陳耐寒， 撒亞蓮

（昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，云南 昆明 650032）

細(xì)胞治療是除藥物、手術(shù)、放化療外，以活細(xì)胞制劑為主要成分來(lái)治療或預(yù)防疾病的技術(shù)[1]。目前，細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)是干細(xì)胞和免疫細(xì)胞，均需遵照中國(guó)國(guó)家法律、法規(guī)與行政管理規(guī)定，其細(xì)胞來(lái)源、生產(chǎn)工藝和臨床應(yīng)用過(guò)程均需在符合倫理要求的前提下開(kāi)展臨床研究[2-4]。

支原體（Mycoplasma）是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中常見(jiàn)的外源性污染物[5]，開(kāi)展支原體污染檢測(cè)是細(xì)胞質(zhì)量控制微生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)體系中的一項(xiàng)重要內(nèi)容[6]。由于活細(xì)胞制劑終產(chǎn)品不能滅菌處理，且《中華人民共和國(guó)藥典》[7]規(guī)定的培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）檢測(cè)支原體所需的時(shí)間較長(zhǎng)，在細(xì)胞制劑終產(chǎn)品進(jìn)入人體前不能獲得檢測(cè)結(jié)果，因而非常有必要建立細(xì)胞制劑放行檢測(cè)的高時(shí)效性支原體檢測(cè)方法。本文對(duì)支原體的生物學(xué)特性，以及支原體的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)法和核酸檢測(cè)法的特點(diǎn)進(jìn)行綜述，為開(kāi)展細(xì)胞制劑質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)體系建設(shè)提供參考。

1 支原體的生物學(xué)特性

支原體是一類(lèi)廣泛存在于自然界的、最小的、沒(méi)有細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3 μm，可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中常使用的0.22～0.45 μm濾器，導(dǎo)致預(yù)防支原體污染的難度增加。支原體于1956年被正式命名，自1898年法國(guó)科學(xué)家Nocard和Roux首次分離該類(lèi)微生物以來(lái)，現(xiàn)已分離出近200種支原體[8]。支原體為柔膜體綱（Mycoplasmas），在支原體目里有支原體科（Mycoplasmataceae）、無(wú)膽甾原體科（Cholesterogen free）和螺原體科（Spiroplasmataceae），其中支原體科由支原體屬（Mycoplasma）與脲原體屬（Ureaplasma）組成，支原體屬有肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）、人型支原體（Mycoplasma hominis）、生殖支原體（Mycoplasma genitalium）、穿透支原體（Mycoplasma penetrating）和發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans）等75余種。支原體革蘭染色為陰性，吉姆薩染色為陽(yáng)性[8-9]。

支原體生長(zhǎng)緩慢，適宜的生長(zhǎng)溫度為35 ℃，pH值為7.6～8.0；但脲原體的最適pH值為6.0～6.5。支原體抵抗力較弱，對(duì)熱、干燥、75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，對(duì)紅霉素、螺旋霉素、四環(huán)素、卡那霉素和鏈霉素等抗菌藥物敏感，對(duì)青霉素類(lèi)抗菌藥物不敏感。支原體廣泛存在于自然界，種類(lèi)繁多，但僅部分支原體對(duì)人類(lèi)有致病性，一般通過(guò)黏附在宿主上皮細(xì)胞表面成為人類(lèi)、動(dòng)物和植物的寄生物，通過(guò)攝取宿主細(xì)胞的膽固醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和/或代謝產(chǎn)生的毒素、過(guò)氧化氫等有毒物質(zhì)危害人類(lèi)和動(dòng)植物，給細(xì)胞制劑和科研工作帶來(lái)負(fù)面影響。有的支原體可以進(jìn)入人類(lèi)細(xì)胞，如滲透支原體，可通過(guò)胞內(nèi)定位能力保護(hù)其免受宿主免疫系統(tǒng)和藥物的清除，導(dǎo)致隱性感染和慢性感染，使細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體污染難以清除[5，8-10]。由此可見(jiàn)，細(xì)胞制劑支原體污染監(jiān)測(cè)及防治工作具有重要意義。

2 支原體污染對(duì)細(xì)胞的影響

培養(yǎng)細(xì)胞被支原體污染是世界范圍的共性問(wèn)題。有研究結(jié)果表明，在污染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了口腔支原體（Mycoplasma oral）、豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）、精氨酸支原體（Mycoplasma arginine）、萊氏無(wú)膽甾原體（Acholeplasma laidlawii）等20余種支原體，有的細(xì)胞株可以同時(shí)被2種及以上的支原體污染[8-9，11]。支原體污染細(xì)胞初期一般不容易觀察到細(xì)胞增殖和形態(tài)的改變；但被支原體嚴(yán)重污染，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，折光性降低，細(xì)胞間出現(xiàn)膜片狀的黏附結(jié)構(gòu)；宿主細(xì)胞的核酸蛋白合成受到抑制會(huì)產(chǎn)生影響細(xì)胞存活的某些酶和細(xì)胞因子，使細(xì)胞的增殖受到抑制甚至停止，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞碎片越來(lái)越多，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由此可見(jiàn)，支原體污染存在潛在的巨大危害，因此，開(kāi)展支原體污染檢測(cè)是細(xì)胞制劑質(zhì)量保障的重要措施，是細(xì)胞制劑原材料制備、生產(chǎn)過(guò)程和終產(chǎn)品質(zhì)量控制的核心指標(biāo)。

支原體污染與細(xì)胞質(zhì)量管理的5個(gè)影響因素（人員、設(shè)備、材料、方法和環(huán)境）密切相關(guān)，其來(lái)源包括污染的培養(yǎng)基、動(dòng)物血清、胰蛋白酶，已污染的培養(yǎng)物氣溶膠、已污染的培養(yǎng)箱以及操作人員等[5，8-9]；預(yù)防支原體污染涉及生產(chǎn)過(guò)程中的每個(gè)環(huán)節(jié)，必須嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量管理規(guī)定，嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝和作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行細(xì)胞制劑的生產(chǎn)，重視原材料、生產(chǎn)過(guò)程和終產(chǎn)品的質(zhì)量與監(jiān)測(cè)是預(yù)防支原體污染的重要前提和有效措施。

3 支原體的檢測(cè)方法

3.1 支原體的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

支原體大小為0.1～0.3 μm，形態(tài)各異，有球狀、環(huán)狀、絲狀、分枝狀；支原體無(wú)細(xì)胞壁，有細(xì)胞膜，胞內(nèi)有核糖體、線粒體、多種酶類(lèi)、RNA以及環(huán)狀雙鏈DNA。細(xì)胞制劑如果被支原體污染，用透射/掃描電鏡可觀察到在細(xì)胞表面和/或細(xì)胞核外、細(xì)胞周?chē)?、?xì)胞間隙有支原體黏附，透射電鏡可以觀察到支原體胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)[10]，但是電鏡觀察結(jié)果與操作者的技能和經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，而且耗時(shí)長(zhǎng)，儀器昂貴。桂馨等[12]用二苯甲酰胺熒光染料（Hoechst33342）直接染色活細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞周?chē)蚣?xì)胞膜上有大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆?；蚪z狀物，推測(cè)為支原體，但在污染初期不易被發(fā)現(xiàn)，易出現(xiàn)假陰性；細(xì)胞碎片因容易被染料著色，而出現(xiàn)假陽(yáng)性。支原體經(jīng)吉姆薩染色后，在光學(xué)顯微鏡下呈淡紫色，染色方法簡(jiǎn)便、快捷；用相差顯微鏡如觀察到細(xì)胞表面和細(xì)胞之間有暗色微小顆粒，可判讀為支原體陽(yáng)性。但是支原體形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法需要技術(shù)人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性差，支原體污染的直接證據(jù)是分離、培養(yǎng)到支原體，因此需要采用培養(yǎng)法進(jìn)一步判定是否為支原體污染。

3.2 支原體的培養(yǎng)法檢測(cè)

《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的支原體檢測(cè)方法培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是檢測(cè)支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，能夠檢測(cè)不同生長(zhǎng)特性的支原體，具有廣譜性，但敏感性低，耗時(shí)長(zhǎng)[7，11，13]。

支原體生長(zhǎng)緩慢，能夠在無(wú)生命培養(yǎng)基生長(zhǎng)、繁殖；有的可在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如肺炎支原體；有的在細(xì)胞上生長(zhǎng)得更好，如豬鼻支原體；有的尚不能培養(yǎng)，如植原體。但由于支原體DNA中編碼氨基酸和輔助因子的基因極少，缺乏糖異生、三羧酸循環(huán)等代謝途徑中的許多重要基因，使得支原體生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求比一般細(xì)菌要高，除需要含有牛肉浸液、酵母浸粉、豬胃消化液、葡萄糖、精氨酸等蛋白胨的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需加入10%～20%人或動(dòng)物血清，用于提供支原體生長(zhǎng)、繁殖所需的膽固醇。基于支原體是分解葡萄糖還是利用精氨酸，分為2類(lèi)支原體培養(yǎng)體系。解脲支原體雖然不能利用葡萄糖或精氨酸，但可以利用精氨酸水解生成的尿素；另外，根據(jù)培養(yǎng)體系中是否有瓊脂及其含量又可分為液體、半固體與固體培養(yǎng)體系[5，7，9，11，13]。

在富含葡萄糖的支原體肉湯培養(yǎng)基中，支原體可因分解葡萄糖產(chǎn)酸，從而使液體培養(yǎng)基顏色變黃（pH值下降為酸性）；精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基顏色變?yōu)樘壹t色可提示有支原體生長(zhǎng)，其可分解尿素，產(chǎn)生氨，使pH值上升為堿性；在半固體培養(yǎng)基中如觀察到沿接種線呈煙霧狀，則提示有支原體生長(zhǎng)；在支原體瓊脂固體培養(yǎng)基上可觀察到圓形房頂樣菌落，隨著傳代培養(yǎng)可觀察到“油煎荷包蛋”樣菌落，呈圓形，核心部分較厚，向下長(zhǎng)入培養(yǎng)基，周邊為1層薄的透明顆粒區(qū)。

指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是用已被證實(shí)無(wú)支原體污染的Vero細(xì)胞或其他傳代細(xì)胞作為指示細(xì)胞，將待檢測(cè)細(xì)胞（供試品）經(jīng)無(wú)抗菌藥物培養(yǎng)液至少傳1代，然后取細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)，且3 d未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液2 mL，加入到有指示細(xì)胞的培養(yǎng)孔，孵育3～5 d，傳代到有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)3～5 d，再用固定液固定，熒光染料（Hoechst33342）染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，陰性對(duì)照組僅指示細(xì)胞核有熒光染色，支原體污染組可在細(xì)胞核或細(xì)胞周?chē)^察到大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒，或絲狀的熒光帶[12]。

培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）檢測(cè)到的支原體均為活的支原體，一旦檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性，即可證明樣本中確實(shí)存在支原體污染。但是這2種方法仍具有一定的局限性：（1）2種檢測(cè)方法都需要較長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)法需要進(jìn)行次代培養(yǎng)，耗時(shí)28 d；指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）從指示細(xì)胞復(fù)蘇，再經(jīng)過(guò)盲傳，約需14 d；（2）2種方法成本均較高，要求檢測(cè)人員具有熟練技術(shù)；（3）2種方法均不能明確支原體的亞型。鑒于此，培養(yǎng)法雖然是檢測(cè)支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但不適用于細(xì)胞制劑終產(chǎn)品的放行檢測(cè)。當(dāng)然，這并不意味著應(yīng)取消細(xì)胞制劑終產(chǎn)品的支原體培養(yǎng)法檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果可用于細(xì)胞制劑放行檢測(cè)的驗(yàn)證。因此，選擇和/或建立適宜的細(xì)胞制劑終產(chǎn)品放行檢測(cè)的快捷、特異、敏感的支原體檢測(cè)方法非常必要。

3.3 支原體的核酸檢測(cè)

目前，核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（nucleic acid amplification technique，NAAT）因快速、特異、敏感、高效已成為支原體快速檢測(cè)的首選方法[5，9，13-15]。世界衛(wèi)生組織建議建立以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的快速放行檢測(cè)方法，并要求進(jìn)行定量分析[16]。支原體的核酸檢測(cè)主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增支原體基因組中某段特異性核酸保守序列來(lái)判斷是否有支原體污染。近年來(lái)，隨著NAAT的發(fā)展，在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上建立了巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片、滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、數(shù)字PCR、PCR產(chǎn)物-直接測(cè)序與高通量測(cè)序[又稱(chēng)“下一代”測(cè)序（next generation sequencing，NGS）]等檢測(cè)技術(shù)[13-23]。每種方法各有其優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)，NGS通量高，無(wú)需設(shè)計(jì)特定的探針，在短時(shí)間內(nèi)可獲得支原體基因組的全部信息，且準(zhǔn)確度高、成本相對(duì)低，但操作復(fù)雜，需有專(zhuān)門(mén)的分析軟件和操作系統(tǒng)，且設(shè)備昂貴。

NAAT檢測(cè)結(jié)果僅可提示細(xì)胞制劑中存在支原體基因組，但不能判斷支原體是否存活，是否為支原體相近種屬的微生物污染；也不能排除是否存在環(huán)境和/或試劑中的支原體核酸或質(zhì)粒污染；且支原體種類(lèi)繁多，設(shè)計(jì)擴(kuò)增廣譜性與特異性目的片段的PCR擴(kuò)增引物有難度。支原體核酸提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序等均對(duì)擴(kuò)增目的片段的效率有影響，可因無(wú)法檢測(cè)到個(gè)別基因丟失或未轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致假陰性。另外，在支原體與環(huán)境的交互作用中，容易出現(xiàn)基因組DNA變異，為設(shè)計(jì)特異性引物帶來(lái)困難。因而，基于PCR技術(shù)的支原體核酸檢測(cè)尚不能代替“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，但可作為細(xì)胞制劑的快速放行檢測(cè)方法。值得注意的是，開(kāi)展支原體核酸檢測(cè)時(shí)，需要對(duì)同一份樣本采用支原體“金標(biāo)準(zhǔn)”方法檢測(cè)，以驗(yàn)證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，方能確定其能否成為支原體的快速檢測(cè)方法。

3.4 支原體的其他檢測(cè)方法

支原體細(xì)胞膜有3層，厚度為7.5～10.0 nm，內(nèi)外2層主要為蛋白質(zhì)和多糖，中間層以含膽固醇的脂質(zhì)成分為主。檢測(cè)支原體細(xì)胞膜蛋白的Western blot技術(shù)是研究支原體致病機(jī)制的切入點(diǎn)，可確定是否存在支原體污染，但該技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、操作流程多，不適宜用于細(xì)胞制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)體系中的支原體檢測(cè)。支原體能在孵化10～12 d的雞胚絨毛尿囊膜中生長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)周期等因素會(huì)影響其在細(xì)胞制劑放行檢測(cè)中的使用。尿核苷/尿嘧啶吸附比率、放射自顯影法、支原體RNA聚丙烯酰胺法、瓜氨酸測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等支原體檢測(cè)方法[24]，也不適宜用于細(xì)胞制劑的檢測(cè)。

4 總結(jié)

支原體是介于細(xì)菌和病毒間的、能獨(dú)立存活的一類(lèi)最小的原核細(xì)胞型微生物，廣泛存在于自然界，種類(lèi)繁多，是生物制品與細(xì)胞制劑中最常見(jiàn)的外源性微生物污染因子。支原體污染的直接證據(jù)是分離培養(yǎng)到支原體，培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）是支原體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；基于PCR技術(shù)的NAAT快速、特異、敏感、高效，但有假陰性的可能；NGS越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于微生物宏基因組學(xué)研究，在1次測(cè)序反應(yīng)中可獲取支原體類(lèi)型、耐藥與毒力等相關(guān)基因信息，對(duì)細(xì)胞制劑質(zhì)量監(jiān)測(cè)及其評(píng)價(jià)體系的建立具有重要意義，或可成為檢測(cè)細(xì)胞制劑終產(chǎn)品微生物污染的新型工具。支原體污染重在預(yù)防，對(duì)于細(xì)胞制劑生產(chǎn)過(guò)程中的原材料、生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)與細(xì)胞庫(kù)的樣品與活細(xì)胞制劑的放行檢測(cè)，建議采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的PCR快速檢測(cè)或NGS，聯(lián)合支原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”檢測(cè)方法。圍繞人員、設(shè)備、物料、方法、環(huán)境開(kāi)展好細(xì)胞制劑的質(zhì)量管理工作是預(yù)防支原體污染的關(guān)鍵；嚴(yán)格執(zhí)行細(xì)胞制備相關(guān)的管理制度和操作規(guī)程是保證細(xì)胞質(zhì)量的核心要素[25-26]。生物學(xué)領(lǐng)域科技水平飛速發(fā)展，相信快速、高效、特異性好、靈敏度高，兼顧廣譜性的支原體檢測(cè)方法會(huì)不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)。