邱玲，劉宇，鄭楠楠，宋敏，陳能花，馮瑞冰，王澤雨，周燕青，張慶文,

（1. 澳門大學中華醫(yī)藥研究院中藥質量研究國家重點實驗室，澳門；2. 澳門大學健康學院藥物科學系，澳門）

在人類歷史長河中，天然藥物一直是人類用于治療疾病和保健強身的一種重要資源。天然產物是生物在進化過程中為適應環(huán)境而產生的一類次生代謝產物，具有豐富多樣的化學結構以及獨特的生物學功能，在新藥研究中扮演著舉足輕重的角色。19世紀以來，人類已經從各類生物中獲得了一系列化學結構和生理活性令人矚目的天然產物，如嗎啡、紫杉醇、青蒿素等，類似重要的發(fā)現至今仍層出不窮。目前，天然產物的提取分離技術依然是天然產物化學研究領域中最活躍的研究方向之一。本文對天然產物的提取分離技術進行總結，以期為天然產物化學研究提供參考和思路。

1 天然產物的提取

提取的目的是從天然原料里獲得含有目標天然產物的粗提物，是分離純化天然產物的第一步。其中溶劑萃取法是最常用的傳統(tǒng)提取方法。在天然產物提取過程中，溶質在溶劑中的擴散度和溶解度是影響提取率的關鍵因素，即任何能夠促進溶質在溶劑中擴散或溶解的條件都能提高其提取率[1-4]。

傳統(tǒng)的提取方法包括浸漬、滲漉、煎煮、回流等。特點通常是在常壓下，用大量的水或有機溶劑作為溶劑進行提取，提取時間一般較長且提取率較低?，F代或更加環(huán)保的提取方法一般是通過加壓等輔助手段提高目標產物的提取率，如超臨界流體萃取、加壓液體萃取和微波輔助萃取，上述方法具有節(jié)省溶劑、縮短提取時間、高選擇性等優(yōu)點[5]。

1.1 傳統(tǒng)提取法

1.1.1 滲漉法滲漉法（percolation）與浸漬法（maceration）是兩種最簡單的溶劑提取法。由于提取過程往往不需要加熱，所以特別適用于熱不穩(wěn)定性物質的提取。滲漉法比浸漬法更高效，因為它是一個持續(xù)的動態(tài)過程，新鮮的溶劑會不斷置換出飽和的浸出液，從而可更充分地提取出天然原料中的化學成分。通過滲漉法所得到的提取物相對比較干凈，但提取較耗時。Li等[6]研究了藥材粒徑和堆積厚度對滲漉效果的影響，發(fā)現所有高度的滲漉過程都會產生較大的滲漉壓降，且壓降大小與藥材的堆積厚度呈正相關，堆積越厚消耗能量越多。為解決傳統(tǒng)單筒滲漉法的上述缺點，作者采用了多層滲漉法，在藥材總量相同的情況下提高了藥材的孔隙性和滲透性[7]。Yang等[8]采用90%甲醇對中藥黃蜀葵花進行滲漉提取，最終分離得到1個新化 合 物quercetin-8-(2''-pyrrolidinon-5''-yl)-3'-O-β-Dglucopyranoside和11個已知化合物。

1.1.2 水煎法水煎法（decoction）以水作為提取溶劑，對小極性天然產物提取不完全，提取物通?；煊写罅克苄噪s質，同時由于其需要較高溫度的加熱，可引起熱不穩(wěn)定化合物的分解以及揮發(fā)性物質的流失，故水煎法在以分離為目的的天然產物研究中并不常用。但由于水煎法是傳統(tǒng)中藥的常用制備方法，所以水煎煮過程中成分的變化也一直是研究的關注點。近年來，人們除了對藥材中的小分子天然化合物進行研究外，也越來越關注多糖等生物大分子，水煎法已被廣泛用于藥材中多糖類成分的提取。Zhao等[9]通過水提醇沉的方法對干燥金銀花和4種干燥山銀花（灰氈毛忍冬、菰腺忍冬、黃褐毛忍冬和華南忍冬）中的多糖類成分進行提取，提取率分別為6.9%、6.3%、5.7%、7.2%和5.5%。通過分析發(fā)現，與蛋白質結合的多糖部分均具有相似的化合物組成，并都有顯著的降糖效果，提示這4種山銀花可以作為金銀花的替代品種，用于治療2型糖尿病。Zhang等[10]利用水提醇沉法從山藥中提取多糖，得率為4.39%，并從中分離得到1個新的平均相對分子質量為10 000（約為1 200 ～ 12 000）的1，4-β-半乳聚糖。

水煎法因為長時間在水沸騰溫度提取，常引起藥材中化學成分發(fā)生變化。Li等[11]在研究獨參湯時發(fā)現，白參在水煎煮過程中人參皂苷類成分會發(fā)生水解、脫水、脫羧、加成等反應。Chen等[12]發(fā)現許多菊科植物含有的毒性成分蒼術苷在水煎煮過程中會被分解、水解和皂化破壞。中藥復方中含有多種藥材，其在煎煮過程中的成分變化更為復雜，除各單味藥材自身可發(fā)生成分變化外，一種藥材的成分還可能會對另一種藥材的成分產生助溶、沉淀和降解作用。霍志鵬等[13]對黃連-大黃不同配伍比例進行合煎時發(fā)現，配伍黃連對大黃中主要蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚有助溶作用。Kim等[14-15]分別利用11種和16種標記物探究芍藥、甘草復方以及肉桂、芍藥、甘草復方在不同比例水煎液中提取成分的變化。研究發(fā)現在其他藥材存在的情況下，煎煮可能會引起單一藥材標記物含量的減少，隨著單一藥材比例的增加，其總提取物中相應標記物的提取率會增加，但隨著總藥材量的增加，其標記物的含量卻會相應減少，這可能是中藥復方中某些成分影響了其他藥材中標記物的溶出。

1.1.3 回流法回流法（reflux extraction）與浸漬法和滲漉法相比，能夠縮短提取時間、節(jié)省提取溶劑，是天然產物化學研究中最常用的提取方法。但由于該方法需采用加熱的方式，故也不適合熱不穩(wěn)定性物質的提取。Hu等[16]以乙醇為溶劑，采用回流法從蒸三七中提取皂苷，并且根據Box-Behnken設計響應面法對提取時間、乙醇濃度、固液比和提取次數進行考察，最終確定用60%乙醇提取1.51 h，以10倍藥材體積的溶劑提取3次，可獲得最大得率的皂苷。另一方面，Sun等[17]在提取花青苷的研究中發(fā)現，當回流提取溫度高于41.2℃時，花青苷開始降解，在70℃條件下回流2 min后，花青苷的提取率會隨著提取時間延長而不斷下降。

1.1.4 索氏提取法索氏提取法（Soxhlet extraction）在熱回流的基礎上，增加了虹吸裝置，該裝置能保證藥材不斷被新鮮溶劑提取，因此索氏提取法同時具有熱回流法和滲漉法的優(yōu)點，可縮短提取時間并減少溶劑消耗，但同樣不適合熱不穩(wěn)定性物質的提取。為了探究不同提取條件對提取物含量的影響，Yue等[18]依照2015版《中華人民共和國藥典》，以人參為對象，氯仿為溶劑，考察了水浴位置、虹吸次數和回流次數對提取物中3個特征化合物人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re含量的影響，發(fā)現水浴位置可影響虹吸次數和回流次數，并對提取物中人參皂苷Rb1的含量影響最大。索氏提取法還被廣泛用于種子油的提取。Zhao等[19]發(fā)現以石油醚為溶劑，通過索氏提取法能提高辣木籽的出油率，達到39.2%，并且提取的辣木籽油質量高，主要含油酸、多種三酰甘油、β-谷甾醇和豆甾醇。

1.1.5 水蒸氣蒸餾提取法水蒸氣蒸餾提取法（steam distillation）是提取揮發(fā)油類成分的常用方法，但一些成分會由于熱不穩(wěn)定而被破壞。為了發(fā)掘天然環(huán)保的抗菌劑，Gao等[20]通過水蒸氣蒸餾提取法提取佛手精油，并利用GC-MS對其成分進行含量測定。結果顯示，佛手精油的提取率為1.45%，并從中鑒定出113個化合物，占精油總含量的93.4%。其中，以D-檸檬烯為主的烯萜類成分為佛手精油的主成分。另外，為了優(yōu)化水蒸氣蒸餾提取法的提取性能，Xing等[21]將超聲技術結合水蒸氣蒸餾法對佛手精油進行提取，提取率比使用傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提高了118%（0.48%vs0.22%）。

1.2 現代提取法

1.2.1 超臨界流體提取法超臨界流體提取法（supercritical fluid extraction）是使用超臨界流體為溶劑的提取方法。當接近臨界點時，壓力和溫度的微小變化即能引起超臨界流體密度的巨大變化，且黏度較液體溶劑小，因此對天然產物的溶解范圍廣，并能增加天然產物在溶劑中的擴散度，提高提取效率。由于二氧化碳具有較低的臨界溫度（31℃）和壓力（7.3 MPa），以及化學惰性、低成本、無毒等特點，因此超臨界二氧化碳是最常使用的超臨界流體，其對非極性化合物（如脂質和揮發(fā)油成分）有很好的提取效果。而對于極性物質的提取，可以通過向超臨界二氧化碳中添加改性劑來改善提取效率。為了更快、更全面地探究陳皮的親脂性成分，Zheng等[22]通過超臨界流體提取法和UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS技術分別對18批陳皮進行了提取和成分鑒別。結果共檢測到57個化合物，其中2個黃酮、6個有機酸、9個香豆素、3個醛類、7個酯類、3個萜類、1個檸檬苦素以及5個其他類型化合物為首次從陳皮中檢測出，說明超臨界二氧化碳提取法更有利于對陳皮中化學成分的全面深入研究。為了更充分利用盒子草的果仁資源，Zheng等[23]采用超臨界二氧化碳提取法對其進行提取，與索氏提取法和冷榨法相比，超臨界流體提取法能獲得更高的產油量和油回收率，其富含油酸、亞油酸、角鯊烯、維生素E和植物甾醇。

1.2.2 加壓溶劑提取法根據溶劑沸點隨壓力增加而升高的特性，在加壓溶劑提取法（pressurized liquid extraction）中，可通過增加體系壓力，使溶劑溫度升至其常溫下的沸點以上仍保持液體狀態(tài)。該方法具有更好的滲透性，并能保證溶質在溶劑中的高溶解度和高擴散速度，有效地縮短提取時間，從而提高提取效率。與其他提取方法相比，加壓溶劑提取法是一種能夠減少提取時間、降低溶劑消耗，并提高重復性的一種現代提取手段。與超聲輔助提取法的效果比較，加壓溶劑提取法能提高對酚類物質的提取效率，并減少溶劑消耗，提示加壓溶劑提取法可成為提取桑葚中天然產物的新方法[24]。

一些天然產物在高溫條件下會發(fā)生降解，其降解率與反應速度和時間成正比。加壓溶劑提取法雖在高溫下提取，但提取時間短，因此學者們對加壓溶劑提取法是否可用于熱敏天然產物的提取這一問題產生了分歧。Vergara-Salinas等[25]對葡萄皮渣中抗氧化物質進行加壓溶劑提取時發(fā)現，200℃時有美德拉反應產生。當溫度從150℃上升至200℃時，西番蓮副產物的總提取率降低，這可能和一些熱不穩(wěn)定性物質的分解有關[26]。不過也有研究表明，加壓流體萃取法是對薄荷中的酚類物質和精油進行同時提取的最合適方法[27]。

1.2.3 超聲波輔助提取法超聲波輔助提取法（ultrasound assisted extraction）又被稱為超聲波提取法，是一種利用超聲波技術來輔助溶劑提取的一種方法。由于超聲波在溶劑中產生的空化效應能促進溶質在溶劑中的擴散和溶解，同時還能有效傳遞熱量，因而能縮短提取時間、提高提取效率。另外，超聲輔助提取法操作簡便，并能節(jié)約溶劑和減少能源消耗。Drouet等[28]采用超聲波輔助提取法對水飛薊素進行提取研究。結果發(fā)現，獲得的水飛薊素得率約為傳統(tǒng)浸漬法提取效果的6倍，且水飛薊素中的6個主要化合物的含量也明顯提高。同時，該方法獲得的水飛薊素仍具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，提示超聲波輔助提取法或許可以成為一種更環(huán)保的水飛薊素提取方法。

值得注意的是，近年來有研究者指出超聲波輔助提取的頻率和功率可能會對一些活性化合物產生影響[29]，這可能與低頻率提取過程中產生的自由基有關[30]，但當以甲醇為溶劑時可以削弱自由基的產生[31]。Liao等[32]發(fā)現，當超聲頻率從20 kHz提高到45 kHz時，提取得到的黃酮含量最多，但當超聲頻率太高（超過60 kHz）時其提取率會明顯降低，這可能與減弱的空化效應有關。當超聲能量過高時也可產生類似的影響，使藥材局部產生溫度和壓力，從而不利于有效成分的提取[31]。

1.2.4 微波輔助提取法基于離子傳導和偶極子旋轉機制，微波通過與極性分子（水分子或藥材中化合物分子）相互作用而產熱。在微波輔助提取法（microwave assisted extraction）中，熱量傳遞和質量傳遞的方向是一致的，這兩種作用同時加速了提取過程，從而提高提取效率。微波輔助提取法具有可縮短提取時間、減少有機溶劑使用量、避免對提取成分產生熱降解和對藥材選擇性加熱的特點，也被認為是一種環(huán)保的提取方法。一般分為無溶劑提取法（一般適用于不穩(wěn)定化合物）和有溶劑提取法（一般適用于穩(wěn)定化合物）。與索氏提取法相比，Alara等[33]采用60%乙醇水作為溶劑，通過微波輔助提取法獲得的扁桃斑鳩菊葉提取物中總酚和總黃酮的含量更高，分別為(114.03±1.25) mg · g-1（沒食子酸當量）和(96.29±1.70) mg · g-1（槲皮素當量），相應地也具有更好的抗氧化活性。

1.2.5 脈沖電場輔助提取法脈沖電場輔助提取法（pulsed electric field extraction）通過破壞細胞膜結構來促進物質轉移，能有效縮短提取時間、提升提取效率。該方法是一個非加熱的提取方法，因而適用于熱不穩(wěn)定物質的提取。該方法主要受電場強度、輸入比能量和脈沖數等因素的影響。為了比較脈沖電場輔助提取法與傳統(tǒng)提取法的效果，Lakka等[34]利用脈沖電場輔助提取法對藥用植物番紅花、釀酒葡萄和一種毒馬草屬植物進行提取，并分別對提取條件進行優(yōu)化，分別獲得最大的總酚提取率。結果發(fā)現，當脈沖電壓為12 kV · cm-1時，番紅花和毒馬草屬植物的提取物中總酚含量比用傳統(tǒng)提取法時分別提高了35.25%和44.36%，其中番紅花提取物中紫云英苷的含量提高了64%，毒馬草植物提取物中芹苷元-7-葡萄糖苷含量提高了56%。當脈沖電壓為14 kV · cm-1時，釀酒葡萄提取物中總酚含量比用傳統(tǒng)提取法時提高了49.15%，其中蘆丁的含量提高了85%。

1.2.6 酶輔助提取法細胞膜和細胞壁的結構、多糖和蛋白質等大分子所形成的膠束以及蛋白質在高溫下的凝聚和變性是天然產物提取的主要障礙。由于酶對細胞壁和細胞膜成分以及細胞內大分子的水解作用可促進天然產物的釋放，因此利用酶可輔助提高提取效率。纖維素酶、α-淀粉酶和果膠酶是酶輔助提取法（enzyme assisted extraction）中比較常用的幾種酶。中藥內生菌被證實可能與宿主產生相同的次級代謝產物。Ma等[35]從中藥黃芩中分離得到一株能產生黃芩苷的短小芽孢桿菌，向黃芩內生菌發(fā)酵液中加入該內生菌的特定纖維素酶輔助提取。結果發(fā)現，用該方法提取的黃芩苷含量比通過索氏提取法獲得的黃芩苷含量增加了79.31%，提示酶輔助提取法可能對中藥活性成分的提取富集具有高選擇性。Nguyen等[36]發(fā)現纖維素酶A能促進迷迭香葉中迷迭香酸的溶出，提高提取效率。

1.3 其他新型提取方法

由于天然產物的復雜性，一些新型的提取方法也不斷地被開發(fā)出來，如閃式提取法，以期獲得更高效、更環(huán)保的效果。閃式提取法又被稱為組織破碎提取法，是通過高速機械剪刀和超分子滲濾技術，瞬間將藥材破碎成細微顆粒，以促進組織內部成分的溶出。Xu等[37]結合閃式提取法，最終從山參中分離鑒定出23個人參皂苷類化合物，其中三七皂苷R1為第一次從山參中分離得到。

此外，越來越多的研究表明將多種提取方法結合使用可能會提高天然產物的提取效率，并且可克服采用單一方法時的局限性[38-39]。另外，將一些特殊的材料用來輔助提取時還可使提取過程更加環(huán)保。如選擇含有30%水，以丙二醇為氫鍵供體、氯化膽堿為氫鍵受體（摩爾比為1∶1）的深共晶溶劑，通過超聲輔助提取能最大程度地獲得鷹嘴豆中的異黃酮成分[40]。

2 天然產物的分離

經不同提取方法得到的粗提物所含的化學成分往往比較復雜，需要經過進一步的分離純化后才能得到純度較高或單一的天然產物。而分離方法的選取則取決于目標成分和其他類型天然產物間的物理或化學性質的差異。分離方法根據不同的分類標準主要有以下幾種。

2.1 吸附柱色譜法

吸附柱色譜法根據天然產物對表面吸附劑親和度的不同而進行分離，由于其操作簡單、容量大、成本低等優(yōu)點，被廣泛應用于天然產物的分離，特別是在分離的初期階段。為了實現天然產物的良好分離，并最大限度地回收目標化合物，以及避免目標化合物在吸附劑上的不可逆吸附，固定相和流動相的選擇至關重要。

2.1.1 硅膠硅膠是天然產物化學研究中應用最為廣泛的吸附劑。據估計，近90%的天然產物的化學分離是通過硅膠而實現。硅膠是一種富含硅醇基團的極性吸附劑，目標分子通過氫鍵和偶極-偶極相互作用而被硅膠吸附保留。因此，極性天然產物在硅膠柱中的保留時間比非極性天然產物長。Cao等[41]采用硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯為流動相洗脫，并結合高效逆流色譜，從椿葉花椒的石油醚部位中分離得到了4個具有抗腫瘤活性的化合物xanthyletin、hinokinin、luvangetin和 asarinin。Tang等[42]采用有機溶劑回流提取法從桑葉中獲得白藜蘆醇的粗提物，以氯仿-甲醇（10∶1）為洗脫劑，經硅膠柱色譜純化，將白藜蘆醇的純度從0.8%提高到99.3%。Jiang等[43]研究土壤源真菌Clonostachys roseaYRS-06的化學成分，分離過程分別以二氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮、二氯甲烷-丙酮、二氯甲烷-乙酸乙酯等為流動相，將乙酸乙酯萃取部位及其各亞餾分經反復硅膠柱色譜分離純化，并結合其他方法，最終分離了9個生物堿，包括2個新穎的2，5-二酮哌嗪類生物堿clonorosin A和clonorosin B。在硅膠上分離生物堿時可能會出現嚴重的拖尾效應，可通過添加少量氨或三乙胺等有機胺減少拖尾現象。劉為等[44]采用硅膠柱層析法，以石油醚-二乙胺或石油醚-乙酸乙酯-二乙胺為流動相，從麗江烏頭根中分離得到11個二萜生物堿，包括1個新生物堿8-O-methyl-14-O-anisoylchasmanine。

2.1.2 氧化鋁氧化鋁是一種強極性吸附劑，適合生物堿類天然產物的分離。由于Al3+的強正電場和氧化鋁中的堿性位點對極性化合物的影響，目標分子在氧化鋁上的吸附作用不同于在硅膠上的吸附作用。陳佩佩[45]比較了正相堿性氧化鋁、硅膠以及反相C18同時分離純度為18%的紫杉醇樣品的柱性能，結果發(fā)現最終得到的紫杉醇純度依次為79%、30%和90%。在正相柱層析中，堿性氧化鋁的分離純化效果較好。因氧化鋁在分離過程中可使化合物催化脫氫、分解或異構化，近年來在天然產物分離中的應用明顯減少。有學者報道了使用堿性氧化鋁從東北紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)物中分離紫杉醇的方法，發(fā)現紫杉醇的回收率超過160%，其原因為氧化鋁催化7-epi-紫杉醇產生了異構化。另外，在氧化鋁柱層析中，少量的紫杉醇還可以被分解為baccatin Ⅲ和10-deacetylbaccatin Ⅲ[46]。

2.1.3 聚酰胺采用不同種類流動相時，聚酰胺柱層析過程中會發(fā)生疏水基和/或氫鍵相互作用。聚酰胺柱層析是分離蒽醌類、酚酸類、黃酮類等天然多酚類物質的常用方法，其機制為聚酰胺吸附劑、流動相和化合物之間形成氫鍵。李傳厚等[47]將小花鬼針草80%乙醇提取物的乙酸乙酯部位經硅膠柱分離后，將得到的亞餾分經聚酰胺柱分離，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，結合凝膠柱色譜和高效制備液相色譜，從該植物中發(fā)現了1個新的聚炔類化合物和1個新的異煙酸葡萄糖酯苷類化合物。另外，聚酰胺也可用于生物堿類成分的分離，Jin等[48]建立了用以乙酸乙酯-甲醇為流動相的聚酰胺柱色譜分離兒茶酚胺異喹啉生物堿的方法，從藥用植物馬齒莧中分離出10個水溶性兒茶酚胺異喹啉生物堿，包括3個新化合物。

2.1.4 大孔吸附樹脂大孔吸附樹脂是具有大孔結構但沒有離子交換基的聚合物吸附劑，可以選擇性地吸附幾乎任何類型的天然產物。其優(yōu)勢包括高吸附能力、相對低成本、易再生和易于放大，已被廣泛應用于預處理過程的一部分，用于去除雜質或富集目標化合物。大孔吸附樹脂與天然產物之間靜電力的大小及其比表面積、孔徑、極性是影響樹脂性能的關鍵因素[49]。熱毒寧注射液處方由金銀花、梔子和青蒿三味中藥組成，將熱毒寧注射液濃縮物經HP-20大孔樹脂分離，分別用水、30%和95%乙醇水洗脫得到A、B、C 3個餾分，C餾分進一步經硅膠柱色譜和高效制備液相色譜分離純化，得到2個新的萜類成分[50]。中藥草烏中含有大量的二萜生物堿，其中aconitine、mesaconitine、hypaconitine、benzoylaconine、benzoylmesaconine和benzoylhypaconine是其主要的藥效成分和毒性成分。有學者研究了大孔樹脂分離純化上述6種生物堿的方法，進一步比較了7種型號大孔樹脂（NKA-II、D101、X-5、AB-8、S-8、HPD722和HPD750）的富集和純化效果，并考察了樣品溶液的pH值、樣品初始濃度、洗脫劑乙醇-水的比例和pH值等因素對樹脂吸附和解吸性能的影響。最終發(fā)現，樣品溶液的pH值、洗脫劑乙醇-水的比例和pH值為大孔樹脂吸附和解吸率的主要影響因素，pH值為2的乙醇-水（95∶5）溶液為最佳的解吸溶液，NKA-II型大孔樹脂在最佳pH值下具有最高的吸附和解吸能力。通過NKA-II型大孔樹脂柱分離純化，6種生物堿的純度可提高到60.3%，回收率為75.8%[51]。有學者認為，大孔樹脂對多酚類成分的吸附機制主要是樹脂醚鍵的氧原子與酚羥基的氫原子之間形成氫鍵，溶液的pH值對氫鍵相互作用力有顯著影響[52-53]。

2.2 基于分配系數的分離

2.2.1 分配色譜法分配色譜法（partition chromatography）是根據天然產物在2種不混溶液體中的相對溶解度的不同，對目標分子進行分離的一種方法，其遵循液-液萃取原理。在早期，將一種液體作為固定相涂布在固體基質（硅膠、碳和纖維素等）上，另一種液體則用作流動相，固定相容易脫落和重復性差的缺點導致該分配色譜法目前使用較少。而鍵合固定相法則克服了上述缺點，在鍵合固定相中，液體固定相通過化學鍵鍵合到惰性載體上，用作固定相。市售的烷基，如C8、C18、芳基、氰基和氨基取代的硅烷常被用作鍵合相，廣泛用于分離各類天然產物，尤其是在最終純化的步驟中。使用甲醇-水（78∶22）系統(tǒng)作為流動相，2個新骨架倍半萜curcumane A和curcumane B在C18鍵合硅膠色譜柱上實現了很好的分離[54]。Cai等[55]合成了一種新型的基于聚丙烯酰胺的二氧化硅固定相，并以乙醇-水為流動相，成功對半夏半乳糖低聚糖和皂苷類成分進行了分離。環(huán)亞麻肽（linusorbs）是一組源自亞麻籽油的環(huán)狀疏水肽，具有良好的保健效果，但由于該類物質的分離純化和結構鑒定比較困難，限制了其研究和應用。Liu等[56]將環(huán)亞麻肽粗提物通過苯基-己基鍵合相硅膠色譜柱進行分離，以乙腈-水（40∶60）至乙腈-水（80∶20）梯度洗脫，洗脫時間21 min，流速16 mL · min-1，通過離線MS/MS驗證獲得12種環(huán)亞麻肽，純度超過95.5%。

2.2.2 逆流色譜逆流色譜（counter-current chromatography）是通過重力或離心力保持液相固定相的分配色譜。與使用固態(tài)固定相的常規(guī)柱分離方法相比，流體靜力和流體動力逆流色譜法均具有一些優(yōu)勢，包括消除不可逆的吸附和峰拖尾，高載量、樣品回收率高、樣品變性風險小、溶劑消耗少等優(yōu)勢[57]。而逆流色譜的局限性在于其僅適用于相對較窄極性范圍內的化合物的分離。在過去的20年，高速逆流色譜（high speed counter-current chromatography）、高效逆流色譜（high performance counter-current chromatography）和離心分配色譜（centrifugal partition chromatography）在分離科學研究領域引起了極大的關注，并已廣泛應用于天然產物的分離中。Wang等[58]開發(fā)了一種使用兩相溶劑系統(tǒng)（包括乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水，5∶2∶5∶2，6∶1∶6∶1.2）的高速逆流色譜方法，從東南亞植物革秘里中分離出5個新的聚炔類天然產物longifolione A～E，其中l(wèi)ongifolione D和longifolione E為新化合物。揮發(fā)油很難通過常規(guī)柱色譜法進行分離，高速逆流色譜、高效逆流色譜和離心分配色譜也已成功地應用于揮發(fā)油的分離。運用高速逆流色譜法，使用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（7∶3∶5∶5）、正己烷-甲醇-水（3∶2∶1）和正己烷-氯仿-乙腈（6∶2∶5）組成的3種不同溶劑系統(tǒng)，對600 μL（350 mg）生姜揮發(fā)油中的天然產物進行分離，最終得到35 mg的6-gingerol、23 mg的zingerone和105 mg的倍半萜混合物，其純度依次是98.6%、99.4%和99.2%[59]。使用兩相溶劑系統(tǒng)（包括正庚烷-丁醇乙酸乙酯-甲醇-水，5∶2∶5∶2）的離心分配色譜法，并結合凝膠柱色譜和硅膠柱色譜法對洋甘菊揮發(fā)油進行分離純化，共得到9個化合物[60]。

2.3 基于分子大小的分離

目前，基于分子大小分離天然產物的方法主要為膜分離法和凝膠色譜法。

2.3.1 膜分離膜分離（membrane filtration）利用混合物中化合物分子大小不同，小分子物質在溶液中可通過半透膜，而大分子物質不能通過半透膜的性質，對混合物進行分離。膜分離法根據所用膜孔徑（微濾、超濾和納濾）的大小可對不同分子大小的天然產物進行分離，已廣泛用于食品和制藥行業(yè)中。當單一的膜分離效果不理想時可以采用耦合膜分離。魏涵偉[61]采用PALL Minimate超濾系統(tǒng)和Omega改性聚醚砜超濾膜對玉米胚芽多肽進行了超濾分級分離優(yōu)化實驗。根據玉米胚芽多肽的相對分子質量大小及超濾膜包的選用原則，選擇截留相對分子質量分別為10 000、5 000和1 000的超濾膜包，最終分離純化得到4個玉米多肽組分，分別為ZF1（ZF1＞10 000）、ZF2（5 000＜ZF2＜10 000）、ZF3（1 000＜ZF3＜5 000）和ZF4（ZF4＜1 000）。布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）用于抗菌肽的生產，有關學者報道了一種結合凝膠G50柱色譜和超濾多孔透析膜（截留相對分子質量為10 000）從布拉氏酵母菌提取物中分離純化抗菌肽的方法，該抗菌肽的相對分子質量為5 792[62]。

2.3.2 凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜（gel filtration chromatography）也稱為凝膠滲透色譜法或尺寸排阻色譜法，小分子化合物在凝膠過濾色譜上的保留時間比大分子化合物久。

葡聚糖凝膠（Sephadex）由葡聚糖和甘油基經醚鍵交聯而成，G型Sephadex可用于分離親水性化合物，如肽[62]、寡糖和多糖[63]。Sephadex LH-20為一種Sephadex G25的羥丙基化衍生物，兼具親水性和疏水性。Sephadex LH-20的分離原理除按照相對分子質量大小，同時還可根據吸附作用對化合物進行分離。Sephadex LH-20可用于在含水或不含水的洗脫劑體系中分離多種不同類型的天然產物。Liu等[64]采用Sephadex LH-20，以甲醇-水（75∶25）體系和二氯甲烷-甲醇（1∶1）體系對益母草的正丁醇部位進行反復分離，并結合硅膠薄層制備色譜和反相C18色譜，最終分離純化得到4個環(huán)肽、9個生物堿和3個黃酮苷，其中包含2個新的環(huán)肽。莪術中富含倍半萜類成分，將莪術乙醇提取物的乙酸乙酯部位經硅膠柱色譜進行初步分離后，再經Sephadex LH-20，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）或石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）洗脫，結合中壓液相色譜和高效液相色譜進行分離純化，從莪術中分離鑒定出7對新的倍半萜對映異構體(+)/(-)-phaeocaulines A–G[65]。此外，聚丙烯酰胺凝膠（商品名：bio-gel P）[66]和交聯瓊脂糖凝膠[67]也常被用于天然產物的分離。

2.4 基于離子強度的分離

離子交換色譜（ion-exchange chromatography）是基于化合物的凈表面電荷差異進行分離的方法。一些天然產物，如生物堿和有機酸，其結構中含有能夠電離的官能團，可以通過離子交換色譜進行分離。通過改變流動相的離子強度，如改變pH值或鹽溶液的濃度，帶電分子可以被離子交換樹脂捕獲和釋放。陽離子交換樹脂適用于生物堿的分離，陰離子交換樹脂適用于有機酸和酚類物質的分離。核苷酸結構中含有3個高度極性的基團，磷酸基、核堿基和糖取代基。Jiang等[68]通過離子交換色譜，結合超濾、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離，離子阱串聯質譜法分析，從大豆蛋白水解物中鑒定出2種三肽化合物Gly-Ser-Arg和Glu-Ala-Lys。

2.5 其他現代分離技術

2.5.1 分子蒸餾分子蒸餾（molecular distillation）是一種在遠低于化合物沸騰溫度的真空條件下，通過蒸餾法分離化合物的方法，適用于具有熱敏性和高相對分子質量的化合物的分離。

藻油中富含二十二碳六烯酸（DHA），為增加其含量，He等[69]開發(fā)了一種結合使用1，3-特異性固定化脂肪酶進行乙醇分解和分子蒸餾，從而富集藻油中的DHA的方法。將含有45.94% DHA的藻油與乙醇混合后，泵入固定化脂肪酶（Lipozyme?TL IM）填充的色譜柱，室溫下循環(huán)4 h，真空蒸餾回收乙醇。當蒸餾溫度達到150℃時，殘留物分離為3個組分，分別為富含DHA甘油酯的高相對分子質量組分[三酰甘油（TG）、二酰甘油（DG）和單酸甘油酯（MG）]、低相對分子質量組分[棕櫚酸（PA）]和DHA乙酯（EE）。結果表明，76.55%藻油中的DHA主要存在于高相對分子質量組分中，其含量為70.27%。

2.5.2 制備型高效液相色譜制備型高效液相色譜是目前天然產物分離純化領域應用最廣泛的，發(fā)展最快速的分離純化技術，具有載樣量大、分離度高、重現性好等優(yōu)點，反相制備型高效液相色譜是目前實際生產和科研事業(yè)中的主流技術，其固定相一般為C8、C18、芳基、氰基和氨基鍵合硅膠；流動相一般為甲醇-水或乙腈-水，可依據化合物的本身性質在流動相中添加酸、堿、緩沖鹽，改善其色譜行為，得到分離度良好的色譜峰；常用的檢測器為紫外檢測器。

2.5.2.1 反相制備型高效液相色譜Li等[70]以生物活性為導向，結合高效液相色譜對鏈霉菌發(fā)酵液中的抗真菌類化學成分群進行定位以及分離純化。通過考察帶正電荷的C18、帶負電的C18和C8的分離性能，發(fā)現幾種固定相交替使用時分離性能最佳，因此，首先使用帶正電荷的C18色譜柱將鏈霉菌發(fā)酵液提取物分離為幾個粗餾分，后將幾個粗餾分進行抗真菌活性測試，選擇具有抗真菌活性的餾分交替使用帶負電荷的C18色譜柱和C8柱進行分離純化，最終從鏈霉菌發(fā)酵液分離鑒定出4個具有抗真菌活性的化合物——polyoxins A、K、F和H。Chen等[71]對粗莖鱗毛蕨的化學成分進行了研究，粗莖鱗毛蕨的干燥根莖用95%乙醇提取后，提取物用石油醚萃取，將石油醚部位經硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、中壓柱色譜進行初步分離得到粗餾分，進一步將各餾分經制備型高效液相色譜，以C18色譜柱（5 μm，20×250 mm）為固定相，乙腈-甲酸水為流動相進行分離，最終從粗莖鱗毛蕨中分離鑒定出5種β-生育酚衍生物drycrasspherols A–E，其中drycrasspherols C和drycrasspherols D為新骨架化合物，drycrasspherols E為β-生育酚衍生物的二聚體化合物。

2.5.2.2 正相制備型高效液相色譜正相高效液相色譜雖然應用較少，但是由于揮發(fā)油以及一些弱極性化合物在含水的反相流動相中難溶或不溶，正相制備型高效液相色譜在揮發(fā)油以及一些弱極性化合物的分離純化過程中具有一定的優(yōu)勢，Zhou等[72]對廣藿香揮發(fā)油進行了研究，首先通過硅膠、中壓柱色譜、凝膠柱色譜對其進行初步分離，對得到的粗餾分通過正相制備型高效液相色譜，固定相為半制備硅膠色譜柱，流動相為正己烷-異丙醇（100∶1），從廣藿香揮發(fā)油中發(fā)現了2個新的倍半萜類成分。

2.5.2.3 手性分離高效液相色譜對于化學組成、物理性質和分子結構相同的化合物，不同的構型可能會導致其截然不同的生物活性/毒性，且目前使用的藥物大部分具有手性性質，所以對映體分離一直是藥品質量控制的重要保障手段之一。但由于不同構型對映體僅表現出不同的旋光性，所以對映體分離也是色譜分析中的難點之一。高效液相色譜法、超臨界流體色譜和逆流色譜法等是實現手性分離（chiral separation）的重要技術[73-75]。高效液相色譜法由于具有高靈敏度和高重現性的特點，現已被廣泛用于對映體的分離和測定。一般來說，手性環(huán)境是分離對映體的必要條件，所以選擇具有手性選擇性識別特性的固定相是關鍵，目前常用的手性固定相包括環(huán)多糖、糊精、杯芳烴和冠醚等[75-77]，同時，一些新類型的固定相也在被探索應用[78-79]。Meng等[80]利用纖維素類手性柱Lux?Cellulose-3（5 μm），從篦子山尖杉枝中分離得到2對新的去甲木質素糖苷異構體。另外，流動相中鹽的種類和含量、pH、添加的有機改性劑等也是導致分離效果差異的幾個重要因素[79]。Zhou等[81]利用Daicel Chiralpak AD-H手性色譜柱，分別控制流動相的比例、流速2個條件，從紅莓中分離得到4對苯丙烷類對映體。

2.5.2.4 親水相互作用高效液相色譜傳統(tǒng)反向液相色譜分離需要通過高比例水相才能提高對目標化合物的保留時間，但高比例的水相可能會導致固定相的反浸潤，且對某些強極性的親水性化合物仍保留較弱或無保留。親水相互作用液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography），又被稱為“含水正相色譜”，采用強極性固定相，且能適用于水或緩沖液/有機物的流動相，因而能彌補正相和反相色譜的不足，對大極性的水溶性化合物有很好的分離效果，例如酚類、糖類、黃酮類等。苯胺、蘇丹紅等6種酚類物質因與酰胺包埋的二氧化硅固定相之間保留作用的大小不同而達到分離[82]。另外，流動相的pH值、緩沖液濃度等條件也是影響化合物在親水相互作用液相色譜中分離效果的重要因素。向乙腈-水流動相中加入0.8%甲酸和30 mmol · L-1甲酸銨，可以有效改善靈芝多糖酸水解產物的拖尾峰型，提高分離效率和檢測靈敏度；能快速鑒別不同產地的靈芝單糖和寡糖組成及含量，有利于靈芝的質量控制[83]。Abdulrahman等[84]使用ZIC-HILIC柱對紅茶和綠茶中的非瑟酮進行分離，并且評估了流動相對其分離效果的影響，確認85%乙腈和30 mmol · L-1（pH 5）的醋酸鈉緩沖液對非瑟酮有最好的分離效果。該方法能快速有效地對紅茶和綠茶中的非瑟酮進行含量測定。

2.5.3 制備型氣相色譜氣相色譜具有分離度高、分析和分離速度快的特點，是揮發(fā)性化合物分離的理想制備方法。由于目前缺乏商業(yè)性的制備型氣相色譜（preparative gas chromatography，Pre-Gc），普通氣相色譜儀的進樣口、色譜柱、分流裝置、收集系統(tǒng)需通過改進來達到高效分離制備目標化合物的目的[85]。有學者報道了對土耳其植物Prangos heyniaeH.Duman & M.F.Watson揮發(fā)油的化學成分研究，GC-MS和GC-FID（火焰離子化檢測器）分析結果表明，該植物揮發(fā)油中富含倍半萜類成分，包 括germacrene D（10.3% ～ 12.1%）、β-bisabolene（14.4%）、kessane（26.9%）、germacrene B（8.2%）、elemol（3.4% ～ 46.9%）、β-bisabolenal（14% ～70.7%）、β-bisabolenol（8.4%）和1個桉烷型倍半萜（16.1%）。進一步使用制備型毛細管氣相色譜，從該植物中分離純化了1個新的桉烷型倍半萜3，7(11)-eudesma-dien-2-one[86]。制 備 型 氣 相 色 譜也可用于天然異構體的分離。蜘蛛的前額嗅腺分泌物中主要含有4-hydroxy-5-octyl-4,5-dihydro-3Hfuran-2-one的2個異構體化合物，為確定其構型，Raspotnig等[87]通過化學結構修飾獲得了4-hydroxy-5-octyl-4,5-dihydro-3H-furan-2-one的4個異構體衍生物，并通過手性氣相色譜分離純化，通過比對，發(fā)現分泌物中2個異構體的構型為(4S,5R)-100（含量90%）和(4S,5S)-100（含量10%）。目前，制備型氣相色譜也存在一些缺點，如缺乏商用設備、需消耗大量載氣、操作溫度高、餾分萃取困難和產量低等，因此其應用仍然受到限制。

2.5.4 超臨界流體色譜超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography）以超臨界流體作為流動相。超臨界流體具有高溶解力、高擴散性和低黏度的特性，因此兼具氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點，可實現快速、有效的分離。在超臨界流體色譜中廣泛使用的流動相（超臨界二氧化碳）的極性與正己烷接近，因此一般適用于非極性化合物的分離，如脂肪酸、萜類和揮發(fā)油。通過在流動相中添加極性改性劑（如甲醇和乙腈），可以拓展超臨界流體色譜在極性天然產物分離中的應用[88-90]。Zhang等[91]利用半制備超臨界流體色譜法，采用YMC-Pack NH2半制備柱（250 mm×10.0 mm，5 μm）分離，以超臨界二氧化碳-乙醇（97∶3）為流動相，從刺槐乙醇提取物中分離純化獲得了歐前胡素和蛇床子素。

2.5.5 分子印跡技術近十年來，分子印跡技術（molecular imprinted technology）因其高選擇性、低成本和易于制備的獨特性質，引起了越來越多天然產物研究領域學者的關注。其原理為當洗脫分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer）將內部的模板分子除去后，聚合物內部就留下許多與模板分子形狀、大小和官能團相互匹配的印跡空穴。因此，模板分子及其衍生物對于分子印跡聚合物具有特異性識別和選擇性吸附的作用。目前，分子印跡聚合物已廣泛應用于天然產物的分離或作為固相萃取吸附劑用于植物樣品的制備。Liu等[92]以咖啡酸為模板分子、丙烯酰胺為功能單體，從甘川鐵線蓮提取物中富集咖啡酸及其類似物（200 mg），結合高速逆流色譜法從中純化得到3個咖啡酸類似物，包括咖啡酸（26.30 mg）、香豆酸（84.20 mg）和阿魏酸（44.40 mg）。?zcan等[93]使用甲基丙烯酰胺基安替普林-鐵（Ⅲ）金屬螯合物制備橄欖苦苷的印跡聚合物，最后從1 g橄欖葉提取物中分離純化出24.2 mg的橄欖苦苷。該印跡聚合物具有可以選擇性吸附、吸附量大（可達140 mg · g-1）和可重復利用（至少10次）的優(yōu)點。Ma等[94]以苦參堿和氧化苦參堿為模板分子，制備了可特異性識別苦參堿型生物堿的雙模板分子印跡聚合物，開發(fā)了一種基于雙模板分子印跡固相萃取結合高效液相色譜和串聯質譜的方法，并從青藏高原產苦參中提取和純化得到了苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿。

2.5.6 模擬移動床色譜模擬移動床色譜（simulated moving bed）使用多根串聯的色譜柱作為固定相（床），通過旋轉閥門模擬固定相與流動相的逆流流動。模擬移動床色譜工作過程中，每隔一段固定的時間，4個外部的進出口（feed、extract、raffinate和desorbent）同時向流動相的流動方向切換一個位置，從而實現固定相與流動相的模擬逆流移動。模擬移動床色譜溶劑消耗量低、分離速度快，是一種適合于大規(guī)模天然產物連續(xù)分離的方法。近年來，已經開發(fā)出可用于精制階段的模擬移動床等新技術，以連續(xù)高純度地分離糖苷[95]。Wen等[96]開發(fā)了一種使用模擬移動床色譜法分離黑果腺肋花楸果中花青素的方法，將黑果腺肋花楸果提取物超聲溶解于含1%乙酸的25%乙醇溶液中，濃度為50 g · L-1，使用配備8根C18色譜柱（150×10 mm，30 μm）的模擬移動床色譜分離（4個區(qū)域的色譜柱配比為2/2/2/2），以含1%乙酸的25%乙醇為流動相洗脫，最終將花青素提純至85%。通過UPLC-QTOF-MS技術，確定花青素3-O-半乳糖苷和花青素3-O-阿拉伯糖苷為其主要成分。

2.5.7 多維色譜分離天然產物提取物中的成分相當復雜，通常通過一次柱色譜的分離很難獲得單一的化合物。多維色譜分離技術通過固相萃取技術和多根不同固定相色譜柱的聯用，大大提高了分離效率。目前，越來越多的多維分離設備已實現了商業(yè)化，天然產物分離正逐漸變得更加的快速、高效和自動化。有學者報道了一種利用增強全自動二維液相色譜技術，從大豆粉中分離親水性蛋白質的方法。通過使用2個多端口切換閥將第一維色譜柱與第二維色譜柱實現在線連接，第一維色譜柱為尺寸排阻色譜柱MabPac SEC-1（150×4.6 mm）+Security Guard Cartridge（GFC-2000，4×3.0 mm），連 接在左側泵上；第二維色譜柱為Aeris wide-pore XBC18 column（150×4.6 mm）+security guard column（ULTRA Cartridges UHPLC WIDEPORE C18），連接在右側泵上。左側10通切換閥上連接有一根C4色譜柱（50×4.6 mm），用于捕集第一維色譜的分離餾分。整個工作流程中包含1個捕集器清洗脫鹽步驟，從第一根色譜柱的洗脫液中去除緩沖液殘留物，并提高第二根色譜柱的色譜性能，從而克服了第一維和第二維色譜的溶劑、洗脫液成分和pH值不相容的問題[97]。還有學者報道了一種使用高效薄層色譜聯合高效液相色譜-二極管陣列檢測-高分辨質 譜（HPTLC-UV/Vis/FLD-HPLC-DAD-ESI-MS）技術，共同分離和表征檸檬香蜂草中一對三萜異構體熊果酸和齊墩果酸的方法[98]。

3 結語與展望

天然產物提取分離技術研究，對于發(fā)現新的天然化合物，以及新藥研發(fā)、農藥、食品、有機化學、生物學和藥理學的發(fā)展均有很大的促進作用。天然產物提取技術種類繁多，各有特點，而現代提取技術由于具有溶劑消耗少、提取時間短、提取效率高等特點，已經引起越來越多的關注。然而，設備投資大等缺點，使得其主要用于質量控制領域，目前以分離為目的的提取方法依然以傳統(tǒng)方法為主，如回流法等。近年來，隨著大量新型分離材料的不斷涌現，越來越多的新骨架天然產物被發(fā)現。但由于提取物中化學成分復雜、單體成分含量低以及天然產物分離過程耗時長、效率低等問題，天然產物的分離仍是限制天然產物實現高通量活性篩選的瓶頸問題。因此，新分離技術、新分離材料（如新型手性分離材料）的開發(fā)以及多種分離技術的聯用和自動化分離技術的運用，將為提升天然產物的分離效率提供極大的幫助。