林欣穎，謝傳奇

（1.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌，330096；2.廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361104）

油茶（Camellia oleiferaAbel），屬于山茶科、山茶屬小喬木，被當(dāng)作我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展的第一大木本油料作物，擁有相當(dāng)悠久的種植歷史，與油棕、油橄欖和椰子共稱世界四大木本食用油料植物[1]。油茶在榨油的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，其中油茶果殼是主要的榨油剩余物之一，其質(zhì)量超過(guò)了油茶果全部質(zhì)量的60%[2]，因此其儲(chǔ)量非常豐富。但是目前油茶果殼主要還是被人們當(dāng)作沒(méi)有用的垃圾直接丟掉或者焚燒，沒(méi)有得到高值化利用[3]。對(duì)油茶果殼這種非木質(zhì)化資源進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)，不僅能節(jié)約資源，還能在一定程度上保護(hù)生態(tài)環(huán)境，產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益。

多糖是一類天然高分子化合物，在生物界中廣泛存在，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖和降血脂等多種藥理活性。研究表明，油茶果殼含有豐富的多糖[4-5]，基于此，本研究采用響應(yīng)面法對(duì)油茶果殼多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，以期為油茶果殼資源的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶果殼，江西省恩泉油脂有限公司。

葡萄糖、苯酚，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)SH30604.01），美國(guó)HyClone公司；胎牛血清（批號(hào)NTC-HK026），阿根廷Natocor工業(yè)；青鏈霉素（貨號(hào)B540732）、PBS（貨號(hào)E607008）、胰蛋白酶（貨號(hào)A003702）、臺(tái)盼藍(lán)（貨號(hào)A601140）、MTT（貨號(hào)A100793），上海生工生物工程股份有限公司；亞硝酸鈉，分析純，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；LPS（貨號(hào)L8880）、DMSO（貨號(hào)D8371），北京索萊寶科技有限公司；對(duì)氨基苯磺酸、醋酸、α-萘胺，均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

運(yùn)邦2500A多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；B-260恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；ME204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Cell Mate二氧化碳培養(yǎng)箱，新加坡Esco公司；ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡，日本NIKON公司；TD50002A電子天平，上海衡際科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油茶果殼多糖的提取

將油茶果殼粉碎，過(guò)60目篩，置于錐形瓶中，按照一定的提取溫度、提取時(shí)間和料液比進(jìn)行浸提，提取溫度選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃5個(gè)水平；提取時(shí)間選擇20 min、40 min、60 min、80 min和100 min5個(gè)水平；料液比選擇1∶10（g∶mL）、1∶20（g∶mL）、1∶30（g∶mL）、1∶40（g∶mL）和1∶50（g∶mL）5個(gè)水平。采用控制變量法分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察溫度變量時(shí)，提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶30（g∶mL）；考察提取時(shí)間變量時(shí)，溫度為80 ℃、料液比為1∶30（g∶mL）；考察料液比變量時(shí)，溫度為80 ℃、提取時(shí)間為60 min。隨后抽濾，取上清液，再經(jīng)過(guò)80%乙醇醇沉，25%活性炭脫色初步純化，即得到油茶果殼粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精準(zhǔn)稱取0.01 g干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖，將其配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繼而依次將其稀釋為 400.00 μg/mL、200.00 μg/mL、100.00 μg/mL、50.00 μg/mL、25.00 μg/mL、12.50 μg/mL 以 及6.25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)過(guò)適當(dāng)調(diào)整，取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL于離心管中，加入0.1 mL 5%的苯酚溶液，充分混勻，再加入0.5 mL硫酸混勻后將其放置于40 ℃水浴30 min，以流動(dòng)水冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度（xmg/mL）與吸光度y的回歸方程：y=10.534x+0.202 8，R2=0.994 2。

1.3.3 多糖含量的測(cè)定

精密移取0.2 mL上清液于離心管中，加入0.1 mL 5%的苯酚溶液，混合均勻，加入0.5 mL硫酸再次混勻后置于40 ℃水浴30 min，流水冷卻直至室溫，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總多糖濃度，再按公式（1）計(jì)算出總多糖含量。

式中：P為待測(cè)樣品中的總多糖含量，mg/g；C為代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線后所得的提取物樣液的總多糖濃度，mg/mL；V為提取物樣液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為待測(cè)樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用Design-Expert 8.0軟件，在得到了單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析優(yōu)化油茶果殼多糖提取工藝。因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

1.3.5 Griess實(shí)驗(yàn)

用PBS將亞硝酸鈉稀釋成系列濃度1.563 μmol/L、3.125 μmol/L、6.250 μmol/L、12.500 μmol/L、25.000 μmol/L、50.000 μmol/L 和 100.000 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)平行，每個(gè)孔加100 μL對(duì)應(yīng)濃度的亞硝酸鈉。然后每個(gè)孔再加100 μL配制好的Griess試劑，室溫振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于540 nm處測(cè)吸光度，得到線性方程y=0.005 3x-0.003 4，R2=0.999 7，其中x為NO濃度（μmol/L），y為吸光度。

分別設(shè)置空白組、對(duì)照組、LPS陽(yáng)性對(duì)照組以及藥物組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL并于96孔板中接種，100 μL/孔，空白組加無(wú)血清培養(yǎng)液100 μL/孔，邊緣均填充 PBS，200 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)血清培養(yǎng)液配制多糖樣品濃 度 分 別 為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 和 1 600 μg/mL備用；LPS配制為2 μg/mL?？瞻捉M、對(duì)照組加無(wú)血清培養(yǎng)液100 μL/孔，LPS組加100 μL 2 μg/mL的LPS溶液，藥物組分別加100 μL不同濃度的多糖樣品，37 ℃孵育24 h。小心轉(zhuǎn)移100 μL上清液至一個(gè)新的96孔板中，并加入100 μL配制好的Griess試劑，在室溫下振蕩10 min，于540 nm處測(cè)定吸光度，將其代入上述線性方程式中即可獲得NO的濃度。

1.3.6 MTT實(shí)驗(yàn)

如1.3.5處理細(xì)胞，吸走上清后，每孔加入10 μL MTT溶液，避光，37 ℃孵育4 h。小心吸走上清液，加入DMSO 150 μL/孔，室溫振蕩10 min，于492 nm處測(cè)定其吸光度，并按公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)選用Design expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度對(duì)總多糖含量的影響

如圖1所示，提取溫度在60～90 ℃時(shí)，總多糖含量隨著提取溫度的升高而增大，90 ℃時(shí)總多糖含量達(dá)到最大值。此后繼續(xù)升高溫度，總多糖含量有所下降，因此最佳提取溫度選擇為90 ℃。這可能是因?yàn)樘崛囟鹊陀?0 ℃時(shí)，隨著溫度的不斷升高，分子熱運(yùn)動(dòng)速度加快，多糖溶出的速率也隨之增快；而超過(guò)90 ℃時(shí)溫度過(guò)高，導(dǎo)致多糖發(fā)生降解[6]，所以總多糖含量降低。此外，高溫也會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶于溶劑的速度增快，不利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

圖1 溫度對(duì)總多糖含量的影響

2.2 提取時(shí)間對(duì)總多糖含量的影響

如圖2所示，提取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)總多糖含量有明顯的影響。提取時(shí)間在20～60 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，總多糖含量呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，并且在60 min達(dá)最大值，隨后逐漸降低，因此最佳提取時(shí)間選擇為60 min。當(dāng)提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，油茶果殼粉末與水未充分接觸，因此不能將多糖充分提取出來(lái)，總多糖含量相對(duì)較低；但是當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)造成一定程度上的破壞[7]，導(dǎo)致總多糖含量下降。

圖2 提取時(shí)間對(duì)總多糖含量的影響

2.3 料液比對(duì)總多糖含量的影響

如圖3所示，總多糖含量隨著用水量的增加先是不斷增加，在料液比為1∶30時(shí)達(dá)到最大，之后有所降低，故最佳料液比選擇為1∶30（g∶mL）。料液比過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)總多糖含量造成影響，過(guò)高會(huì)使油茶果殼粉末無(wú)法充分吸水[8]，導(dǎo)致總多糖的提取率較低；比值過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致提取出來(lái)的總多糖濃度過(guò)低。

圖3 料液比對(duì)總多糖含量的影響

2.4 響應(yīng)面法對(duì)油茶果殼多糖提取工藝的優(yōu)化

響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design expert 8.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，設(shè)提取溫度、提取時(shí)間、料液比分別為A、B、C，以總多糖含量為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型為Y=101.19+17.83A-2.31B-2.89C-0.14AB-2.99AC-4.69BC+1.32A2+1.45B2-0.53C2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化總多糖含量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

進(jìn)一步對(duì)模型及回歸系數(shù)進(jìn)行回歸分析，總多糖含量模型及回歸分析結(jié)果如表3所示?；貧w模型P＜0.000 1（極顯著），其失擬項(xiàng)P=0.272 8＞0.050 0（不顯著），說(shuō)明模型擬合程度良好，可以對(duì)回歸方程相應(yīng)回歸值進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)模型回歸系數(shù)R2=0.975 4（＞0.800 0），調(diào)節(jié)后的回歸系數(shù)R2=0.943 7，表明94.73%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，方程可靠性較高。

表3 總多糖含量模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果

分析相關(guān)數(shù)據(jù)可知，一次項(xiàng)溫度對(duì)總多糖含量的影響極顯著（P＜0.000 1），料液比對(duì)總多糖含量的影響顯著（P＜0.05），提取時(shí)間對(duì)總多糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。分析各因素的主效應(yīng)關(guān)系為A＞C＞B，即溫度＞料液比＞提取時(shí)間。其二次項(xiàng)交互作用BC對(duì)總多糖含量的影響顯著（P＜0.05），AB、AC對(duì)總多糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)回歸方程模型，得到預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為提取溫度99.948 ℃、提取時(shí)間74.546 min、料液比1∶20.922（g∶mL），根據(jù)實(shí)際情況將該條件修正為提取溫度100 ℃、提取時(shí)間74.5 min、料液比1∶21（g∶mL）（根據(jù)實(shí)驗(yàn)可調(diào)整的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置）。在此最優(yōu)條件下經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到實(shí)際的總多糖含量為126.0 mg/g（按照最優(yōu)參數(shù)做實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果），與預(yù)測(cè)值總多糖含量（127.2 mg/g）相差不大，證實(shí)了預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的良好相關(guān)性。

2.5 油茶果殼多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放的影響

采用Griess法測(cè)定NO的釋放量，用于指示油茶果殼多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫活性的影響[9]。如圖4所示，對(duì)照組中RAW264.7細(xì)胞所釋放出的NO量比較少，為（1.84±0.45）μmol/L。陽(yáng)性對(duì)照LPS組中RAW264.7細(xì)胞所釋放出的NO量顯著增加，為（32.34±0.64）μmol/L。當(dāng)給藥濃度逐漸增大時(shí)，RAW264.7細(xì)胞所釋放出的NO量也隨之增加，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，并且在給藥800 μg/mL時(shí)達(dá)到最大[（34.71±1.93）μmol/L]。此外，油茶果殼多糖相較LPS而言，作用更為溫和，濃度為12.5～400.0 μg/mL時(shí)，藥物組中RAW264.7細(xì)胞所釋放出的NO量[（9.87±1.76）～（31.37±2.37）μmol/L]要低于陽(yáng)性對(duì)照LPS組[（32.34±0.64）μmol/L]。以上結(jié)果說(shuō)明油茶果殼多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。

圖4 油茶果殼多糖對(duì)NO釋放的影響

2.6 油茶果殼多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，用于指示油茶果殼多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響程度。如圖5所示，在濃度為12.5～50.0 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率高于對(duì)照組，說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)油茶果殼多糖起到促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖的效果，對(duì)其并無(wú)毒性。而當(dāng)濃度在100.0～800.0 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì)，具有一定的抑制作用，但是其抑制率并未超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照LPS組，表明油茶果殼多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的抑制作用較弱。

圖5 油茶果殼多糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化熱水提取油茶果殼中的總多糖，能夠較好地將多糖原有的結(jié)構(gòu)保留下來(lái)，且方法成本低，操作較為簡(jiǎn)便。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油茶果殼總多糖的最佳提取工藝條件為溫度100 ℃、提取時(shí)間74.5 min、料液比為1∶21（g∶mL），預(yù)測(cè)可得總多糖含量127.2 mg/g，經(jīng)3次平行試驗(yàn)實(shí)際得到總多糖含量為126.0 mg/g，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明該提取條件可行。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示油茶果殼多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，值得進(jìn)一步深入研究。