馬艷民，曹浩哲，李詩(shī)卉，徐 珊，鄭鵬生

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.泌尿外科，陜西西安 710061)

早期妊娠丟失(early pregnancy loss, EPL)是指妊娠前3個(gè)月發(fā)生的妊娠失敗，包括生化妊娠和流產(chǎn)[1]。EPL顯著降低了輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology, ART)的成功率以及抱嬰率，增加了患者的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-5]。宮內(nèi)人工授精技術(shù)(intrauterine insemination, IUI)是治療男、女性因素不育和不明原因不育的一線治療方法[6-7]。研究證實(shí)精漿中的免疫活性物質(zhì)參與妊娠早期受精卵著床[8-9]。FRIEDLER等[10]發(fā)現(xiàn)，移植前精漿處理陰道可增加體外受精(in vitro fertilization, IVF)的妊娠率。精液中的免疫活性物質(zhì)可激活子宮內(nèi)膜中Treg細(xì)胞，進(jìn)而建立免疫耐受微環(huán)境，促進(jìn)受精卵著床[11-12]。SOUCEK等[13]發(fā)現(xiàn)人精漿中大量表達(dá)生長(zhǎng)分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF-15)，并證實(shí)其免疫抑制特性。本研究通過比較IUI與自然妊娠兩者妊娠結(jié)局的差異，初步探討精漿因素在早期妊娠中的作用，為臨床提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及數(shù)據(jù)收集本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.XJTU1AF2017LSK-134)。所有受試者均給予書面知情同意。為避免選擇偏倚，本研究?jī)H納入既往有自然流產(chǎn)史且目前為單胎的孕婦，同時(shí)排除夫婦雙方外周血核型異?；虺曌C據(jù)顯示子宮病變的婦女，包括先天性子宮畸形、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉和宮內(nèi)粘連等。在本研究中，我們共納入326例自2015年1月1日—2017年12月31日期間就診于我科的已知妊娠患者。根據(jù)妊娠方式將患者分為IUI組(即通過IUI技術(shù)使其妊娠)和自然妊娠組(即通過監(jiān)測(cè)排卵指導(dǎo)同房使其妊娠)。主要研究終點(diǎn)為EPL率、中晚期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率。EPL是指妊娠前3個(gè)月(≤12周)發(fā)生的妊娠丟失。生化妊娠是指血清人絨毛膜促性腺激素β(human chorionic gonadotropin β，β-HCG)>15 U/L，但超聲檢查不能探及孕囊發(fā)生的妊娠失敗。流產(chǎn)是指臨床超聲檢查可以探及妊娠囊后發(fā)生的妊娠失敗。詳細(xì)記錄患者年齡、身高、體質(zhì)量、甲狀腺功能、卵泡刺激素水平(月經(jīng)周期第2～4天)、子宮內(nèi)膜厚度(扳機(jī)日或排卵日)，男方的年齡及精液質(zhì)量。

1.2 臨床處理對(duì)于月經(jīng)周期規(guī)律且能自發(fā)排卵的患者按照自然周期處理。對(duì)于排卵障礙的患者，從月經(jīng)周期第5天開始口服克羅米芬50～100 mg或肌注尿促性素(human menopausal gonadotropin，HMG)75～150 U處理。期間定期接受激素檢查和超聲檢查以判斷卵泡發(fā)育情況。當(dāng)超聲檢查顯示卵泡直徑≥18 mm時(shí)，對(duì)于排卵障礙者給予5 000～10 000 U 的HCG扳機(jī)處理，對(duì)于排卵正常者則指導(dǎo)其同房。IUI過程中的精液處理是采用percoll密度離心對(duì)新鮮精子進(jìn)行優(yōu)化處理，將處理后的精子(不含精漿成分)移入女性宮腔內(nèi)。妊娠定義為至少連續(xù)2次血清HCG≥15 U/L。所有患者在妊娠約5～6周時(shí)進(jìn)行超聲常規(guī)監(jiān)測(cè)以確定宮內(nèi)妊娠。確定妊娠后近80%的患者肌注黃體酮20 mg/d(浙江仙琚藥業(yè)有限公司，中國(guó)浙江)進(jìn)行黃體支持。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)、游離甲狀腺素(free thyroxine, fT4)和促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)水平。

1.3 免疫印跡精液離心去除細(xì)胞，上清液變性后得到精漿蛋白，25 μg /孔上樣，12.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)120 V電泳、110 V電壓轉(zhuǎn)膜，20 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗GDF-15單克隆抗體(1∶1 000)孵育4°C過夜。TBST漂洗3次，每次10 min。二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶1 000)室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，每次10 min，使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光儀ChemiDoc XRS 顯色系統(tǒng)掃描顯色。

1.4 組織塊體外培養(yǎng)及實(shí)時(shí)定量RT-PCR將小鼠新鮮子宮內(nèi)膜標(biāo)本切成1 mm×1 mm×2 mm大小，置于24孔培養(yǎng)板中用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別用質(zhì)量濃度為0、0.1、1.0 ng/mL的GDF-15 (rhGDF-15; 213-10, 128-1, Norcross, GA, USA)分別處理24 h和48 h。使用Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 mRNA的定量分析使用iQ SYBR Green Supermix(TaKaRa，大連，中國(guó))試劑盒在iCyclerPCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，循環(huán)數(shù)45；50 ℃、5 s。引物序列如下：LIF，5’-AACCAGATCAAGAATCAACTGGC-3’(F) and 5’-TGTTAGGCGCACATAGCTTTT-3’(R)； Integrin ανβ3，5’-CCGTGGACTTCTTCG-AGCC-3’ (F) and 5’-CTGTTGAATCAAACTCAATGGGC-3’ (R)； HOXA10， 5’-CCTGCCGC-GAACTCCTTTT-3’ (F) and 5’-GGCGCTTCATTACGCTTGC-3’ (R)； HOX A11， 5’-TTTGATG-AGCGTGGTCCCTG-3’(F) and 5’-AGGAGTAGGAGTATGTCATTGGG-3’ (R)； β-actin， 5’-GTG ACGTTGACATCCGTAAAGA-3’ (F) and 5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’ (R)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用描述性統(tǒng)計(jì)方法分析患者的基本特征。采用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本特征納入的326例妊娠者中，IUI組與自然妊娠組兩組間在女性年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)、甲狀腺功能(TSH及fT4水平)、月經(jīng)第3天血清FSH水平、排卵日子宮內(nèi)膜厚度、卵巢儲(chǔ)備功能、妊娠后黃體支持及男性年齡、精液參數(shù)方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表1)。

表1 納入的 326例患者的基本特征

另外，兩組間在促排卵用藥、扳機(jī)用藥以及妊娠后的黃體支持方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表2)。

表2 納入的326例患者刺激排卵時(shí)的用藥特征

2.2 妊娠結(jié)局分析在190例IUI妊娠組中，66例(34.74%)患者發(fā)生EPL，其中生化妊娠者占13.68%，早期流產(chǎn)占21.05%。超過12周持續(xù)妊娠的患者中，3.68%發(fā)生流產(chǎn)，另外有1.05%的患者失訪，最終有61.17%順利分娩。在136例自然妊娠組中，30例(22.06%)發(fā)生EPL，其中生化妊娠占8.09%，早期流產(chǎn)占13.97%。超過12周持續(xù)妊娠的患者中，1.47%發(fā)生流產(chǎn)，另外有5.15%失訪，最終有75.19%順利分娩(圖1)。IUI組和自然妊娠組在EPL率和活產(chǎn)率方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，超過12周的流產(chǎn)率在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表3)。

IUI：人工授精；EPL：早期妊娠丟失。

表3 妊娠患者的臨床結(jié)局 [例(%)]

2.3 免疫印跡既往研究證實(shí)，人精漿中含有豐富的GDF-15。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們收集來自門診5名參數(shù)正常的志愿者的精液樣本(依據(jù)WHO人類的精液檢驗(yàn)和處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第5版)進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果顯示，GDF-15蛋白在5個(gè)樣本中均有表達(dá)(圖2)。

圖2 采用Western blot方法檢測(cè)精漿中GDF-15水平

2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)采用體外組織塊培養(yǎng)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術(shù)研究GDF-15對(duì)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因表達(dá)的影響(圖3)。本研究選擇LIF、Integrin ανβ3、HOXA 10和HOXA 11基因作為子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)記。

分別用0、0.1、1.0 ng/mL質(zhì)量濃度的rhGDF-15處理小鼠子宮內(nèi)膜組織24 h和48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以表示，*P<0.05。

結(jié)果顯示，LIF、Integrin ανβ3和HOXA 11基因在GDF-15處理24 h和48 h組中的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(圖3)。該結(jié)果提示GDF-15處理可以增加小鼠子宮內(nèi)膜容受性。

3 討 論

ART治療本身是否為EPL的一個(gè)危險(xiǎn)因素目前尚無定論。PEZESHKI等[14-15]報(bào)道，通過ART方式妊娠的婦女與自然妊娠的婦女具有相似的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。然而也有研究表明，在調(diào)整女性年齡和反復(fù)流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)因素后，不育夫婦經(jīng)ART治療后妊娠者比自然妊娠者發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)更高。BRANDES等[16]在一項(xiàng)縱向多中心隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，自然妊娠者發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)為14.5%(125/864)，而經(jīng)IUI妊娠發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)為25.0%(5/20)。此項(xiàng)研究與我們的研究結(jié)果較為一致。本項(xiàng)的研究結(jié)果顯示，經(jīng)自然妊娠發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)為15.2%(19/125)，而經(jīng)IUI方式妊娠發(fā)生早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)為24.39%(40/164)。

既往研究提示高齡是導(dǎo)致EPL的風(fēng)險(xiǎn)因素[1,17]。本研究納入人群中IUI與自然妊娠兩組間年齡、BMI、甲狀腺功能、子宮內(nèi)膜厚度、卵巢儲(chǔ)備功能、促排卵用藥、黃體支持等方面，以及男性年齡、精液參數(shù)兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，夫婦雙方染色體異常及孕婦子宮畸形也會(huì)增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，本研究在納入研究對(duì)象時(shí)排除了這些方面的偏倚。

值得注意的是，在IUI時(shí)我們采用Percoll分層離心法進(jìn)行優(yōu)化精子，最終丟棄精漿只收集優(yōu)質(zhì)精子。因此，IUI組與自然妊娠組之間最顯著的差異是有無精漿。既往研究證實(shí)男性精漿中存在多種免疫活性物質(zhì)[8-9]。FRIEDLER等[10]發(fā)現(xiàn)，移植前用精漿處理陰道可增加IVF-ET后的植入率和臨床妊娠率。也有研究表明，精液中的免疫活性物質(zhì)可以激活子宮內(nèi)膜中的Treg細(xì)胞，進(jìn)而建立免疫耐受微環(huán)境促進(jìn)受精卵著床[11～12]。眾所周知，對(duì)于母體而言，受精卵是一個(gè)半自身抗原，其成功著床依賴于免疫系統(tǒng)中多種細(xì)胞參與調(diào)節(jié)促炎與抗炎反應(yīng)之間的平衡，以建立母體特異性的免疫耐受(豁免)機(jī)制。SOUCEK等[13]發(fā)現(xiàn)人類精漿中含有大量GDF-15，并證實(shí)其具有免疫抑制特性。據(jù)此我們猜測(cè)，精漿中的GDF-15可能參與建立子宮內(nèi)膜免疫耐受狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)受精卵著床。為此，通過體外實(shí)驗(yàn)探討GDF-15對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。本研究中的qRT-PCR結(jié)果顯示，GDF-15能夠上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜容受性基因LIF、Integrin ανβ3和HOXA 11的表達(dá)。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜允許受精卵定位、粘附、侵入并改變子宮內(nèi)膜間質(zhì)，最終促進(jìn)受精卵著床的一種能力。受精卵只有在高容受性的子宮內(nèi)膜環(huán)境下才能順利定植、發(fā)育。相反，容受性較差的子宮內(nèi)膜往往被認(rèn)為是不孕和流產(chǎn)最常見的原因。

總之，本項(xiàng)研究采用回顧性病例對(duì)照研究的方法，在既往有流產(chǎn)史的育齡人群中，通過比較經(jīng)IUI(無精漿)妊娠與自然妊娠(有精漿)之間妊娠結(jié)局的差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IUI妊娠后發(fā)生EPL的概率顯著高于自然妊娠者，而活產(chǎn)率顯著低于自然妊娠者。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)精漿中的免疫活性物質(zhì)GDF-15，能夠上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的表達(dá)，提示GDF-15在妊娠早期建立子宮內(nèi)膜容受性過程可能發(fā)揮積極作用。未來，我們將繼續(xù)探索GDF-15在受精卵著床和妊娠維持中的作用，并進(jìn)一步探討GDF-15參與調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性的具體分子機(jī)制。