武奕鑫 王孝聰,2, 周振淞 何 晨 潘良浩 宋桂雪①

(1. 山東大學(青島)海洋研究院 山東青島 266237; 2. 中國石油大學(北京)理學院 北京 102249; 3. 中國石油大學(北京)重質(zhì)油國家重點實驗室 北京 102249; 4. 廣西科學院廣西紅樹林研究中心 廣西北海 536000)

海水中可通過0.45 μm 濾膜的天然有機物被定義為溶解性有機質(zhì)(dissolved organic matter, DOM)。DOM 是海洋有機碳庫的主體組分(＞95%) (Hansellet al, 2013), 在海洋生物地球化學循環(huán)中起著重要作用。海洋中大量的DOM 分子耐受生物降解, 周期可長達數(shù)千年, 被稱為惰性有機質(zhì)(refractory DOM,rDOM)。微型生物碳泵(microbial carbon pump, MCP)理論框架提出海洋中的活性DOM 可以通過微型生物代謝活動被轉(zhuǎn)化為rDOM, 是研究海洋碳匯的基礎(蔡阮鴻等, 2021), 研究DOM 和rDOM 分子組成及有機分子結(jié)構(gòu)有助于深入理解海洋碳匯過程及形成機制和生物效應。但由于DOM 是由成千上萬個分子組成的復雜天然有機質(zhì)混合物, 解析其結(jié)構(gòu)和分子組成一直是個難題和巨大挑戰(zhàn)(Arakawaet al, 2017;Zhanget al, 2018a)。

海水中DOM 含量低(0.5～2.0 mg C/L), 化學成分復雜、鹽度高(30～35), 受海水DOM 提取技術(shù)的限制,常見分析海水有機質(zhì)的方法有海水總碳總氮分析、紫外可見光譜(UV-vis)、三維熒光光譜(EEM)、分子排阻色譜(HP-SEC-TOC)、同位素分析(δ13C 和Δ14C)、溶解氨基酸等。但大多分析技術(shù)只能對DOM 整體組成、光敏成分(如有色溶解性有機質(zhì) chromophore DOM, cDOM; 熒光溶解性有機質(zhì)fluorescent DOM,fDOM)的大概類別及其初步來源等信息進行分析,想得到分子水平的組成和分子有機結(jié)構(gòu)等儀器表征信息, 還需借助超高分辨率質(zhì)譜和核磁共振波譜(NMR)等最先進的分析技術(shù)(Songet al, 2018; Liet al,2019), 這些表征技術(shù)均需要大量的DOM 樣品。此外,不同實驗室間的分析比對、微生物培養(yǎng)等也需要克級標準品/對照品的DOM 樣品, 這就需要高效富集提取出純度高(低鹽分)且性質(zhì)穩(wěn)定的DOM 固體樣品。

自20 世紀70 年代末開始采用XAD 系列大孔樹脂提取地表水DOM 以來, 研究人員陸續(xù)開發(fā)了超濾法(ultrafiltration, UF)、電滲析耦合反滲透法(reverse osmosis/electrodialysis, RO/ED) 以及固相萃取法(solid-phase extraction, SPE)等富集提取技術(shù)(Greenet al, 2015)。相較于其他固相萃取如C18)富集方法, Bond Elut PPL 樹脂(安捷倫, 經(jīng)修飾的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)固相萃取法在海水DOM 分析中的應用最為廣泛。Dittmar 等(2008)曾比較6 種固相萃取樹脂對海水 DOM 的富集效果, 結(jié)果表明 PPL 固相萃取(PPL-SPE)法更具有代表性, 且提取效率不隨鹽度變化降低, 此外該樹脂還適用于其他水體環(huán)境(Chenet al, 2016; Liet al, 2016)。將SPE 小柱方法擴大, 使用填充PPL (500 g)定制樹脂(玻璃柱)處理大體積海水已有報道(Greenet al, 2014), 但該方法的一些關(guān)鍵參數(shù)對回收率的影響未見報道。

基于PPL 小柱富集DOM 的原理, 本文進行了海水PPL-DOM (通過PPL 樹脂提取的DOM)富集放大實驗, 搭建了小型自動化兩級過濾、調(diào)酸、樹脂柱提取富集裝置, 完善了提取純化工藝; 同時, 本文測試了PPL 樹脂長期使用的穩(wěn)定性、重復性, 研究了上樣速率、洗脫體積等影響參數(shù)。應用該技術(shù)提取2 個近岸表層海水和1 個紅樹林濕地潮溝水等多個批次水樣的DOM, 裝置均運行可靠, 方法回收率穩(wěn)定。同時本文使用元素分析、熒光分析、紅外光譜、固態(tài)13C 核磁共振儀分析了樣品基本成分和結(jié)構(gòu)特征, 證明所提取樣品的可靠性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 水樣信息

鰲山灣表層海水: 夏季批次, 2019 年8 月1～8 日,青島鰲山灣北灣(36°22′55″N, 120°49′35″E); 秋冬春季批次, 分別于2020 年10 月7～21 日、2020 年12月3～28 日和2021 年4 月1～20 日在鰲山灣南灣(36°20′03″N, 120°42′27″E)采集; 威海市桑溝灣貝藻養(yǎng)殖區(qū)表層海水(采樣點以海帶養(yǎng)殖為主): 2021 年6月26 日采集, 位置37°05′51″N, 122°34′40″E。海水用聚乙烯水桶運回實驗室處理。紅樹林濕地潮溝水:2021 年5 月7～12 日, 位置為北海市峒尾紅樹林自然保護小區(qū)落潮潮溝(21°29′47″N, 108°59′44″E)。潮溝水樣采集后立即在廣西紅樹林研究中心處理。提取富集裝置流程圖見圖1。

1.2 DOM 提取流程

DOM 提取的自動化裝置包括過濾、泵送、調(diào)酸、樹脂柱吸附以及流出液酸堿中和等系統(tǒng), 以及DOM的洗脫、濃縮、純化和凍干過程(圖1)。

圖1 DOM 提取、富集和凍干流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the procedure of DOM extraction, purification and freeze-drying

提取流程包括: (1) 樹脂活化: 中壓玻璃層析柱(高50 cm, 內(nèi)徑5 cm)填裝200 g 新購Bond Elut PPL樹脂[柱床高度30 cm, 柱體積(BV) 600 mL]后, 3 倍柱體積(用3 BV 表示, 下文同)甲醇(色譜純)活化和3倍柱體積酸化水(優(yōu)級純鹽酸酸化的超純水, pH 2.0)淋洗。

(2) 過濾和上樣(步驟1～3): 精密蠕動泵(BT100-2J,保定蘭格恒流泵有限公司)泵送水樣過孔徑5 μm 聚乙烯熔噴棉濾芯凈水過濾器和混合纖維素酯濾膜(MCE,孔徑0.45 μm, 美國默克公司), 管線中水樣與0.1 mol/L稀鹽酸在線調(diào)節(jié)(混合瓶)酸化海水pH至2.0, 隨后水樣中的極性有機分子經(jīng)PPL 樹脂柱后被吸附, 流出液與堿液中性后排放。

(3) 脫鹽、干燥、洗脫和旋蒸(步驟4～7): 吸附完成后的樹脂柱用pH 值為2.0 的水淋洗除去樹脂中的絕大多數(shù)鹽分, 將柱子在真空干燥器(45 °C)干燥, 再使用高純氮(＞99.999%)徹底吹干樹脂。最后干燥后的樹脂經(jīng)甲醇(3～4 BV)洗脫得黃色洗脫液, 再經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40 °C)去除大部分甲醇近干(剩約20～30 mL),殘余甲醇用氮氣吹干, 加少量水稀釋混勻后凍干得淡黃色粉末狀PPL-DOM。

(4) 樹脂清洗: 洗脫后的PPL 樹脂使用甲醇(約15 BV)進行淋洗, 初步清洗(0～8 BV)可使用重蒸甲醇,最后使用色譜純甲醇(約7 BV)完成樹脂清洗, 若后續(xù)處理樣品為深遠海的低溶解有機碳(dissolved organic carbon, DOC)濃度海水, 建議整個清洗過程均使用色譜純甲醇進行清洗。清洗后的樹脂可使用高純氮吹干其中甲醇, 用于下一批次水樣的處理。

1.3 分析儀器與方法

1.3.1 DOC 測定 總有機碳分析儀(Shimadzu TOC-L, 日本)測定水樣DOC, 測定DOC 前需在約30 mL 樣品中添加40 μL 磷酸(85%～90%, HPLC 級)清除樣品中的無機碳。

1.3.2 甲醇洗脫液中DOC 濃度的估算 紫外分光光度計(Shimadzu UV2700, 日本)測定PPL-DOM 甲醇溶液中DOM 濃度; 標準溶液配制: 取已知碳含量PPL-DOM (碳含量46.7%)復溶于甲醇中, 配置成系列有機碳(OC)標準溶液(線性范圍1.0～20.0 mg/L)。測定溶液254 nm 吸光度(A), 經(jīng)計算得標準曲線:

式中,COC為甲醇溶液中PPL-DOM 有機碳濃度,A為DOM 甲醇溶液在254 nm 吸光度。該方法檢出限為0.5 mg C/L。

有色溶解性有機質(zhì)(cDOM)代表了DOM 中可吸收紫外可見光的組分, 一定程度上cDOM 的紫外吸收系數(shù)可以反映水體cDOM的豐度(郭衛(wèi)東等, 2018)。但不同環(huán)境水體cDOM 的吸光系數(shù)受有機質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響, 而cDOM 的化學結(jié)構(gòu)主要與其來源有關(guān)(李奕潔等, 2015), 如河口區(qū)cDOM 存在更多的陸地維管植物代謝產(chǎn)物貢獻, 而在遠海以浮游植物代謝產(chǎn)物貢獻為主, 這種cDOM 來源差異會導致不同水體DOM的吸光度與DOC 濃度之間的關(guān)系不一致。因此使用該方法只是用來估算甲醇中DOC 含量(半定量), 建議使用同一海域海水的DOM 配制標準溶液參比樣品來計算標準曲線公式。

1.3.3 元素分析 采用元素分析儀(Unicube,Elementar Analysensysteme GmbH, 德國)測定, 結(jié)果均已扣除樣品水分與灰分(水分: 馬弗爐75 °C, 兩次測定,直到恒重; 灰分: 馬弗爐550 °C, 灼燒5 h)。

1.3.4 紅外光譜(FTIR) 采用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS50, Thermo Scientific, 美國)測定, 光譜采集范圍 4 000～500 cm–1, 取約 1 mg 樣品與100 mg KBr 研磨壓片; Nicolet 軟件包Omnic 8.1 采集和處理。

1.3.5 三維熒光光譜 使用熒光光譜儀(HORIBA Aqualog?, HORIBA Scientific, 日本)進行EEM 分析,激發(fā)波長λEx240～600 nm, 發(fā)射波長λEm246～600 nm,掃描間隔3 nm, 掃描速度300 nm/min。樣品溶液中DOM 濃度為5 mg/L, 超純水作空白對照。

1.3.6 固態(tài)13C NMR 波譜 使用NMR 波譜儀(Avance NEO 600, Bruker, 德國; 150.90 MHz13C NMR)。樣品填裝于3.2 mm 圓柱氧化鋯轉(zhuǎn)子中測試,獲得全邊帶抑制交叉極化(Cross Polarization/Total Suppression of Sidebands, CP/TOSS)和偶極去相(dipolar dephasing, DD)13C NMR 譜圖(DD 譜圖中可以觀察未被H 取代的碳(non protonated)和易活動基團(如-OCH3和C-CH3)的信號), 譜圖使用金剛烷作標定。CP/TOSS 譜圖積分: 烷基碳(alkyl), 化學位移0×10－6～45×10－6, 氮碳/甲氧基(-NCH/-OCH3) 45×10－6～60×10－6, 碳水化合物(-OCH-, HOCH2-) 60×10－6～94×10－6, 碳水化合物端頭碳(-OCHO-) 94×10－6～110×10－6,烯烴碳/芳烴碳(olefins, aryl) 117×10－6～150×10－6, 取代芳香碳(aryl C-O/N-) 150×10－6～164×10－6, 羧基/酰胺(COO, -NC=O) 164×10－6～191×10－6, 酮/醛/蒽醌191×10－6～230×10－6(Maoet al, 2012a)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPL 固相萃取法主要影響參數(shù)

研究了PPL 小柱法放大的PPL 柱實驗參數(shù), 如控制吸附效率最關(guān)鍵的上樣速率、洗脫體積, 并評估了PPL 樹脂的重復使用性。

首先進行PPL 樹脂的空白測試。使用過濾后的超純水過清洗干凈的PPL 樹脂柱, 流出液DOC 0.08 mg C/L(RSD 12.0%), 該值接近測定低限(LOD) 0.040 mg/L,未發(fā)現(xiàn)有污染引入和樹脂流失。使用馬弗爐灼燒除碳的海鹽配置成人工海水(DOC 0.71 mg C/L, 相對標準偏差RSD 13.3%, 鹽度為34～35)泵送入清洗干凈的PPL 樹脂柱, 取流出液測定DOC (n=3), 人工海水流出液DOC 0.85 mg C/L (RSD 11.5%)。

2.1.1上樣流速 不同上樣流速對PPL 玻璃柱的DOC 吸附效率和DOC 回收率的影響見圖2。DOC 回收率為樹脂吸附前后水樣DOC 的差值與原水樣DOC值之比, 單位時間內(nèi)的DOC 回收率作為DOC 吸附效率。當流速從13 BV/h 降低到4 BV/h 時, DOC 吸附效率下降, 從5.52 mg C/h 減少到2.82 mg C/h; 而DOC 回收率升高較快, 從35%升高到56%, 即上樣較慢時, 雖然DOC 吸附效率稍低但回收率較高。流速在6～8 BV/h 時, DOC 吸附效率有較大程度的下降, 回收率均超過50%, 但回收率增長較緩。經(jīng)綜合考慮, 優(yōu)選8 BV/h 的上樣流速, DOC 吸附效率可達4.8 mg C/h, 一天(24 h)吸附有機碳115.2 mg (DOM 約230 mg)。

圖2 上樣流速對有機碳回收率及吸附效率的影響Fig.2 Effects of flow rate on DOC recovery and adsorption efficiency

2.1.2洗脫液體積 評估甲醇的洗脫體積對DOM回收率的影響。首先使用PPL 樹脂柱(200 g)富集2 400 L 鰲山灣海水(冬季批次), 隨上樣量增加每克PPL 樹脂DOC 回收率如圖3a 所示, 結(jié)果顯示DOC回收率穩(wěn)定在60%左右, 表明PPL樹脂未達到飽和吸附容量, 水樣中的大部分DOM 均被有效吸附至樹脂上。值得注意的是, 在以往的PPL 小柱研究中, 當PPL 樹脂負載過多即所吸附的DOM 過多時, 會導致后續(xù)被吸附DOM 的熒光信號和吸光度發(fā)生明顯變化,并導致回收率降低(Konget al, 2021)。這種樹脂過載導致的 DOM 熒光和化學分餾的變化會影響PPL-DOM 后續(xù)的分析, 因此PPL-DOM 樣品比較的前提是保持樹脂上的相對DOM 負載量相似, 避免吸附率降低導致的化學分級。

采用Dittmar 等(2008)的小柱方法中的甲醇作為洗脫溶劑, 甲醇相較于其他常見可與水混溶的有機溶劑(如乙醇、正己烷、乙腈等)極性最高, 可以洗脫PPL 樹脂上更多的被吸附的DOM 組分, 并且在后續(xù)旋蒸中極易被去除。每洗脫1.67 BV (即1L)甲醇, 取10 mL 的洗脫液, 測定其UV254值, 并根據(jù)公式(1)計算得到洗脫液中DOC 濃度(圖3b), 通過對圖3b 中曲線峰面積進行積分, 計算得用7 BV 可以將樹脂中75%以上的DOC 有效洗脫, 17 BV 的甲醇可以洗脫99%的DOM。圖3b 中可看出4～6 BV 洗脫體積時洗脫效率明顯降低, 為得到高濃度濃縮液, 本實驗室常選取前4 BV 的甲醇洗脫液進行旋蒸凍干, 4 BV 后的甲醇洗脫液則被收集重蒸(除去DOM), 重蒸甲醇可用于下一批次樹脂的初步清洗。

圖3 定制PPL-樹脂柱的DOC 回收率隨上樣海水體積的變化(a); 不同柱體積甲醇洗脫后中PPL-DOM 有機碳濃度(b)Fig.3 The DOC recovery in customized PPL-resin column with increase in seawater loading volume (a); DOC concentration of PPL-DOM in eluent after eluting with different bed volumes of methanol (b)

除上樣流速、上樣體積以及洗脫溶劑用量等因素,水樣pH 值也影響DOC 回收率。DOM 可以看作是富含多元羧酸的弱電解質(zhì)(Ramoset al, 1999; Hertkornet al, 2006), 水樣充分酸化后有助于質(zhì)子化的DOM分子在樹脂上的有效吸附和提高回收率。水樣酸化(pH=2.0)依照國際腐殖質(zhì)學會(IHSS)地表水DOM 的標準提取方法(Thurmanet al, 1981)以及文獻方法(Laraet al, 1994; Zhanget al, 2018b)和Dittmar 等(2008)的PPL-SPE 小柱方法。

2.1.3 樹脂重復使用性 選擇SPE 小柱(Bond Elut PPL, 500 mg, 6 mL)測試PPL 樹脂重復使用性。連續(xù)提取洗脫10 次北京十三陵水庫水(每次1 L)并監(jiān)測每次固相萃取前后水樣的DOC; 結(jié)果表明10 次重復使用后, PPL-SPE 小柱的回收率依然穩(wěn)定在30%～35%,并沒有隨著樹脂使用次數(shù)增多而下降。使用本文定制PPL 柱(1.2 小節(jié))多批次提取對近岸海水, 處理海水量在兩年內(nèi)累積達10 000 L 以上, 而DOC 回收率均穩(wěn)定在50%以上。

實驗數(shù)據(jù)表明, DOM 吸附率和時間相關(guān), 屬于動態(tài)吸附率。較慢的上樣流速（充分吸附）可以提高DOM 的回收率, 但吸附效率會下降, 6～8 BV/h 可以滿足常規(guī)要求; 200 g PPL 樹脂柱實現(xiàn)了2 500L 海水DOM 的高效富集, 回收率可達60%。以安捷倫提供的PPL 樹脂可吸附樹脂質(zhì)量＞5%的目標物計算, 200 g PPL 樹脂柱可用于5 000 L 以上大體積海水[以總有機碳(TOC) 1.5 mg/L、DOM 碳含量50%和DOC 回收率60%計算]有機碳的富集, 但為避免DOM 分子在樹脂上負載過大, 尤其飽和吸附影響DOM 的吸附和化學分級(Konget al, 2021), 建議處理水量達到飽和量的50%～80%即可; 長期使用結(jié)果表明填充的PPL 樹脂柱可以反復使用(三年測試均未見同一PPL 柱吸附率明顯下降)。

2.2 DOM 分析表征

將該工藝和裝置應用于鰲山灣四個季節(jié)海水, 處理水量、DOC 含量、DOC 回收率和PPL-DOM 元素分析結(jié)果見表1。上樣流速(11～12 BV/h)過快導致有機碳回收率偏低(見春季批次), 流速參數(shù)為7.5～8 BV/h 時DOC 回收率52%～56%, 比文獻報道稍低, Green 等(2014)用放大的PPL 樹脂柱法(雙柱串聯(lián), 每個填裝500 g)處理北太平洋和夏威夷海水, DOC 回收率61%。

表1 鰲山灣海水信息和PPL-DOM 元素分析結(jié)果Tab.1 Information of sample at Aoshan Bay and elemental analysis of PPL-DOM samples

2.2.1 元素分析 鰲山灣春夏秋冬PPL-DOM 樣品水分依次為2.59%、4.04%、1.92%、4.70%; 灰分依次為6.21%、6.40%、7.29%、6.82%。PPL-DOM 樣品灰分含量為6.68%±0.47%。

四個季節(jié)PPL-DOM 元素分析結(jié)果相對穩(wěn)定, 扣除水分及灰分后, C、H、N、O 含量分別在46.7%～52.1%、5.98%～6.95%、2.94%～3.31%、35.2%～37.6%。PPL-DOM的元素分析結(jié)果與IHSS 用XAD-8/4 樹脂法提取的淡水溶解性有機質(zhì)或富里酸(FA)存在一定差異(humicsubstances.org), 淡水NOM 中H 含量更低(一般為4%),N 元素含量也較低(一般為1%～2.5%), O 元素則較高(一般為40%), C 含量與本文所提的PPL-DOM 無明顯差異; 使用XAD-8/XAD-4 法提取的海洋DOM 元素組成與本文提取的 DOM 結(jié)果相近(Greenet al,2014)。淡水與海水DOM 在H、N、O 元素組成上的差異與兩水體中有機質(zhì)的來源差異有關(guān), 淡水DOM中存在大量的丹寧、木質(zhì)素(貧氧)以及纖維素(貧氮)等物質(zhì)的降解產(chǎn)物, 海水DOM 中則存在更多藻類代謝所產(chǎn)生的類脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等富氫富氮組分(Emersonet al, 2008)。此外, 鰲山灣PPL-DOM 的C/N 值(摩爾比)為19.4±1.2, 與Dittmar 等(2008)采用PPL-SPE 小柱法提取的海水DOM 的C/N 值(21±1)(揮發(fā)甲醇后,復溶后測定)接近, 也表明使用該相同方法提取的樣品與同類方法有很高的可比性。

2.2.2 EEM 分析 對鰲山灣春冬兩季的海水水樣及PPL-DOM 復溶溶液(濃度5 mg/L)的EEM 光譜進行比較, EEM 譜圖見圖4。海水樣品中除了明顯的類腐殖質(zhì)A 峰和M 峰外(Coble, 1996; 郭衛(wèi)東等, 2018),類蛋白B 峰和T 峰信號也十分明顯(Nelsonet al,2013), 而PPL-DOM 樣品中熒光組分則主要以類腐殖質(zhì)A 峰信號為主, B 峰與T 峰兩種類蛋白熒光信號有明顯降低, 表明PPL 樹脂在對海水DOM 吸附過程中可能選擇吸附一些有機氮組分, 某些分子量小極性較強的氨基酸類分子難以回收。

圖4 鰲山灣春冬兩季海水及PPL-DOM 復溶液的熒光EEM 譜圖Fig.4 The excitation-emission matrix (EEM) fluorescence spectra of original seawaters in spring and winter batches and two seasonal PPL-DOMs from Aoshan Bay

2.2.3FTIR 分析 圖 5 為鰲山灣四個季節(jié)PPL-DOM 的FTIR 譜圖, 四個批次PPL-DOM 的有機官能團紅外吸收峰基本特征十分相似, 但也存在差異。在3 430 cm-1附近均存在一個強吸收峰, 屬于酚類、碳水化合物和羧酸類等組分中的羥基締合羰基后的 O-H 伸縮振動的吸收峰(Zhanget al, 2018a);2 960 cm-1處的雙峰可歸屬為長鏈烷烴類的-CH3和-CH2-, 1 390 cm-1峰也歸屬于-CH3吸收峰; 春、秋、冬季批次在1 729 cm-1附近均存在一個尖峰(夏季批次光譜在1 719 cm-1發(fā)生紅移), 可歸屬為羧酸或羰基的 C=O 鍵的伸縮振動(Abdullaet al, 2010);1 232 cm-1峰為C-O 官能團或羧基中OH 基團平面變角振動形成的弱峰, 在1 080～1 051 cm-1附近峰為碳水化合物中C-O 伸縮振動。

圖5 鰲山灣四個季節(jié)次PPL-DOM 的FTIR 譜圖Fig.5 The FTIR spectra of PPL-DOM extracted from water in different seasons of Aoshan bay

2.2.4固態(tài)13C NMR 分析由于DOM 成分和結(jié)構(gòu)復雜, 吸收峰重疊, FTIR 光譜的定性分析也受到一定限制, 而NMR 技術(shù)作為一種對樣品中有機碳官能團定量的分析技術(shù)(Maoet al, 2012b; Tfailyet al, 2013;Venelet al, 2021), 對DOM 分析有很大優(yōu)勢, 尤其是固態(tài)13C 核磁共振分析。圖6 展示了鰲山灣冬季、紅樹林濕地潮溝水以及威海桑溝灣PPL-DOM 的固態(tài)13C CP/TOSS NMR 譜圖, 其DD 譜圖顯示了非H-C的碳(non-protonated C)和活動(mobile)甲氧基/甲基(-OCH3/-CCH3)碳(圖6), 譜圖積分結(jié)果見表2。

表2 PPL-DOM 固態(tài)13C CP-TOSS NMR 譜圖積分表Tab.2 Integration results of 13C CP/TOSS NMR of PPL-DOM samples

圖6 PPL-DOM 固態(tài)13C CP/TOSS NMR 譜圖Fig.6 Solid-state 13C NMR spectra of different PPL-DOM samples

三個不同來源的PPL-DOMs 譜圖均顯示較強的烷烴、碳水化合物、芳烴、羧基/酰胺信號, 與典型海水DOM 基本特征相同(Maoet al, 2012a; Zhanget al,2018b)。DOM 中烷基碳信號(0～45×10－6, 其中30×10－6為長鏈烷烴的-CH2-)較強, 羰基(醛/酮, 191×10－6～230×10－6)在樣品中則含量較少。根據(jù)表3 中DOM 的親水性指數(shù)(Hydrophilicity Index, HI)和芳香碳含量(Aromaticity), 桑溝灣PPL-DOM 顯示更強的親水性(HI 值為1.51), 其芳香族碳含量(12.5%)略高于鰲山灣(9.07%)和紅樹林(10.1%)樣品。濕地和近岸海水PPL-DOM 在有機碳組成上也存在明顯差異: 紅樹林濕地PPL-DOM 的DD 譜圖在53×10－6處存在一個明顯的尖峰, 該信號歸屬于木質(zhì)素中甲氧基的信號, 表明樣品中豐富的木質(zhì)素來源物質(zhì), 這些信號來源于濕地紅樹林植物降解產(chǎn)物(Zhanget al, 2013); 鰲山灣和桑溝灣PPL-DOM 存在較高的氧烷基信號(60×10－6～94×10－6), 結(jié)合98×10－6附近的O-C-O (anomeric C)信號, 表明樣品中含較多的碳水化合物, 可能來源于大型藻類(如海帶)代謝產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)(房景輝等, 2021)。

使用該放大的PPL-SPE 法和裝置及優(yōu)化的工藝提取富集純化的多批次PPL-DOM 結(jié)果顯示, DOC 回收率穩(wěn)定, 且樣品的元素組成與文獻結(jié)果相近(Dittmaret al, 2008; Greenet al, 2014), 樣品C 含量也與IHSS河水和湖水富里酸(如1R101F、1R105H)相近, 但相比淡水, 海水DOM 的O 元素含量稍低, 而H、N 元素含量稍高, 反映出海水與淡水水體有機質(zhì)來源的差異; FTIR 和NMR 結(jié)果表明DOM 結(jié)構(gòu)組成以羧基、羰基、烷烴類(類脂質(zhì))以及碳水化合物等為主。不同水生態(tài)系統(tǒng)PPL-DOM的固態(tài)13C NMR結(jié)果表明不同樣品間碳官能團存在明顯差異, 顯示出DOM 陸源和生源前體化合物來源的差異。

比較PPL-DOM 與原海水水樣熒光EEM 譜圖,可以看出PPL 樹脂對某些含氮組分存在一定的選擇吸附。但目前幾種常用海水DOM 樹脂提取方法中,XAD 大孔樹脂以及C18 固相萃取樹脂等對海水DOM的回收率明顯低于PPL 樹脂法, 膜法中超濾法也只能實現(xiàn)高分子量DOM 的富集, 電滲析耦合反滲透(RD/ED)技術(shù)雖然可以實現(xiàn)較高的DOC 回收率(70%以上)(Chenet al, 2014), 但該方法制備的固體樣品依然灰分很高。綜合對比, 放大的PPL 樹脂固相萃取法能得到純度較理想的低灰分 DOM 樣品, 同時PPL-DOM 中有機成分能代表海水DOM 的主要特征。將來可通過多種樹脂或技術(shù)聯(lián)用的方法提高DOM 的回收率, 如Green 等(2014)報道了PPL 樹脂與電滲析耦合反滲透技術(shù)聯(lián)用。

3 結(jié)論

本文對PPL 固相萃取(小柱)法進行放大, 建立了大體積海水中DOM 的提取工藝, 搭建提取裝置, 簡化調(diào)酸步驟, 優(yōu)化上樣和洗脫技術(shù)參數(shù), 并成功應用于多批次海水克級DOM 的富集提取和純化。分析表征結(jié)果表明PPL-DOM 樣品性質(zhì)穩(wěn)定, 不同來源海水DOM 中的前體化合物信息也能得到保留。該技術(shù)提取的大體積海水DOM, 可廣泛用于數(shù)據(jù)比對、DOM結(jié)構(gòu)分析、微生物培養(yǎng)實驗等工作。PPL-SPE 方法是目前DOM 富集純化最為有效的方法之一, 下一步將開展PPL-SPE 法與其他提取技術(shù)聯(lián)用的工作以提高方法的回收率。

致謝感謝山東大學結(jié)構(gòu)成分與物性測量平臺董姝麗教授和于群博士在論文中樣品的固態(tài)13C NMR數(shù)據(jù)測定和分析中所提供的幫助; 感謝山東大學海洋研究院海洋碳匯儀器測試平臺老師和同學的大力協(xié)助。