殷全玉，匡志豪，王 景，任天寶，張松濤，姬小明，劉國順，穆耀輝

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 陜西省煙草公司商洛市公司，陜西 商洛 726000）

煙草黑脛病是由煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的一種土傳真菌病害[1]，其有效防治是煙葉生產(chǎn)中面臨的突出性難題[2]。目前，煙草黑脛病仍以化學(xué)防治為主[3]，但大量施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致病原菌抗性增強、煙葉品質(zhì)降低，同時對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一系列負面影響。因此，探索煙草生產(chǎn)中的綠色防控措施，是減少病害損失、實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)、維護煙區(qū)生態(tài)環(huán)境安全的重要途徑。

木霉菌是一類普遍存在于土壤中的重要生防資源，能夠?qū)?8 個屬20 余種病原真菌表現(xiàn)出拮抗作用，在生物防治中備受關(guān)注[4?6]。田艷艷等[7]通過平板對峙試驗發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉對尖孢鐮刀菌和煙草疫霉菌有較強的拮抗作用。陳小均等[8]研究表明，哈茨木霉T150 孢子懸液蘸根和灌根能有效降低煙草黑脛病的發(fā)生，小區(qū)和大區(qū)示范試驗防治效果均達76%以上。研究顯示，木霉菌通過誘導(dǎo)植物體內(nèi)POD（過氧化物酶）、PPO（多酚氧化酶）、PAL（苯丙氨酸解氨酶）和CAT（過氧化氫酶）等防御性酶活性升高，產(chǎn)生多種抗菌因子，抵制病原菌入侵，有效降低病害發(fā)生[9?11]。朱洪江[12]研究表明，與清水處理對照相比，經(jīng)哈茨木霉菌孢子懸液灌根后煙草青枯病發(fā)病率由73.33%降至47.00%以下，POD 和PAL 活性顯著升高。此外，木霉菌作為重要的植物根際促生菌（Plant growth?promoting fungi，PGPF），能加快植株對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收，促進宿主生長[13]。近年來，關(guān)于木霉菌對植物促生防病效果的報道[14?15]已有很多，但由于植物品種差異，木霉對其生理代謝過程的影響及防病效果均存在差異。劉朝輝等[16]利用哈茨木霉T23孢子懸浮液分別處理黃萎病不同抗性茄子品種，結(jié)果顯示，各品種防御性酶活性較清水處理均明顯升高，相同處理下不同品種幼苗POD、PPO、SOD（超氧化物歧化酶）活性存在差異；杜安楠等[17]研究表明，木霉菌能有效提高草莓植株的植物學(xué)性狀、生理指標(biāo)和抗病酶活性，但不同品種間作用效果存在較大差異。目前，關(guān)于哈茨木霉對烤煙生長、生理特性以及防病效果的影響尚缺乏系統(tǒng)研究。鑒于此，初步探索了哈茨木霉對3 個黑脛病不同抗性烤煙品種生長發(fā)育、黑脛病發(fā)病情況和防御性酶活性的影響，旨在明確烤煙生產(chǎn)中木霉菌劑的使用效果，為綠色煙葉生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試烤煙品種 黑脛病高抗品種G28、中抗品種K326、高感品種凈葉黃均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值自然。燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OA）：60 g 燕麥仁，20 g 蔗糖，8 g 瓊脂，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.1.3 供試菌株 哈茨木霉CGMCC23294 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供，煙草疫霉由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院保存、提供。

1.1.4 菌液制備 將哈茨木霉接入PDA 平板，（27±1）℃培養(yǎng)5～7 d 后用無菌水將孢子沖洗下來，制成1×107cfu/mL 哈茨木霉孢子懸浮液備用。將煙草疫霉接入OA 培養(yǎng)基，（26±1）℃培養(yǎng)6～7 d 后用無菌水將孢子沖洗下來，并制成1×105cfu/mL 疫霉孢子懸浮液備用。

1.2 試驗處理

試驗在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)煙草基地溫室大棚內(nèi)進行，盆栽土壤采用大田耕層土壤，除去雜草和碎石后過1 cm×1 cm 篩網(wǎng)，按1.83 g/kg 添加復(fù)合肥[m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1.5∶3]，充分混勻，裝入內(nèi)口徑20.5 cm、高度13.5 cm 的花盆，每盆裝土3 kg。

采用常規(guī)漂浮育苗方法，待煙苗長至移苗期裝盆移栽，移栽時利用哈茨木霉孢子懸浮液（1×107cfu/mL）進行灌根處理，每株煙接種20 mL，以清水灌根為對照（CK），每個烤煙品種接種木霉菌與未接種木霉菌處理各50株。

1.3 試驗測定指標(biāo)及方法

1.3.1 生物學(xué)性狀 移栽后28 d，測量各處理煙株株高、莖圍和葉面積（自上而下第5 片葉，葉面積=0.634 5×葉長×葉寬）；小心挖出完整煙株根部，抖落土壤，清洗干凈，吸干水分稱量地上部和地下部鮮質(zhì)量，計算根冠比（地下部鮮質(zhì)量/地上部鮮質(zhì)量）。利用EPSON 根系掃描儀完整掃描根部，將掃描后圖像存入計算機，通過WinRHIZO分析總根長、根表面積、平均根直徑、根體積和分支數(shù)，掃描后的根部同地上部于105 ℃殺青15 min 后，70 ℃烘干稱質(zhì)量，各處理重復(fù)5次，每次重復(fù)3株。

1.3.2 生理生化指標(biāo) 分別在移栽后7、14、21、28 d 對各處理取樣，按照丙酮-乙醇提取法測定葉綠素含量，采用TTC 法測定根系活力，采用活體分光光度法測定根系硝酸還原酶活性，每個處理5 次重復(fù)。

1.3.3 防治效果及誘導(dǎo)抗性指標(biāo) 煙苗移栽后28 d，采用灌根接種法取配制好的煙草疫霉孢子懸浮液（1×105cfu/mL）20 mL/株均勻接種至煙株根部土壤，14 d 后調(diào)查發(fā)病率，計算病情指數(shù)及防治效果，取各處理煙株根部按趙世杰等[18]方法測定POD、PAL、PPO 和CAT 活性，5 次重復(fù)。煙草黑脛病分級標(biāo)準(zhǔn)參照煙草病蟲害分級及調(diào)查方法（GB/T 23222—2008）。發(fā)病率=[病葉（株）數(shù)/調(diào)查總?cè)~（株）數(shù)]×100%，病情指數(shù)=∑（病級數(shù)×該級病株數(shù)）/（最高病級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100，

防治效果=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2019 和SPSS 25.0 進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉對不同烤煙品種生物學(xué)性狀的影響

2.1.1 地上部生物學(xué)性狀 由表1 和圖1 可知，移栽后28 d，經(jīng)哈茨木霉處理的各烤煙品種煙株株高、莖圍、葉面積均顯著高于清水處理，說明哈茨木霉對煙草地上部生長具有顯著促進作用。與CK 相比，接種哈茨木霉后K326 株高、莖圍和葉面積提高最顯著，增幅分別為54.21%、32.83%和67.42%，其次是G28，增幅分別為39.00%、21.45%和47.09%。綜合各生長指標(biāo)促進效果來看，哈茨木霉對煙草葉片和株高生長的促進效果強于對莖圍生長的促進效果，即葉面積>株高>莖圍。接種哈茨木霉后，各烤煙品種間仍以K326 長勢最好，其次是凈葉黃，兩品種煙株葉面積較為接近，相比G28擴展能力更強。

圖1 哈茨木霉對不同烤煙品種煙株長勢的影響Fig.1 Effects of Trichoderma harziana on the growth of different flue-cured tobacco varieties

表1 哈茨木霉對不同烤煙品種地上部農(nóng)藝性狀的影響Tab.1 Effects of Trichoderma harziana on agronomic traits of shoot of different flue-cured tobacco varieties

2.1.2 地下部生物學(xué)性狀 由表2 和圖2 可知，烤煙移栽時利用哈茨木霉孢子懸浮液灌根對各烤煙品種根部發(fā)育有不同程度的促進作用。與CK 相比，移栽后28 d，哈茨木霉處理各烤煙品種根體積和分支數(shù)增幅較大，均達80%以上；其中K326 平均根直徑和根體積增加更顯著，3 個品種總根長和根表面積增幅接近。說明哈茨木霉處理有利于煙株根系擴展，促使根系發(fā)達。接種哈茨木霉后，G28和凈葉黃各根系指標(biāo)相近，均低于K326。綜合各烤煙品種煙株根系發(fā)育指標(biāo)分析，K326在哈茨木霉作用下長勢更好。

圖2 不同處理下各烤煙品種的根系掃描結(jié)果Fig.2 Root scanning results of flue-cured tobacco varieties under different treatments

表2 哈茨木霉對不同烤煙品種煙株根系發(fā)育的影響Tab.2 Effects of Trichoderma harziana on root development of different flue-cured tobacco varieties

2.1.3 煙草生物量積累 由表3 可知，哈茨木霉處理后各烤煙品種地上部和地下部生物量積累均顯著高于CK。與CK 相比，不同烤煙品種地下部鮮質(zhì)量增加均在80%以上，略高于地上部鮮質(zhì)量增幅。3 個品種中，K326 地下部鮮質(zhì)量和地上部鮮質(zhì)量分別提高84.16%和82.12%，增幅最大。接種哈茨木霉后，各烤煙品種地上部干質(zhì)量增幅均達78%以上，以凈葉黃地上部干質(zhì)量增幅（92.31%）最大，其次是G28（83.05%）。哈茨木霉接種后，凈葉黃煙株根冠比有所升高，但未達顯著水平，說明哈茨木霉能促進煙草地上部和地下部生物量積累，但對煙株根冠比的提高效果不顯著。

表3 哈茨木霉對不同烤煙品種生物量積累的影響Tab.3 Effects of Trichoderma harziana on biomass accumulation of different flue-cured tobacco varieties

2.2 哈茨木霉對不同烤煙品種生理特性的影響

2.2.1 葉綠素含量 由圖3 可知，各處理煙株葉片葉綠素含量隨移栽后時間延長逐漸增加，哈茨木霉接種后3 個品種葉綠素含量均表現(xiàn)為K326>凈葉黃>G28，且哈茨木霉接種處理顯著高于CK。其中K326和凈葉黃經(jīng)哈茨木霉灌根后葉綠素含量較CK增幅先升高后降低，在移栽后14 d 增幅達到峰值，分別為47.34%和46.86%；G28經(jīng)哈茨木霉處理后葉綠素含量較CK 增幅隨移栽后時間延長而逐漸降低，移栽后7 d 達到最大（39.89%）。移栽后28 d，哈茨木霉處理G28、K326 和凈葉黃葉綠素含量相比CK 增幅分別為27.76%、21.45%和20.14%。總體來看，哈茨木霉灌根后各烤煙品種葉綠素含量與CK差值隨移栽后時間延長而減小，但移栽后28 d 仍顯著高于CK。

圖3 哈茨木霉對不同烤煙品種葉片葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of Trichoderma harziana on chlorophyll content in leaf of different flue-cured tobacco varieties

2.2.2 根系活力 由圖4 可知，哈茨木霉處理可以不同程度地提高煙草根系活力，各烤煙品種根系活力隨移栽后時間延長而升高。哈茨木霉接種后，G28和凈葉黃根系活力較CK增幅在移栽后7 d達到最高，分別為22.42%和27.62%，K326根系活力在移栽后14 d較CK 提高21.89%，增幅達到最高；移栽后28 d，哈茨木霉處理G28、K326和凈葉黃根系活力較CK分別升高13.57%、11.81%和13.97%。

圖4 哈茨木霉對不同烤煙品種根系活力的影響Fig.4 Effects of Trichoderma harziana on root activity of different flue-cured tobacco varieties

2.2.3 根系硝酸還原酶活性 如圖5 所示，哈茨木霉灌根處理后3個烤煙品種根系硝酸還原酶活性均顯著高于CK。移栽后14 d，K326 硝酸還原酶活性最高，且較CK 增幅最大（46.32%），G28 增幅其次，為38.47%；移栽后14～28 d，G28 和凈葉黃根系硝酸還原酶活性迅速升高，3 個品種根系硝酸還原酶活性差異減小。哈茨木霉處理后，G28、K326、凈葉黃根部硝酸還原酶活性較CK 增幅分別在移栽后21、14、7 d 達到最高，移栽后28 d 三者硝酸還原酶活性分別較CK提高20.81%、29.83%、17.29%。

圖5 哈茨木霉對不同烤煙品種根系硝酸還原酶活性的影響Fig.5 Effects of Trichoderma harziana on nitrate reductase activity in roots of different flue-cured tobacco varieties

2.3 哈茨木霉對不同烤煙品種誘導(dǎo)抗性的影響

2.3.1 對煙草黑脛病的防治效果 由表4 可知，經(jīng)哈茨木霉灌根后，不同黑脛病抗性烤煙品種黑脛病發(fā)病率和病情指數(shù)較CK 均顯著降低，其中接種哈茨木霉對G28 黑脛病的防治效果最顯著，達到84.09%，病情指數(shù)由32.42 降至8.34；其次是K326，防治效果為75.94%。綜合各烤煙品種特性分析，哈茨木霉能有效拮抗煙草黑脛病，且接種哈茨木霉對煙草黑脛病的防治效果與烤煙自身抗性呈正相關(guān)，即在黑脛病高抗品種G28 上的防治效果優(yōu)于中抗品種K326和高感品種凈葉黃。

表4 哈茨木霉對不同烤煙品種黑脛病的拮抗效果Tab.4 Antagonistic effects of Trichoderma harziana on black shank disease of different flue-cured tobacco varieties

2.3.2 防御性酶活性 為探索哈茨木霉誘導(dǎo)煙株抗煙草黑脛病的機制，于煙株移栽后28 d 接種煙草疫霉孢子，14 d 后對煙株根系POD、PPO、PAL 和CAT 活性進行了分析。從表5 可看出，哈茨木霉對4種防御性酶活性具有激發(fā)效應(yīng)。

表5 哈茨木霉對不同烤煙品種防御性酶活性的影響Tab.5 Effects of Trichoderma harziana on defensive enzyme activities of different flue-cured tobacco varieties

哈茨木霉處理有助于提高各烤煙品種根系POD 活性，與CK 相比，高感品種凈葉黃POD 活性增幅（58.38%）略高于高抗品種G28和中抗品種K326，但高抗品種G28 的POD 活性高于中抗品種K326 和高感品種凈葉黃。

哈茨木霉菌處理可以不同程度地提高煙草根系PPO 活性，對高抗品種G28 作用效果最顯著，較CK 增幅為90.63%，其次是中抗品種K326，增幅為71.34%，高感品種凈葉黃增幅為57.52%。

與PPO 活性變化相反，哈茨木霉處理后，高感品種凈葉黃根系PAL 活性較CK 增幅最高，為69.44%；其次是中抗品種K326，增幅為51.56%；高抗品種G28增幅較低，僅為30.07%。

哈茨木霉處理能顯著提高煙草根系CAT 活性。與CK 相比，中抗品種K326 增幅為105.92%，高抗品種G28 和高感品種凈葉黃增幅分別為73.33%和80.00%。

綜上，哈茨木霉處理后，不同烤煙品種根系防御性酶活性均顯著升高，其中POD 活性受烤煙品種抗性影響較小，PPO 和PAL 活性變化趨勢相反，哈茨木霉灌根有利于激發(fā)烤煙根系CAT 活性；同時，黑脛病不同抗性烤煙品種防御性酶活性總體表現(xiàn)為高抗品種G28>中抗品種K326>高感品種凈葉黃。

3 結(jié)論與討論

目前，關(guān)于應(yīng)用木霉菌促進植物生長的報道已有很多，如伍曉麗等[19]發(fā)現(xiàn)，深綠木霉對不同品種青蒿株高、莖圍、地下部干質(zhì)量、地上部干質(zhì)量以及葉質(zhì)量均有促進作用，但各品種間作用效果存在差異。宋玉娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度棘孢木霉T-6孢子液對煙草株高、根長、葉面積以及生物量積累有顯著促進作用，但未進行多品種驗證。本研究選取不同烤煙品種進行哈茨木霉接種，避免了單一品種造成的差異性，接種哈茨木霉后各烤煙品種煙株株高、葉面積、總根長、根體積、地上部鮮質(zhì)量和地下部鮮質(zhì)量均較CK 顯著提高，其中總體以K326 以上各指標(biāo)提高最顯著，這可能是木霉菌株和烤煙品種之間的差異造成的。木霉菌代謝產(chǎn)物中含有促進種子萌發(fā)和幼苗生長的類植物生長素6-PP（6?n?pentyl?6H?pyran?2?one）以及可降解乙烯前體物質(zhì)的ACC 脫氨酶，緩解了乙烯對煙株生長的抑制作用[21?22]；在根系各指標(biāo)中，經(jīng)哈茨木霉處理后煙株總根長、根表面積、根體積和分支數(shù)顯著提高，說明哈茨木霉能夠通過增加側(cè)根、叢生根，延伸根系長度等方式形成發(fā)達的根系網(wǎng)絡(luò)，使得煙株根部與土壤間有更大的接觸面積和吸收范圍，能在更廣泛的土壤中獲取水和養(yǎng)分[23]。另外，部分微溶或難溶的礦物質(zhì)在木霉作用下溶解后被根系吸收，從而加快煙株生長[24]。本試驗結(jié)果顯示，接種哈茨木霉顯著促進了煙株各營養(yǎng)器官生長和生物量積累，增強了煙株長勢。

生理指標(biāo)變化是衡量植株生長質(zhì)量的重要依據(jù)，有研究表明，棘孢木霉和哈茨木霉通過灌根處理均能顯著提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、葉片硝酸還原酶活性等生理指標(biāo)[25]。本試驗中，煙株接種哈茨木霉后以上各生理指標(biāo)較CK 增加顯著，品種間表現(xiàn)為K326>凈葉黃>G28。NIELSEN等[26]研究發(fā)現(xiàn)，同一作物不同品種對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力存在一定差異。本試驗中，接種哈茨木霉后K326 煙株葉綠素含量最高，這對提高葉片光合速率，增加碳水化合物的形成和積累具有促進作用；同時，其根系活力和硝酸還原酶活性較其他2個烤煙品種更高，有利于提高根系對土壤水肥的吸收和對氮素的利用效率，從而促進煙株株高、葉面積、根體積擴展和生物量的積累，這也是木霉促進植物生長的機制之一。

活性氧和酚類化合物積累是植物應(yīng)對病原菌侵染的早期反應(yīng)[27]?；钚匝跤绊懼参锒喾N細胞的功能，過量的活性氧導(dǎo)致細胞處于氧脅迫狀態(tài)，引發(fā)膜脂過氧化，改變生物膜流動性，使酶失活和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，阻礙蛋白質(zhì)合成，造成核酸受損等，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性死亡[28?29]。POD、PPO、PAL、CAT 是植物體內(nèi)重要的防御性酶[30?31]，POD、CAT 是植物體內(nèi)清除活性氧的主要酶，且POD 能誘導(dǎo)木質(zhì)素的合成，清除胺類毒性[32]；PAL 是莽草酸-苯丙酸類代謝的限速酶，其活性是反映植物抗病性的重要指標(biāo)[33]；而PPO 可將多酚類物質(zhì)氧化為抗菌效應(yīng)更強的醌類物質(zhì)，被認(rèn)為是植物防御機制中的重要組成部分[34?35]。LIANG 等[36]發(fā)現(xiàn)，生防菌L8 能有效降低黃瓜猝倒病的發(fā)病率，同時幼苗根部和葉片POD、PPO、PAL 和CAT 活性較未接種L8 菌株的幼苗顯著升高。VANITHA 等[37]利用RT-PCR 方法證實，接種熒光假單胞菌后，番茄幼苗體內(nèi)PPO、PAL等防御性酶活性顯著提高，相關(guān)防御性酶合成基因表達水平升高，從而增強了番茄對青枯病的抗性。本試驗中，接種哈茨木霉均有效降低了不同烤煙品種煙草黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)，煙株根系防御性酶活性大幅升高。因此，哈茨木霉可能通過激發(fā)煙草體內(nèi)相關(guān)基因表達，提高酶活性共同參與防御反應(yīng)。其中G28 根系POD、PPO、PAL 和CAT 活性最高，分 別 較CK 提 高49.27%、90.63%、30.07% 和73.33%，對煙草黑脛病防治效果達到84.09%。不同抗性品種接種哈茨木霉對煙草黑脛病的防治效果表現(xiàn)為高抗品種G28>中抗品種K326>高感品種凈葉黃，說明G28 對哈茨木霉的響應(yīng)程度更高，雖然不同烤煙品種經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病能力存在差異，但總體上對黑脛病的抑制效果顯著。

綜合以上分析，哈茨木霉對不同烤煙品種植物學(xué)性狀、生理特性和生物量積累均有顯著促進作用，本試驗條件下對K326 作用效果最為顯著；在煙草疫霉脅迫下，哈茨木霉誘導(dǎo)提高了烤煙對煙草黑脛病的拮抗作用。