劉 宇，王涌泉，李丹濱

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全世界每年約有超過140 000人死于ccRCC[1]。ccRCC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，因其對(duì)化療藥物不敏感，臨床上常見的治療方法主要為手術(shù)治療及免疫治療[2-4]。

Ras和Rab相互作用因子1(Ras and Rab interactor 1，RIN1)位于染色體11q13.2處，為Ras效應(yīng)蛋白，且該基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與激活的H-Ras具有高親和力和高度特異性[5]。最近的研究證明了RIN1在介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。除了活化Ras蛋白外，還可激活Rab5、ABL酪氨酸激酶以及表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，從而調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞遷移[6]。已有研究證實(shí)RIN1在多種腫瘤中異常表達(dá)并與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)，可能成為腫瘤診斷和治療的標(biāo)記物[7]。本文分析了RIN1的表達(dá)與ccRCC患者發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。此外，利用基因富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)從功能角度探討了RIN1差異與ccRCC不良預(yù)后的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)下載TCGA-KIRC數(shù)據(jù)從TCGA官方網(wǎng)站下載(https://cancergenome.nih.gov/)，包括mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床資料。共獲得72例正常腎臟組織和539例ccRCC組織，并整合ccRCC患者的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、生存狀態(tài)、總生存期、分級(jí)、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 RIN1的蛋白表達(dá)分析UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)整合了來自CPTAC數(shù)據(jù)庫的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)[8]，使用UALCAN數(shù)據(jù)庫查詢并分析RIN1蛋白在正常腎臟組織和ccRCC組織中的相對(duì)表達(dá)。人蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/，HPA)包含正常腎臟組織和腫瘤組織的免疫組化信息[9]，利用本數(shù)據(jù)庫查詢RIN1在正常腎臟組織和ccRCC組織的免疫組化染色結(jié)果。

1.3 GSEA分析為了研究RIN1在ccRCC中的潛在功能，根據(jù)RIN1表達(dá)中位數(shù)分為高低兩組，針對(duì)兩組的差異基因依據(jù)表達(dá)情況對(duì)基因進(jìn)行排序，然后利用c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)集對(duì)兩組進(jìn)行富集。每次分析的基因集排列數(shù)設(shè)為1 000，表型標(biāo)記為RIN1的表達(dá)水平。P<0.05和FDRq<0.05的基因集被視為顯著富集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R軟件(3.6.3)進(jìn)行。采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon test)對(duì)正常腎臟組織和ccRCC組織進(jìn)行差異表達(dá)分析。為了檢驗(yàn)RIN1的表達(dá)與相關(guān)臨床特征的關(guān)系，使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較，采用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)和Bonferroni校正檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較。用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)比較RIN1高表達(dá)組和低表達(dá)組的總體生存率。采用單因素和多因素Cox回歸分析評(píng)價(jià)RIN1的表達(dá)在ccRCC中的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RIN1在ccRCC中表達(dá)上調(diào)并與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)與72例正常腎臟組織相比，539例ccRCC組織中RIN1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001，圖 1A)。其中在72例ccRCC配對(duì)樣本組織中RIN1的表達(dá)也顯著高于正常組織(P<0.001，圖1B)。RIN1上調(diào)對(duì)ccRCC的診斷價(jià)值也通過受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線得到證實(shí)，曲線下面積(area under curve，AUC)為0.916，P<0.001(圖1C)。Kaplan-Meier曲線顯示RIN1高表達(dá)的ccRCC患者的預(yù)后比RIN1低表達(dá)的ccRCC患者差(圖1D)。

A： RIN1在ccRCC和正常腎臟組織的表達(dá)情況；B： 在72對(duì)配對(duì)組織中，ccRCC組織RIN1表達(dá)顯著上調(diào)；C：RIN1上調(diào)對(duì)ccRCC診斷價(jià)值的ROC曲線；D：RIN1高表達(dá)與低表達(dá)的ccRCC患者預(yù)后的Kaplan-Meier曲線。

2.2 RIN1蛋白在ccRCC組織中表達(dá)上調(diào)分析UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示ccRCC組織中RIN1蛋白表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.001，圖 2A)。此外，從HPA數(shù)據(jù)庫中檢索免疫組化染色數(shù)據(jù)，研究RIN1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，結(jié)果顯示正常腎臟組織中腎小管細(xì)胞和腎小球細(xì)胞抗體染色程度均為低水平，而ccRCC組織中呈中等水平(圖 2B)。由此進(jìn)一步證實(shí)，在ccRCC組織中RIN1蛋白表達(dá)上調(diào)。

A：UALCAN數(shù)據(jù)庫中RIN1蛋白的表達(dá)情況；B：HPA數(shù)據(jù)庫中RIN1的免疫組化情況。

2.3 RIN1表達(dá)與ccRCC患者臨床特征的關(guān)系對(duì)TCGA-KIRC的臨床特征進(jìn)行了整合并統(tǒng)計(jì)TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(表1)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的ccRCC患者進(jìn)行了RIN1表達(dá)與臨床特征相關(guān)性分析。如圖3A～E所示，RIN1表達(dá)上調(diào)與臨床分級(jí)(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、腫瘤大小(P<0.001)、淋巴結(jié)狀態(tài)(P<0.001)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.001)顯著相關(guān)。

表1 來自TCGA中腎透明細(xì)胞腎癌患者的臨床特征

2.4 RIN1表達(dá)是ccRCC患者的獨(dú)立預(yù)后因子以RIN1表達(dá)中位數(shù)為準(zhǔn)進(jìn)行高、低表達(dá)分組，Kaplan-Meier生存分析表明，高表達(dá)RIN1的ccRCC患者總生存率較低表達(dá)RIN1的ccRCC患者差(P<0.001，圖1D)。單因素Cox回歸分析顯示RIN1的表達(dá)上調(diào)及年齡、分級(jí)、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床特征均與ccRCC預(yù)后不良密切相關(guān)。此外，多因素Cox回歸分析顯示RIN1表達(dá)上調(diào)、年齡與ccRCC預(yù)后不良獨(dú)立密切相關(guān)(表2)，因此RIN1可能作為ccRCC患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。

2.5 RIN1在影響ccRCC預(yù)后中的作用機(jī)制鑒于RIN1可能作為ccRCC的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，我們依據(jù)RIN1表達(dá)進(jìn)行高低風(fēng)險(xiǎn)分組，組間差異分析獲得差異基因，采用GSEA方法進(jìn)行KEGG功能富集分析，結(jié)果顯示高表達(dá)RIN1組主要富集并上調(diào)了DNA復(fù)制、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、NOTCH信號(hào)通路和P53信號(hào)通路等相關(guān)途徑(圖4)，這為揭示ccRCC患者預(yù)后不良的潛在機(jī)制提供了有效的研究途徑。

A：分級(jí)；B：TNM分期；C： 腫瘤大??；D：淋巴結(jié)狀態(tài)；E：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

表2 使用單因素及多因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫中ccRCC患者總生存率相關(guān)的臨床特征

圖4 GSEA顯示的KEGG通路富集圖

3 討 論

RIN1為蛋白質(zhì)編碼基因，作為Ras效應(yīng)蛋白在不同水平影響Ras信號(hào)。首先，可通過與RAF1蛋白競(jìng)爭結(jié)合激活的Ras。第二，通過增強(qiáng)來自ABL酪氨酸激酶1和酪氨酸激酶2的信號(hào)來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑。第三，通過激活Rab5A，充當(dāng)Rab5A的鳥嘌呤核苷酸交換因子，將結(jié)合的GDP交換為游離的GTP，并促進(jìn)Ras激活受體胞吞作用[10]。研究表明，RIN1可與Rab25(關(guān)鍵GTP酶)相互作用，激活ccRCC中的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)RIN1的mRNA水平在ccRCC中表達(dá)顯著上調(diào)，且UALCAN和HPA在線數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證RIN1在蛋白水平的表達(dá)方面也顯著上調(diào)。RIN1的表達(dá)上調(diào)與腫瘤分級(jí)、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及總生存率均顯著相關(guān)。單因素和多因素回歸分析也驗(yàn)證了其可作為ccRCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究利用高通量、多組學(xué)數(shù)據(jù)，探討研究了RIN1在ccRCC組織中的表達(dá)和預(yù)后關(guān)系，經(jīng)生物信息學(xué)精準(zhǔn)分析表明RIN1可以作為ccRCC新的診斷、預(yù)后標(biāo)記物。

最后利用GSEA分析，預(yù)測(cè)RIN1與ccRCC發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起重要作用的途徑。結(jié)果表明RIN1參與了多種與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的途徑，如DNA復(fù)制、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、NOTCH信號(hào)通路和P53信號(hào)通路。已有研究證實(shí)以上信號(hào)通路與ccRCC的生物學(xué)行為密切相關(guān)，特別是NOTCH信號(hào)通路在ccRCC中廣泛激活，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，抑制NOTCH信號(hào)通路激活可能成為ccRCC的治療靶點(diǎn)[12]。DNA復(fù)制、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用和P53信號(hào)通路也與ccRCC的發(fā)生、增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]，但RIN1是如何通過以上信號(hào)通路影響ccRCC的生物學(xué)行為需要深入研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)RIN1在ccRCC中表達(dá)上調(diào)與臨床特征密切相關(guān)，并能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后不良，這表明RIN1有望成為ccRCC的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。然而，具體的機(jī)制研究有待進(jìn)一步開展。