多肽得率產(chǎn)生影響。料水比決定發(fā)酵培養(yǎng)基中的菜籽粕添加量和含水量，在本試驗(yàn)中隨著料水比的提高，菜籽多肽得率也隨之提高，這與金晶[10]的研究結(jié)果相似。合理的料水比一方面有助于菌體吸收培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧傳遞，另一方面有利于微生物代謝產(chǎn)物阻遏削減，促進(jìn)新陳代謝，從而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖[20]。

KH2PO4作為微生物培養(yǎng)基中常用的無(wú)機(jī)鹽之一，可以提供微生物生長(zhǎng)所需的礦物元素，緩沖發(fā)酵基質(zhì)pH的快速變化，但濃度過高也會(huì)抑制菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，添加KH2PO4降低了菜籽多肽得率，可能是因?yàn)镵H2PO4本身呈弱酸性，對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物中的乙酸等酸性代謝物的積累未起到緩解作用，從而抑制了菌株生長(zhǎng)。發(fā)酵基質(zhì)初始pH值影響菌種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)速度、生長(zhǎng)繁殖速度、細(xì)胞內(nèi)酶的活性以及蛋白質(zhì)的積累[21]。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵基質(zhì)呈弱堿性時(shí)菜籽多肽得率較高，適宜菌株和代謝產(chǎn)物的生成。

葡萄糖作為易于吸收的碳源，可以在菌種發(fā)酵初期提供大量碳源，維持其生長(zhǎng)勢(shì)頭，從而產(chǎn)生大量的蛋白水解酶。在本實(shí)驗(yàn)中隨著葡萄糖添加量的增加先降低后提高，可能是菜籽粕自身的碳源也能滿足菌株的前期生長(zhǎng)，再加入過多的葡萄糖一方面會(huì)加速菌體呼吸，使培養(yǎng)基中的溶氧不能滿足菌體的需要，另一方面加速了一些酸性中間代謝物如乳酸、丙酮酸、乙酸等的累積，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值降低，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和水解酶類的合成。

3.2 發(fā)酵條件對(duì)菜籽多肽得率的影響

接種量的大小會(huì)直接影響發(fā)酵周期和產(chǎn)物的累積速度，在本實(shí)驗(yàn)中隨著接種量的增加，多肽得率先增加后減少。隨著接種量的提高，可以縮短菌株的延滯期，加快酶的積累；但接種量過大，細(xì)菌繁殖迅速，培養(yǎng)液粘度增加，溶氧不足，細(xì)胞自溶加快，反而不利于產(chǎn)物合成[22]。溫度影響微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，過高或過低都不利于發(fā)酵過程[23]。本實(shí)驗(yàn)中，多肽得率的變化與酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)結(jié)果相似，即隨著溫度的升高，反應(yīng)速度加快，導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖加快；但隨著溫度的上升，酶失活的速度也越大[24]。

在搖瓶中進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，轉(zhuǎn)速直接影響到培養(yǎng)基中的溶氧量，本試驗(yàn)中隨著轉(zhuǎn)速的提高，多肽得率隨之提高?？赡苁禽^高的轉(zhuǎn)速，提高了培養(yǎng)基中的溶氧量和菌體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸，有利于細(xì)菌快速繁殖增長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成[25]。發(fā)酵時(shí)間影響微生物的生長(zhǎng)和酶的作用，在本實(shí)驗(yàn)中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽得率持續(xù)提高。發(fā)酵時(shí)間太短，菌的濃度低，產(chǎn)酶少，不能完全發(fā)揮，而發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，大量代謝產(chǎn)物的積累抑制酶的活性，并可能將多肽進(jìn)一步分解為游離氨基酸，導(dǎo)致多肽得率降低。

在本實(shí)驗(yàn)中，正交實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間較單因素實(shí)驗(yàn)中的最佳時(shí)間有所縮短，說(shuō)明各因素之間存在正向交互作用。合適的接種量，減少了菌株適應(yīng)新環(huán)境的時(shí)間，適宜的溫度加速了菌株的生長(zhǎng)繁殖；而較高的轉(zhuǎn)數(shù)提高了發(fā)酵基質(zhì)中的溶氧量和氧的傳遞，為特基拉芽孢桿菌提供了更好的生長(zhǎng)環(huán)境，也更有利于菌株產(chǎn)酶分解大蛋白分子成小蛋白，從而縮短了發(fā)酵時(shí)間，節(jié)約了時(shí)間成本。

3.3 最優(yōu)發(fā)酵條件對(duì)菜籽多肽得率及其體外抗氧化活性的影響

通過對(duì)發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵條件的優(yōu)化，特基拉芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕的多肽得率為21.4%，與何榮海等[9]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備菜籽多肽的得率為20.19%、金晶[10]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備菜籽多肽的得率為23.85%的研究結(jié)果相近。與對(duì)照組相比，用特基拉芽孢桿菌發(fā)酵菜粕后，發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸含量大幅度提高。有研究表明，特基拉芽孢桿菌的基因能夠編碼可編碼蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶等多種酶系[26]，本實(shí)驗(yàn)所用的特基拉芽孢桿菌能夠分泌中性蛋白酶和堿性蛋白酶，這些蛋白酶將不溶于水的菜籽大蛋白分解成可溶于水的小分子蛋白和肽，使得發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸和多肽含量大幅度提高，其中組氨酸含量提高了30.98倍。

與對(duì)照組相比，經(jīng)特基拉芽孢桿菌發(fā)酵菜粕后，發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基清除率、ATBS自由基清除率、總抗氧化能力和還原力均顯著提高，與RONG H等[27]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵獲得菜籽肽的研究結(jié)果類似。其中50% DPPH自由基清除率所需菜籽多肽濃度低于何榮海等[9]的報(bào)道。發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的大幅度提高，可能與發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸和多肽含量大幅提高有關(guān)。有研究表明，組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸等具有抗氧化活性，特別是組氨酸由于其咪唑環(huán)的分解而表現(xiàn)出很強(qiáng)的自由基清除活性[28, 29]。

4 結(jié)論

特基拉芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵制備菜籽多肽的最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵基質(zhì)pH為8，料水比為1∶25，接種量為0.35 mL/g，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為240 r/min，發(fā)酵時(shí)間為42 h。此條件下，菜籽多肽得率為21.4%，發(fā)酵上清液氨基酸含量大幅提高，體外抗氧化活性顯著提高。