戴向榮，李小羿*，殷雷，陳程，江萬祥，鐘玉婷

（1.兆科藥業(yè)（廣州）有限公司研發(fā)中心，廣東廣州 511462；2.四川格林泰科生物科技有限公司，四川眉山 620020）

紫杉類藥物的抗腫瘤作用于1962年被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷長達30年的研究后，于1992年被FDA正式批準用于治療晚期卵巢癌等多種腫瘤，2009年在中國獲批上市。臨床中，紫杉類藥物可用于多種腫瘤的治療，是腫瘤化學治療的基石藥物。然而，其在治療過程中也會帶來多種不良反應，化療致周圍神經(jīng)病變是紫杉類藥物的常見不良反應，即使停止紫杉類藥物治療后，紫杉類藥物相關周圍神經(jīng)病變仍可能繼續(xù)惡化，臨床試驗報道顯示紫杉類藥物致周圍神經(jīng)病變的發(fā)生概率為2%～33%[1]。

苯丁酸鈉別名4-苯基丁酸鈉鹽、4-苯基丁酸鈉，是一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑。1996年FDA批準苯丁酸鈉用于治療因氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）、鳥氨酸氨甲?；D移酶（OTC）或精氨基琥珀酸合成酶（AS）缺乏而致的慢性尿素循環(huán)紊亂而導致的高氨血癥。苯丁酸鈉是一個前藥，并且能迅速代謝成苯乙酸鹽。苯乙酸鹽是一種代謝活性的化合物，通過乙?；饔门c谷氨酰胺結合形成苯乙酰谷氨酰胺。苯乙酰谷氨酰胺通過腎臟排泄，使過高的血氨水平和血谷氨酸濃度下降。苯丁酸可磷酸化IκB，將NF-κB p50轉位到細胞核，或直接乙酰化NF-κB p50。NF-κB p50反激活Bcl-2基因表達，上調的Bcl-2可阻斷細胞色素C的釋放和隨后的Caspase激活，減緩運動神經(jīng)元的死亡[2]。

ZHU等[3]研究發(fā)現(xiàn)4-苯基丁酸可減輕溶血磷脂酸誘導的內層皮質神經(jīng)毒性，與顯著抑制代謝性谷氨酸受體1（mGluR1）的蛋白水平，阻斷Homer1/mGluR1通路從內質網(wǎng)釋放Ca2+有關。INCEOGLU等[4]證實內質網(wǎng)應激的化學誘導劑總是會導致疼痛行為，而這種行為會被化學伴侶4-苯基丁酸和可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑逆轉。以上研究表明苯丁酸鈉在神經(jīng)毒性方面具有保護作用是明確的，但目前研究主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，對于外周神經(jīng)疼痛的應用研究很少見。外周神經(jīng)毒性是化療藥物常見的劑量限制性毒性[5]，因此，參考文獻[6-10]的內容使用動物模型探索了苯丁酸鈉對紫杉類藥物相關周圍神經(jīng)病變的防治作用，以期為患者提供一種新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

紫杉醇注射液（泰素），批號：0J05868，美國Bristol-Myers Squibb公司；苯丁酸鈉顆粒（ZK034），批號20190625，兆科藥業(yè)（廣州）有限公司；普瑞巴林膠囊（陽性對照），批號DR0502，輝瑞制藥有限公司。

1.1.2 儀器

ZS-CTY足底刺痛系統(tǒng)，北京眾實迪創(chuàng)有限公司；37370-001紅外熱痛測試儀，德國Ugo Basile公司。

1.1.3 實驗動物

C57BL/6小鼠，SPF級，18.81～22.04 g，6～8周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物質量合格證號110324210101054415。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

通過腹腔注射紫杉醇，分別于1 d、3 d、5 d和7 d注射1次，每次注射4.5 mg/kg，建立化療引起的小鼠外周神經(jīng)痛（CIPN）模型，正常對照組動物按同樣頻率和劑量注射生理鹽水。

1.2.2 試驗設計

試驗設計具體見表1。

表1 實驗設計

1.2.3 給藥信息

每天給藥一次，連續(xù)給藥30 d，給藥第1天開始造模，給藥后1 h給予造模制劑。造模當天定義為試驗第1天（day 1，D1）。給藥前，將用于給藥的制劑放置至室溫。

1.2.4 實驗指標

（1）一般狀態(tài)觀察：所有計劃測定的存活試驗動物每天觀察一次，如果動物出現(xiàn)異常，可增加觀察頻率。（2）體重：所有計劃測定的存活試驗動物每周檢測2次。（3）機械痛縮足閾值（MWT）：所有計劃測定的存活實驗動物造模前檢測1次，造模后第7 d、14 d、20 d、25 d和30 d（代號D7、D14、D20、D25和D30，下同）各檢測一次。檢測前動物先放入檢測盒連續(xù)適應3 d，每天30 min；每次檢測時，動物先放入檢測盒適應10 min，每只動物連續(xù)檢測3次取平均值，每次間隔5 min。（4）熱痛縮足潛伏期（TWL）：所有計劃測定的存活實驗動物造模前檢測1次，造模后第7 d、14 d、20 d、25 d和30 d各檢測一次。檢測前動物先放入檢測盒連續(xù)適應3 d，每天30 min；每次檢測時，動物先放入檢測盒適應10 min，每只動物連續(xù)檢測3次取平均值，每次間隔5 min。（5）神經(jīng)病理形態(tài)學觀察：動物于造模后第31 d進行解剖，用1%的戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠后，腹主動脈放血安樂死小鼠，用trump’s fixative灌注小鼠后，取出小鼠左后腿坐骨神經(jīng)置于2%的戊二醛固定液中于4 ℃下保存，在透射電鏡下觀察坐骨神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的髓鞘板層結構。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）描述。正態(tài)和方差齊性的多組間比較先采用單因素方差分析，進一步組間多重比較采用Tukey’s HSD檢驗；不滿足正態(tài)分布或者方差不齊，采用Kruskal-Wallis H檢驗（K-W法）進行分析，組間多重比較采用Dunn’s法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 一般狀態(tài)觀察

適應期結束后，所有動物一般表現(xiàn)均正常，紫杉醇造模后，少部分動物背部和（或）頭部出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象。給藥后，供試品ZK034高劑量組（1.5 g/kg）約1/2的動物出現(xiàn)四肢僵直、體溫降低的狀態(tài)，ZK034中劑量組（1.0 g/kg）少數(shù)動物出現(xiàn)體溫降低的狀態(tài)，其余給藥組動物未發(fā)現(xiàn)異常反應。

2.2 體重

整個試驗過程中（圖1），正常對照組動物體重呈增長狀態(tài)，其余各組動物體重整體變化趨勢相同，藥物干預對動物體重變化無明顯影響。

圖1 不同試驗組動物體重的變化（n=10）

2.3 對小鼠機械痛縮足閾值的影響

如表2所示，在本試驗條件下，供試品ZK034三個治療劑量（0.5 g/kg、1.0 g/kg及1.5 g/kg）均表現(xiàn)出顯著抑制紫杉醇引起的小鼠機械痛閾值降低的作用，ZK034高劑量組和中劑量組動物機械痛縮足閾值基本相同，且高于ZK034低劑量組；給藥前，各組動物機械痛縮足閾值基本相同，無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05），藥物干預后，ZK034高劑量組和中劑量組動物機械痛縮足閾值在首次檢測時（D7）顯著升高（P＜0.05），且此狀態(tài)持續(xù)到給藥30 d（D30）；ZK034低劑量組動物機械痛縮足閾值在第3次檢測時（D20）顯著升高（P＜0.05），且此狀態(tài)持續(xù)到給藥30 d（D30）。

表2 不同試驗組動物機械痛縮足閾值的變化（n=10，單位：g）

以上結果提示在本試驗條件下，供試品ZK034對于紫杉醇誘導的小鼠外周神經(jīng)機械痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

2.4 對小鼠光熱痛縮足潛伏期的影響

如表3所示，在本試驗條件下，供試品ZK034中、高劑量（1.0 g/kg、1.5 g/kg）表現(xiàn)出顯著抑制紫杉醇引起的小鼠光熱痛縮足潛伏期縮短的作用，ZK034高劑量組和中劑量組動物機械痛縮足閾值基本相同，且高于ZK034低劑量組；給藥前，各組動物光熱痛縮足潛伏期基本相同（P＞0.05），藥物干預后，ZK034高劑量組和中劑量組動物機械痛縮足閾值在第2次檢測時（D14）顯著升高（P＜0.05），且此狀態(tài)持續(xù)到給藥30 d（D30）；ZK034低劑量組動物光熱痛縮足潛伏期升高不明顯（P＞0.05）。

表3 不同試驗組動物光熱痛縮足潛伏期的變化（n=10，單位：s）

以上結果提示在本試驗條件下，供試品ZK034中、高劑量對于紫杉醇誘導的小鼠外周神經(jīng)光熱痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

2.5 對小鼠坐骨神經(jīng)超微結構的影響

在透射電鏡下觀察坐骨神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的髓鞘板層結構，如圖2所示。正常對照組小鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維的髓鞘板層結構較緊密，排列均勻，輕微脫髓鞘；注射紫杉醇后的模型對照組小鼠坐骨神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維髓鞘板層結構明顯非常松散，呈空網(wǎng)狀改變，偶見嚴重病變處呈灶性溶解壞死，甚至髓鞘脫落、軸突斷裂。試驗劑量下ZK034和普瑞巴林治療后小鼠的坐骨神經(jīng)纖維髓鞘板層結構也較松散，有明顯脫髓鞘，但較模型對照組輕。

圖2 透射電鏡下不同試驗組動物坐骨神經(jīng)超微結構的變化

通過對各試驗組動物坐骨神經(jīng)中的有髓神經(jīng)纖維和髓鞘異常神經(jīng)纖維計數(shù)（每只動物隨機選擇5張切片，計算每張切片中的有髓神經(jīng)纖維數(shù)量和髓鞘異常神經(jīng)纖維數(shù)量），并進行統(tǒng)計分析，結果如圖3所示。正常對照組動物坐骨神經(jīng)中的異常髓鞘神經(jīng)纖維占21.4%±5.35%，顯著低于模型對照組（41.8%±10.09%，P＜0.05）；ZK034低、中、高劑量組和普瑞巴林組動物坐骨神經(jīng)中的異常髓鞘神經(jīng)纖維百分比均低于模型對照組，分別為30.3%±9.38%、30.8%±9.57%、30.5%±7.13%和30.4%±8.68%，雖然ZK034高劑量組小鼠坐骨神經(jīng)中的異常髓鞘神經(jīng)纖維百分比低于模型對照組，但其有髓神經(jīng)的脫髓鞘程度較模型對照組嚴重，其異常髓鞘的板層結構較模型對照組松散。

圖3 不同處理組髓鞘異常神經(jīng)纖維占比

3 結論

小鼠腹腔注射紫杉醇后，其機械痛縮足閾值和光熱痛縮足潛伏期均顯著降低，說明本試驗成功建立了模擬臨床特征的化療藥物誘導的小鼠外周神經(jīng)痛模型。

供試品ZK034高劑量組（1.5 g/kg）給藥后，約1/2的動物出現(xiàn)四肢僵直、體溫降低的狀態(tài)，ZK034中劑量組（1.0 g/kg）給藥后，少數(shù)動物出現(xiàn)體溫降低的狀態(tài)，其余給藥組動物未發(fā)現(xiàn)異常反應，提示ZK034高劑量灌胃下可能存在神經(jīng)系統(tǒng)影響。在歐盟苯基丁酸鈉的批準文件[11]顯示：在動物藥效學試驗中，苯乙酸鹽和苯丁酸有神經(jīng)抑制和神經(jīng)毒性作用，嚙齒類動物試驗結果也提示苯丁酸鈉有潛在的中樞神經(jīng)系統(tǒng)危害。綜合來看，苯丁酸鈉在劑量較高時可能存在神經(jīng)毒性，癥狀表現(xiàn)以體溫下降、嗜睡為主。從苯丁酸鈉中、低劑量組的動物表現(xiàn)來看，未出現(xiàn)與高劑量組類似的對神經(jīng)系統(tǒng)的影響，結合苯丁酸鈉已在臨床上應用的實際情況，控制苯丁酸鈉臨床應用不超量仍然是安全的。

3個試驗劑量下ZK034能夠顯著升高小鼠的機械痛縮足閾值，中、高劑量ZK034（1.0 g/kg、1.5 g/kg）能夠顯著升高小鼠的光熱痛縮足潛伏期，表明苯丁酸鈉具有良好的鎮(zhèn)痛作用，為臨床應用提供了有效性支持。相比模型組，供試品ZK034給藥后輕微改善了紫杉醇引起的小鼠坐骨神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維的脫髓鞘情況（10%），提示可能需要延長給藥療程。苯丁酸鈉作為組蛋白去乙?；敢种苿?，體內、外臨床前數(shù)據(jù)表明，苯丁酸鈉具有抗增殖、抗血管生成、抗轉移、免疫調節(jié)和分化特性[12]，與化療藥物聯(lián)用可能起到協(xié)同作用。

綜上所述，本研究將為癌癥患者化療藥物副作用提供一種新的治療途徑，但仍需要進一步開展臨床研究進行確證。