項(xiàng)開(kāi)合，胡曉宇，李 爽，王 瑩，張?jiān)片F(xiàn)，張乃生*

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118000；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062；3.齊魯動(dòng)物保健品有限公司，山東濟(jì)南 250100)

奶牛圍產(chǎn)期主要指奶牛產(chǎn)前3 周至產(chǎn)后3 周這一時(shí)期 ，其特征是動(dòng)物生理發(fā)生劇烈變化，動(dòng)物正常營(yíng)養(yǎng)代謝和能量平衡的維持面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。不同于單胃動(dòng)物，奶牛體內(nèi)能量供應(yīng)主要來(lái)源于瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的大量揮發(fā)性脂肪酸，而瘤胃微生物在飼料發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。奶牛的瘤胃中存在豐富多樣的微生物群落，如細(xì)菌、原生動(dòng)物、古細(xì)菌和真菌等，它們與宿主具有共生關(guān)系。瘤胃微生物群落是動(dòng)態(tài)的，往往隨著飲食、宿主、生理狀態(tài)和環(huán)境的變化而變化[3]。生產(chǎn)過(guò)程中，為了適應(yīng)產(chǎn)后泌乳需要，圍產(chǎn)期奶牛從干奶期高纖維飲食轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔巷嬍?，這種轉(zhuǎn)變往往導(dǎo)致瘤胃菌群的劇烈變化[4]，并且可能與圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系。了解圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群組成、變化及影響因素，對(duì)于圍產(chǎn)期奶牛飼養(yǎng)管理及疾病防控具有重要意義。傳統(tǒng)的瘤胃菌群分析主要依賴細(xì)菌培養(yǎng)方法，而很多瘤胃內(nèi)含量較低或生長(zhǎng)條件苛刻的細(xì)菌無(wú)法通過(guò)體外培養(yǎng)獲得。近年來(lái)，隨著微生物組學(xué)與宏基因組學(xué)技術(shù)發(fā)展，使得更加深入細(xì)致的研究瘤胃菌群組成、變化、功能預(yù)測(cè)與分析成為可能。

1 圍產(chǎn)期瘤胃菌群組成

圍產(chǎn)期瘤胃活躍的菌群由20個(gè)細(xì)菌門組成，其中豐度最高的幾個(gè)細(xì)菌門是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、纖維菌門(Fibrobacteres)、軟壁菌門(Tenericutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。在其他分類水平上，豐度比較高的是厚壁菌門的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)，擬桿菌門的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，變形菌門的琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，纖維菌門的纖維桿菌屬(Fibrobacter)，螺旋體門的密螺旋體屬(Treponema)[5]。Zhu Z等[6]通過(guò)對(duì)圍產(chǎn)期奶牛瘤胃菌群分析發(fā)現(xiàn)最大優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，其次是擬桿菌門和變形菌門，最大優(yōu)勢(shì)菌屬為瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、纖維桿菌屬和丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)。與其他時(shí)期瘤胃菌群功能一致，圍產(chǎn)期瘤胃菌群按照功能不同大體可劃分為纖維素與半纖維素降解細(xì)菌，淀粉、蛋白及脂肪降解細(xì)菌，產(chǎn)甲烷菌、酸利用菌和乳酸產(chǎn)生菌[7]。

2 圍產(chǎn)期瘤胃菌群特點(diǎn)

2.1 菌群豐度與多樣性變化

瘤胃菌群適當(dāng)?shù)呢S度，多樣性和穩(wěn)定性對(duì)瘤胃健康與瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。研究表明，圍產(chǎn)期瘤胃菌群豐度往往隨著時(shí)間的推移而逐漸降低，并且在泌乳期較低[8]。研究發(fā)現(xiàn)，母牛分娩后瘤胃菌群豐度和多樣性降低[9]。產(chǎn)后早期奶牛瘤胃菌群豐度急劇下降，且這種下降比較短暫[8]。以谷物為基礎(chǔ)的日糧進(jìn)行飼喂，瘤胃菌群多樣性普遍降低，這種減少可能與發(fā)酵結(jié)構(gòu)碳水化合物的細(xì)菌可利用的底物減少以及隨后的較低pH有關(guān)。同時(shí)，細(xì)菌多樣性的減少與菌群豐度的減少有關(guān)，在以谷物為基礎(chǔ)的日糧飼喂的牛也觀察到了這種情況[10]。多數(shù)研究表明圍產(chǎn)期菌群的這種變化趨勢(shì)，即隨著奶牛從干奶期過(guò)渡到泌乳期，從高纖維飼料轉(zhuǎn)變到高精料飼喂，瘤胃菌群豐度和多樣性隨之下降。而在采集到的圍產(chǎn)期瘤胃液樣本中，沒(méi)有觀察到明顯的菌群豐度和多樣性變化[11]?？傊?，圍產(chǎn)期瘤胃菌群變化迅速發(fā)生，表明細(xì)菌群落適應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)所需的時(shí)間很短。盡管隨著精料比例的逐漸增加，瘤胃菌群豐度的降低變得不那么明顯，但與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后的豐度仍然較低。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)與組成變化

隨著飼料及飼喂模式轉(zhuǎn)變及距離分娩時(shí)間不同，奶牛圍產(chǎn)期瘤胃菌群種類及豐度在不同階段會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，產(chǎn)前軟壁菌門、綠彎菌門和疣微菌門所占比例較高，產(chǎn)后放線菌門(Actinobacteria)所占比例較高[12]。而作為瘤胃液中豐度最高的2個(gè)菌門，厚壁菌門與擬桿菌門細(xì)菌豐度及種類在圍產(chǎn)期變化尤為明顯。當(dāng)奶牛從產(chǎn)犢前的飲食過(guò)渡到哺乳期的飲食時(shí)，最顯著的變化是擬桿菌比例的增加和厚壁菌的減少[4]。與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后擬桿菌與厚壁菌的比值幾乎翻了一番(從6∶1到12∶1)。擬桿菌門的優(yōu)勢(shì)菌屬普雷沃氏菌和擬桿菌屬與產(chǎn)后瘤胃生態(tài)系統(tǒng)呈正相關(guān)，而厚壁菌門的瘤胃球菌屬，丁酸弧菌屬和克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)則在產(chǎn)前瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中富集[12]。厚壁菌門/擬桿菌門比值(F/B)可以看做腸道菌群代謝潛能的生物標(biāo)志，與某些疾病的發(fā)生、宿主的新陳代謝及生理健康密切相關(guān)[13]。產(chǎn)后瘤胃菌群的另一個(gè)值得注意的特征是鏈球菌和乳桿菌屬的過(guò)度表達(dá)，作為瘤胃內(nèi)重要的淀粉利用者及乳酸產(chǎn)生者，該類細(xì)菌隨著產(chǎn)后高精料飼喂逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)[14]。對(duì)干奶期及泌乳早期瘤胃菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著精料增加，泌乳早期梭菌豐度較低，擬桿菌豐度較高，纖維桿菌相對(duì)豐度降低，相比于產(chǎn)前，氣單胞菌(Aeromonadales)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、醋香腸菌屬(Acetitomaculum)和未分類琥珀酸弧菌科細(xì)菌的相對(duì)豐度明顯升高[8]。盡管缺乏足夠的直接證據(jù)，但圍產(chǎn)期瘤胃菌群的變化與遷移可能與某些圍產(chǎn)期疾病發(fā)病率升高密切相關(guān)。瘤胃中革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)乳酸菌，如鏈球菌與乳酸菌大量增殖，可能導(dǎo)致pH降低，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒(SARA)[15]。而隨著產(chǎn)后產(chǎn)乳酸菌數(shù)量增加，但丙酸生成菌，包括反芻月形單胞菌和埃氏巨型球菌的數(shù)量顯著減少，瘤胃中生成的過(guò)量乳酸不能及時(shí)分解，導(dǎo)致生糖先質(zhì)及能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致酮病發(fā)病率升高[16]。

3 影響因素

3.1 品種和胎次

不同品種牛瘤胃菌群存在顯著差異，而奶牛處于不同生理階段也會(huì)對(duì)瘤胃菌群組成及豐度造成一定影響。調(diào)查產(chǎn)后飲食對(duì)處于圍產(chǎn)期3個(gè)不同品種頭胎奶牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)娟珊牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌Mbr.thaueri的平均豐度較低(26.9%)，荷斯坦純種(30.7%)和荷斯坦-娟珊牛雜交牛(30.3%)較高[17]。研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期飼喂相同飼料，與低產(chǎn)奶牛相比較，高產(chǎn)奶牛擬桿菌門豐度及擬桿菌門/厚壁菌門比值更高，布氏普雷沃氏菌(Prevotellabryantii)等多種與瘤胃液中丙酸摩爾比例顯著相關(guān)的細(xì)菌豐度明顯更高[18]。此外，通過(guò)圍產(chǎn)期瘤胃菌群分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在門水平還是屬水平，初產(chǎn)母牛和多胎次母牛均存在顯著差異[4]。其中，初產(chǎn)母牛主要表現(xiàn)為擬桿菌門增多，且普雷沃氏菌更為豐富，多胎次母牛主要表現(xiàn)為軟壁菌門增多。

3.2 日糧

一般來(lái)講，腸道菌群組成及功能主要取決于飼料種類及攝入量。高精料日糧常導(dǎo)致瘤胃菌群多樣性下降，相反，高草料日糧常導(dǎo)致瘤胃菌群多樣性升高[19]。對(duì)產(chǎn)后3周左右的中國(guó)荷斯坦奶牛進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)飼喂高精日糧奶牛瘤胃菌群豐度及多樣性均低于飼喂低精日糧奶牛[20]。 圍產(chǎn)期奶牛飼喂的主要特點(diǎn)是由干奶期的高草料飼喂轉(zhuǎn)變?yōu)槊谌槠诘母呔巷曃?，以提供更多的能量滿足泌乳需要，為了盡量緩解分娩及泌乳應(yīng)激，同時(shí)為瘤胃微生物提供足夠的適應(yīng)時(shí)間，通常選擇在圍產(chǎn)前期逐步更換飼料[21]。在奶牛圍產(chǎn)期采用典型兩段式飼喂方式，奶牛干奶期飼喂高粗料，產(chǎn)前21 d開(kāi)始轉(zhuǎn)換成高能量飼料直到泌乳，分娩后飼喂一般泌乳料[12]。結(jié)果表明，被認(rèn)為是主要的瘤胃纖維分解菌的瘤胃球菌屬和丁酸弧菌屬在產(chǎn)前瘤胃生態(tài)系統(tǒng)中明顯增多，產(chǎn)后自主性干物質(zhì)采食量增加，能量代謝途徑富集，主要表現(xiàn)為蛋白水解、淀粉水解和乳酸產(chǎn)生菌，包括普雷沃氏菌、鏈球菌和乳酸桿菌等組成的細(xì)菌屬的富集。干奶期高粗飼料含有更高比例的纖維素，因此纖維素降解菌數(shù)量相對(duì)較高，而更換高精飼料后，由于飼料中含有大量谷物及其他易發(fā)酵碳水化合物，纖維素含量低，瘤胃發(fā)酵模式改變，纖維降解菌急劇減少，淀粉分解菌、蛋白分解菌數(shù)量快速增加[22]。

3.3 微生態(tài)制劑

在基礎(chǔ)日糧中添加微生物能夠調(diào)節(jié)瘤胃及腸道菌群，提高反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能和飼料利用率，并可能在一定程度上減少圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生。以多種酵母組成的復(fù)合微生態(tài)制劑飼喂圍產(chǎn)期奶牛，發(fā)現(xiàn)瘤胃中布氏普雷沃氏菌(Prevotella)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、嗜淀粉瘤胃細(xì)菌(Ruminobacteramylophilus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、厭氧弧桿菌(Anaerovibriolipolytica)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、反芻月形單胞菌(Selenomonasruminantium)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)的數(shù)量顯著增加，在一定程度上抑制了乳酸桿菌及牛鏈球菌的生長(zhǎng)，表明添加微生態(tài)制劑可以影響瘤胃菌群組成，并可能通過(guò)改變瘤胃發(fā)酵模式緩解能量負(fù)平衡，預(yù)防圍產(chǎn)期疾病[16]。分析奶牛圍產(chǎn)期飼喂活性酵母添加劑后瘤胃菌群變化情況，分別在產(chǎn)前14 d，產(chǎn)后7 d及21 d采集瘤胃液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，添加活性酵母后在產(chǎn)前14 d增加了擬桿菌、毛螺菌科和Flexilinea的相對(duì)豐度，在產(chǎn)后21 d增加了鏈球菌的相對(duì)豐度[23]。添加活性酵母對(duì)瘤胃菌群的影響作用主要表現(xiàn)在分娩前，不同的采樣時(shí)間也會(huì)明顯影響瘤胃菌群變化。

3.4 其他飼料添加劑

很多飼料添加劑都可以影響瘤胃發(fā)酵及菌群結(jié)構(gòu)，從而提高發(fā)酵效率，保證瘤胃健康，其中抗微生物生長(zhǎng)促進(jìn)劑應(yīng)用最為廣泛。莫能菌素是一種聚醚類抗生素，能夠選擇性抑制某些微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程，是最常用的反芻動(dòng)物促生長(zhǎng)抗生素之一。莫能菌素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)瘤胃菌群組成來(lái)影響甲烷、乙酸、丙酸的生成。隨著抗生素的使用受到限制，很多植物性抗菌劑成為研究熱點(diǎn)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景，如啤酒花苦味酸，可以抑制產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)，抑制牛鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，而對(duì)革蘭氏陰性菌不敏感，顯示出與莫能菌素類似的作用[24]。在犢牛飼料中添加牛至精油和莫能菌素，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)瘤胃菌群都具有調(diào)節(jié)作用，添加牛至精油可使?fàn)倥Ａ鑫傅鞍捉到饩S度升高，產(chǎn)丁酸菌屬豐度降低，更重要的是其可能對(duì)莫能菌素所導(dǎo)致的有益菌群的破壞具有一定緩沖作用[25]。此外，瘤胃保護(hù)性補(bǔ)充劑的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但其對(duì)瘤胃菌群影響作用尚未可知。在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加瘤胃保護(hù)蛋氨酸，并在產(chǎn)前10 d和產(chǎn)后20 d采集瘤胃液檢測(cè)瘤胃菌群，結(jié)果反芻獸月形單胞菌是豐度最高的細(xì)菌種類，與產(chǎn)前相比，產(chǎn)后脂解厭氧弧桿菌、瘤胃巨型球菌、布氏普雷沃氏菌， 反芻獸月形單胞菌和牛鏈球菌相對(duì)豐度升高，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、溶淀粉琥珀酸單胞菌(Succinimonasamylolytica)和溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)相對(duì)豐度下降[26]。

3.5 圍產(chǎn)期疾病

腸道菌群紊亂能夠?qū)е露喾N疾病發(fā)生，很多疾病發(fā)生過(guò)程中存在菌群組成及結(jié)構(gòu)變化。在反芻動(dòng)物，由于瘤胃及瘤胃微生物的重要作用，瘤胃菌群正常與否對(duì)于奶牛機(jī)體健康尤為重要。奶牛圍產(chǎn)期通常伴隨酮病和低鈣血癥等代謝性疾病發(fā)生，并且往往導(dǎo)致子宮炎、乳腺炎、蹄葉炎、胎衣不下、真胃變位等疾病發(fā)病率升高[27]。瘤胃菌群的多樣性及菌群構(gòu)成會(huì)不斷變化，瘤胃pH可能會(huì)影響瘤胃細(xì)菌群落的組成和多樣性，反之亦然。同時(shí)，通過(guò)減少瘤胃pH的不利變化，奶牛瘤胃發(fā)酵可以適應(yīng)重復(fù)的SARA挑戰(zhàn)[28]。此外，奶牛酮病與瘤胃菌群組成及瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的不同揮發(fā)性脂肪酸含量及比例密切相關(guān)，奶牛瘤胃菌群與亞臨床酮病發(fā)生存在密切關(guān)聯(lián)，其中相關(guān)性最強(qiáng)的是普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科細(xì)菌[29]。人工誘導(dǎo)SARA導(dǎo)致乳腺炎，瘤胃菌群紊亂是導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生的重要內(nèi)在因素，而寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)可能是導(dǎo)致乳腺炎發(fā)生的內(nèi)源性病原菌之一[30],奶牛蹄葉炎也可能與瘤胃菌群紊亂所導(dǎo)致的血中乳酸升高及內(nèi)毒素血癥有關(guān)[31]。

4 展望

在奶牛圍產(chǎn)期，從高纖維飲食轉(zhuǎn)向低纖維飲食導(dǎo)致瘤胃菌群發(fā)生變化，并與多種圍產(chǎn)期疾病的發(fā)生密切相關(guān)，對(duì)圍產(chǎn)期瘤胃菌群的分析可以提供有關(guān)瘤胃菌群的群落結(jié)構(gòu)和代謝特性的詳細(xì)信息，進(jìn)而可以用來(lái)改善反芻動(dòng)物飼養(yǎng)策略，預(yù)防或治療疾病。隨著基因組學(xué)、微生物組學(xué)以及代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們得以對(duì)瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)、組成與功能進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究分析，但由于瘤胃中可以檢測(cè)到的大多數(shù)細(xì)菌仍然無(wú)法通過(guò)分離培養(yǎng)方法獲得，導(dǎo)致目前的研究仍然存在一定局限性，因此對(duì)圍產(chǎn)期瘤胃菌群研究與分析仍然需要繼續(xù)探索更加多樣的試驗(yàn)方法，以期對(duì)圍產(chǎn)期瘤胃菌群變化的影響因素及其所蘊(yùn)含的意義有更加清晰的認(rèn)識(shí)，為奶牛生產(chǎn)及圍產(chǎn)期疾病的防治提供更加有價(jià)值的線索與幫助。