邵 淵，吳 波，張 琳，陳勇全，王東文，3

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001；3.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東深圳 518116)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1-2]。其中，腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC的主要病理類型[3]。近年來(lái)，我國(guó)腎癌的發(fā)病率逐年上升[2,4]。由于腎癌侵襲性強(qiáng)且對(duì)放化療不敏感，手術(shù)治療仍是局限性腎癌及局部進(jìn)展性腎癌的主要治療方法，但高達(dá)20%～30%的患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[5-6]。因此，為了改善腎癌患者的預(yù)后，迫切需要探索腎癌的發(fā)病機(jī)制，并尋找可用于腎細(xì)胞癌診斷、治療和預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。

CDH13是鈣離子依賴性鈣黏蛋白家族的特殊成員[7-8]。先前的研究證明，CDH13編碼的蛋白質(zhì)完整分布在細(xì)胞表面，這種特殊的結(jié)構(gòu)與分布提示CDH13可能參與細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，進(jìn)而發(fā)揮重要作用[9-11]。隨著研究的不斷深入，目前的研究證實(shí)CDH13的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、患者臨床病理參數(shù)以及預(yù)后密切相關(guān)[12-18]。然而，CDH13基因在ccRCC中的表達(dá)水平及預(yù)后價(jià)值尚未闡明。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法全面分析并研究CDH13基因在ccRCC中的表達(dá)水平及預(yù)后價(jià)值。同時(shí)基于臨床標(biāo)本驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，以期全面且深入探討該基因在ccRCC中潛在的臨床價(jià)值及分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13基因的mRNA表達(dá)水平基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的533個(gè)ccRCC組織和72個(gè)正常腎組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析CDH13基因在ccRCC組織和正常腎組織中的mRNA表達(dá)水平。此外，基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中72對(duì)和101對(duì)ccRCC及其癌旁組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(GSE53757和GSE40435)進(jìn)一步驗(yàn)證來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果。

1.2 基于CPTAC和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平利用CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)[19](https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac)獲得并分析CDH13基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；利用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)[20](http://www.proteinatlas.org)提取并分析CDH13基因蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫組化圖像。此外，基于AlphaFold數(shù)據(jù)庫(kù)(https://alphafold.ebi.ac.uk/)預(yù)測(cè)CDH13基因編碼蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

1.3 基于UALCAN和CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13基因的表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)[21](http://ualcan.path.uab.edu)用于獲得并分析CDH13基因在不同臨床分期、病理分級(jí)等臨床病理特征中的mRNA表達(dá)情況。此外，基于CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)獲得并分析CDH13基因在不同腫瘤分期、病理分級(jí)中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析評(píng)估CDH13基因的預(yù)后價(jià)值Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)用以評(píng)估CDH13基因在患者中的預(yù)后價(jià)值。主要終點(diǎn)為總體生存率(overall survival, OS)和無(wú)進(jìn)展生存率(progression free survival, PFS)。使用風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio, HR)和95%置信區(qū)間(confidence interval, CI)作為效應(yīng)量。此外，進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，以進(jìn)一步評(píng)估和確定ccRCC患者OS和PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

1.5 基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13的基因組變異情況cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)[22](http://www.cbioportal.org)用于分析并研究CDH13的基因組變異情況。此外，基于該數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13基因組變異對(duì)ccRCC患者預(yù)后的影響。

1.6 基于TCGA和Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13基因的相關(guān)基因及通路富集基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDH13相關(guān)基因，并基于Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[23](http://metascape.org)進(jìn)行通路富集分析。

1.7 基于臨床樣本分析CDH13基因的表達(dá)水平

1.7.1納入排除標(biāo)準(zhǔn)及患者臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：2021年1月-2021年6月于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科行根治性腎切除術(shù)并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為ccRCC的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過(guò)化療、放療或分子靶向治療等抗腫瘤治療；未簽署知情同意書(shū)；無(wú)完整臨床及病理資料。最終共有40對(duì)ccRCC組織及癌旁組織標(biāo)本納入本次研究。所選取標(biāo)本的患者年齡為49～83歲，男性26例，女性14例；左腎腫瘤16例，右腎腫瘤24例；AJCC分期：Ⅰ+Ⅱ期26例、Ⅲ+Ⅳ期14例；WHO/ISUP分級(jí)：Ⅰ+Ⅱ級(jí)28例、Ⅲ+Ⅳ級(jí)12例。

1.7.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR) 利用Trizol法提取臨床標(biāo)本中總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑(AQ601，TransGen Biotech，China)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR并檢測(cè)。

引物序列：CDH13正向引物5’-TGTCCCAAGACAAAAGAGGTCC-3’，反向5’-ACTATCGACTACCTTGCCAACAT-3’。GAPDH正向引物5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，反向5’-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.7.3蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot) 臨床標(biāo)本使用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，使用BCA試劑盒獲取蛋白質(zhì)并定量。使用SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)有目的蛋白的PVDF膜封閉2 h后與抗CDH13抗體(ab167407，Abcam，1∶1 000)和抗GAPDH抗體(ab181602，Abcam，1∶1 000)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。TBST溶液洗膜3次后將膜移至二抗孵育液中室溫孵育2 h。再次洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)并進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參。

1.7.4免疫組織化學(xué)染色法 臨床收集的ccRCC組織和癌旁組織經(jīng)歷石蠟包埋、組織切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)和阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，使用抗CDH13抗體(A1761，Abclonal Technology，1∶100)和二抗對(duì)組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，隨后將組織切片用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色并用蘇木精復(fù)染以檢測(cè)CDH13基因的蛋白表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0和R 3.6.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。t檢驗(yàn)用于分析比較ccRCC組織與癌旁組織間CDH13基因的表達(dá)差異。單因素方差分析、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)用于分析患者臨床病理特征與CDH13基因表達(dá)的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDH13基因在ccRCC組織和正常組織中mRNA的表達(dá)水平基于TCGA的分析結(jié)果顯示，ccRCC組織中CDH13基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.05，圖1A、B)。此外，基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了CDH13基因在ccRCC中mRNA的高表達(dá)水平(圖1C、D)。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA-KIRC)；B：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中配對(duì)樣本；C、D：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE53757和GSE40435)。

2.2 CDH13基因在ccRCC組織和正常組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，ccRCC組織中基因CDH13的蛋白質(zhì)表達(dá)水平較高(P<0.05，圖2A)?；贖PA數(shù)據(jù)庫(kù)的免疫組化圖像顯示，CDH13基因編碼的蛋白在ccRCC組織中觀察到較高水平的表達(dá)(圖2C、D)。這提示CDH13基因的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平在ccRCC中保持一致。圖2B展示了AlphaFold數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的CDH13編碼蛋白的3D結(jié)構(gòu)。

A：基于CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)的ccRCC組織和正常組織中的CDH13基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平(***P<0.001)；B：基于AlphaFold數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的T-Cadherin 3D結(jié)構(gòu)；C、D：基于HPA數(shù)據(jù)庫(kù)的ccRCC組織和正常組織中的CDH13基因表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖像。

2.3 CDH13基因的表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系分析結(jié)果顯示，CDH13的表達(dá)與ccRCC患者的腫瘤分期、病理分級(jí)顯著相關(guān)(圖3)。在腫瘤組織中CDH13的表達(dá)高于正常組織，并且CDH13的表達(dá)隨著腫瘤分期、病理分級(jí)增高有表達(dá)降低的趨勢(shì)，腫瘤分期4期、病理分級(jí)4級(jí)的ccRCC患者CDH13基因的表達(dá)水平較低。

A、B：CDH13 基因mRNA表達(dá)水平(A)與ccRCC患者腫瘤分期和病理分級(jí)的關(guān)系(B)；C、D：CDH13 基因在不同腫瘤分期中蛋白質(zhì)表達(dá)水平(C)與ccRCC患者腫瘤分期和病理分級(jí)的關(guān)系(D)。

2.4 CDH13基因的表達(dá)在ccRCC患者中的預(yù)后價(jià)值生存分析結(jié)果顯示，CDH13基因的表達(dá)與ccRCC患者的OS、PFS相關(guān)。CDH13基因高表達(dá)的患者預(yù)后較好，而低表達(dá)的患者生存時(shí)間顯著降低，預(yù)后較差(P< 0.05，圖4)。此外，單因素及多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示CDH13的表達(dá)水平是ccRCC患者OS及PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(表1、2)。

A：總體生存率(OS)；B：無(wú)進(jìn)展生存率(PFS)。

表1 ccRCC患者總體生存率影響因素的單因素及多因素Cox回歸分析(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))

表2 ccRCC患者無(wú)進(jìn)展生存率影響因素的單因素及多因素Cox回歸分析(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))

2.5 CDH13基因在ccRCC中的基因組變異水平cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，CDH13基因在512例ccRCC患者中基因組變異率為4%。其中，高mRNA突變占比最高，為2.54%，深度缺失為0.78%，擴(kuò)增為0.39%。生存分析結(jié)果顯示，CDH13基因組變異與ccRCC患者的總體生存率(P<0.05，圖5A)和癌癥特異性生存率顯著相關(guān)(P<0.05，圖5B)。

A：總體生存率；B：癌癥特異性生存分析。

2.6 CDH13基因的相關(guān)基因及通路富集分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，與CDH13相關(guān)性最強(qiáng)的前5個(gè)基因分別為CDH5、CXORF36、CD34、S1PR1和ELTD1?；贛etascape數(shù)據(jù)庫(kù)的富集分析結(jié)果顯示CDH13及其相關(guān)基因主要涉及的通路包括血管發(fā)育、內(nèi)皮發(fā)育、細(xì)胞遷移及細(xì)胞粘附等生物過(guò)程。

2.7 臨床樣本中CDH13基因的表達(dá)水平本研究進(jìn)一步在臨床樣本中驗(yàn)證了CDH13基因的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，ccRCC組織中的CDH13基因mRNA 表達(dá)顯著升高(圖6A)。同樣，Western blot結(jié)果也表明CDH13基因在ccRCC組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平高于癌旁組織(圖6B)。此外，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與ccRCC組織相比，CDH13基因在癌旁腎組織中的表達(dá)水平顯著降低(圖6C)。與高級(jí)別的ccRCC組織相比，低級(jí)別ccRCC組織中CDH13的表達(dá)水平顯著升高(圖6C)。

A：CDH13基因在ccRCC組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平；B：CDH13基因在ccRCC組織和癌旁組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；C：CDH13基因在ccRCC組織和癌旁組織中的免疫組織化學(xué)染色圖像(左圖為×100，右圖為×400)。

3 討 論

CDH13是鈣黏蛋白家族的非典型成員，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成以及細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)等眾多方面發(fā)揮著重要作用[9-11]。已有研究證實(shí)，CDH13基因在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并且與腫瘤患者的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。LIN等[24]利用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)113例膀胱癌標(biāo)本和37例正常組織標(biāo)本中CDH13的表達(dá)。結(jié)果顯示膀胱癌組織中CDH13表達(dá)水平低于正常組織，并且與膀胱腫瘤的分期、分級(jí)以及腫瘤復(fù)發(fā)等臨床病理因素密切相關(guān)，可作為膀胱癌惡性程度的潛在預(yù)測(cè)標(biāo)志物。此外，WANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)CDH13在口腔鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織，并且與患者的臨床病理因素及預(yù)后顯著相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示CDH13基因可能通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖。在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CDH13基因在胰腺癌組織及細(xì)胞系中顯著下調(diào)。進(jìn)一步的深入研究表明CDH13基因的過(guò)表達(dá)抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，通過(guò)參與調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力[9]。

隨著研究的深入，不斷有研究報(bào)道CDH13基因與血管生成密切相關(guān)。在一項(xiàng)體外研究中，WANG等[12]報(bào)道CDH13啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可以恢復(fù)腫瘤的血管生成、侵襲和遷移能力。此外，使用組蛋白去乙?；敢种苿┗蛉ゼ谆苿┨幚戆┘?xì)胞系可以重新激活CDH13的表達(dá)并導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。其原因可能與內(nèi)皮細(xì)胞中CDH13的過(guò)表達(dá)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并在病理?xiàng)l件下通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激血管生成有關(guān)[26]。在體內(nèi)研究中，HEBBARD等[27]學(xué)者在小鼠癌癥模型中發(fā)現(xiàn)CDH13基因促進(jìn)腫瘤血管生成，T-Cadherin的缺乏通過(guò)限制腫瘤的血管生成從而減少腫瘤的生長(zhǎng)?？偠灾?，CDH13基因可以通過(guò)多種通路及途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，CDH13在ccRCC中的作用與價(jià)值仍有待闡明。因此，本研究全面且深入探討了CDH13基因在ccRCC中的表達(dá)水平、預(yù)后價(jià)值、基因組變異和功能富集分析。

本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC組織中CDH13的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于正常腎組織。但CDH13的表達(dá)隨著ccRCC患者腫瘤分期和病理分級(jí)的升高而逐漸降低，提示該基因在ccRCC中表達(dá)的特異性。腫瘤病理分級(jí)極其復(fù)雜，隨著腫瘤惡性程度以及臨床分期病理分級(jí)的增高，腫瘤異質(zhì)性也更加凸顯，其腫瘤組織和腫瘤內(nèi)環(huán)境可以發(fā)生巨大的變化。對(duì)于同一類腫瘤在同一病理分期分級(jí)下也可能存在不同的分子亞型。在ccRCC進(jìn)展的不同階段，其內(nèi)在的基因變化極其復(fù)雜，尚未有研究深入挖掘CDH13基因在ccRCC中表達(dá)的特異性與異質(zhì)性。因此，仍需要更多的研究全面探討CDH13基因在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。此外，在此基礎(chǔ)上，本研究生存分析結(jié)果顯示CDH13基因和ccRCC患者的OS及PFS顯著相關(guān)，并且該基因的低表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，CDH13與腫瘤分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后指標(biāo)相結(jié)合將有助于更加精確地預(yù)測(cè)ccRCC患者的臨床結(jié)局。另一方面，cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示在ccRCC患者中存在一定水平的CDH13基因組變異發(fā)生率，并且與野生型CDH13相比基因突變的患者預(yù)后明顯較好。這項(xiàng)研究結(jié)果提示ccRCC患者的生存率不僅受到CDH13表達(dá)水平的影響，還與其基因組是否變異有關(guān)。此外，本研究對(duì)CDH13及相關(guān)基因進(jìn)行通路富集分析深入挖掘其潛在的作用機(jī)制，這些通路和生物過(guò)程均和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也提示CDH13基因可能通過(guò)這些通路調(diào)控ccRCC的進(jìn)展。最后，基于臨床樣本同樣證實(shí)CDH13在ccRCC組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織?？傊陨涎芯拷Y(jié)果提示CDH13基因可能在ccRCC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，并且有望成為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。

盡管如此，本項(xiàng)研究也存在如下局限性。首先，本研究未能深入探索CDH13基因參與ccRCC的確切分子機(jī)制，仍需相關(guān)研究進(jìn)一步闡明。其次，本研究?jī)H為回顧性研究，仍需更多前瞻性、大樣本的研究結(jié)果相互支持。

綜上所述，本研究證明CDH13基因在ccRCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且該基因的高水平表達(dá)與ccRCC患者的臨床病理特征及預(yù)后良好顯著相關(guān)。這些新的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了ccRCC中潛在的分子變化，也為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。