王月敏，柯玉琴，謝榕榕，李春英，李文卿

（1福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350013；2福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；3福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/國際鎂營養(yǎng)研究所，福州 350002）

0 引言

煙株生長過程中需要氮磷鉀等大量元素，而中微量元素對于煙株生長發(fā)育與煙葉產(chǎn)質(zhì)量的形成也至關(guān)重要[1-3]。中微量元素直接或間接參與植物體內(nèi)生理生化過程，多種中微量元素還是植株氧化還原反應(yīng)及呼吸作用關(guān)鍵酶的組成部分和載體[4]。近些年來，隨著作物品種的改良和產(chǎn)量的提高，土壤中中微量元素隨著作物生長及收獲逐漸流失[5]。在煙葉生產(chǎn)過程中，煙農(nóng)為追求產(chǎn)量，施用肥料時(shí)主要使用氮磷鉀等大量元素，往往忽略中微量元素的補(bǔ)充，土壤中缺乏中微量元素，導(dǎo)致煙葉品質(zhì)下降[3,6]。鎂、鐵、鋅、鉬、錳作為煙株生長發(fā)育所需的中微量元素，不僅參與生物大分子的合成，增強(qiáng)酶活性，在促進(jìn)煙株生長、增強(qiáng)抗逆性、提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量與可適用性等方面也起著重要作用[7-9]。

煙株生長中后期需要大量養(yǎng)分，不合理的施肥方式及土壤中養(yǎng)分的不平衡影響煙株的生長發(fā)育，導(dǎo)致煙葉產(chǎn)質(zhì)量的下降，通過土壤增施或葉面噴施微肥的方式可以增加作物對肥料的吸收，促進(jìn)作物體內(nèi)養(yǎng)分供應(yīng)均衡，提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)[10]。然而土壤環(huán)境復(fù)雜，土壤增施的肥料利用率低，葉面噴施微肥則能有針對性地補(bǔ)充作物營養(yǎng)、調(diào)節(jié)作物營養(yǎng)狀況、促進(jìn)葉片生長、提高烤煙的產(chǎn)質(zhì)量，具有用量少、吸收快、效率高的優(yōu)點(diǎn)，能有效減少化肥對土壤的污染，延緩?fù)寥劳嘶俾蔥11-12]。

烤煙生產(chǎn)中，由于有機(jī)肥的施用相對較少，一些地方存在長期不施有機(jī)肥的現(xiàn)象，導(dǎo)致土壤出現(xiàn)較明顯的沙化，土壤保水保肥能力下降。土壤沙化導(dǎo)致養(yǎng)分流失，煙株生長受到影響。福建烤煙生長后期常遇高溫強(qiáng)光天氣，煙株?duì)I養(yǎng)不平衡可能影響烤煙生長后期煙葉正常成熟采收。筆者探究10年定位施用純化肥煙田煙株打頂后噴施中微量元素對煙葉內(nèi)在生理活動(dòng)的影響，通過測定葉綠素、光合作用、熒光特性、NR活性、細(xì)胞膜透性、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、MDA活性等生理代謝指標(biāo)，對葉面噴施微肥效果進(jìn)行評價(jià)，以期為促進(jìn)煙葉正常成熟、提高煙葉適烤性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018年在福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所宦溪科研基地連續(xù)10年純化肥定位施肥的煙田進(jìn)行。試驗(yàn)田于2009年開始進(jìn)行純化肥定位施肥，施肥前耕層土壤有機(jī)質(zhì)為28.96 g/kg，堿解氮144.66 mg/kg，速效磷5.85 mg/kg，速效鉀142.43 mg/kg，pH 5.76。試驗(yàn)田采用煙-稻輪作方式，2017年水稻收割后測定土壤有機(jī)質(zhì)為22.86 g/kg，堿解氮174.67 mg/kg，速效磷21.80 mg/kg，速效鉀131.71 mg/kg，pH 4.58。煙田煙株打頂后10天進(jìn)行噴施不同中微量元素的噴施處理，10天以后再次噴施。共設(shè)6個(gè)處理。T1噴施濃度為0.5%的硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，T2噴施濃度為0.5%的硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)，T3噴施濃度為0.2%的硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)，T4噴施濃度為0.1%的鉬酸(HMoO3)，T5噴施營養(yǎng)液濃度為0.1%的硫酸錳(MnSO4·5H2O)，T6對照(CK)不噴施任何中微量元素，在其他處理噴微量元素時(shí)，T6處理噴清水。

每處理參試煙株20株，參照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)方案田間管理。煙稻輪作，每年水稻收割后將稻草清理出田。施氮量為97.5 kg/hm2，N:P2O5:K2O=1:0.75:2.63，不施任何有機(jī)肥。肥料種類為煙草專用肥(N:P2O5:K2O=12:8:22)、鈣鎂磷、硝酸鉀和硫酸鉀。

1.2 測定項(xiàng)目

在第一次噴施微肥后30天（6月12日測定），煙株表現(xiàn)明顯差異時(shí)進(jìn)行生理指標(biāo)測定。取煙株倒2～倒3葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室剪碎混勻后用于測定各生理指標(biāo)。葉綠體色素含量、NR活性采用李合生[13]的方法測定；膜相對透性及傷害率、SOD活性、MDA含量參照鄒琦[14]的方法測定；CAT活性采用高俊鳳[15]的方法測定；POD活性采用張志良等[16]的方法測定，以每分鐘OD變化值表示酶活性大小，即以ΔOD470/(min·mg蛋白質(zhì))表示。

選擇煙株倒2葉用于測定光合作用和熒光特性參數(shù)。光合作用參數(shù)用英國CIRAS-2便攜式光合儀(PPSystem)測定，溫度為(28±2)℃，光強(qiáng)為1000 μmol/(m2·s)，CO2濃度為380 μmol/mol。熒光參數(shù)采用Hansatech公司生產(chǎn)的Pocket PEA便攜式葉綠素?zé)晒庥?jì)測定，暗適應(yīng)時(shí)間為30 min。

采用相對透性表示細(xì)胞膜受傷害的程度，傷害率是顯示處理過的材料與未處理過（對照）的材料之間的傷害程度，由式(1)～(3)計(jì)算得出。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計(jì)作圖等由Excel 2010完成，方差分析和多重比較由DPS 7.05完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉形態(tài)及光合色素的影響

由表1可見，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂、0.5%硫酸亞鐵不同中微量元素后，葉片葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和葉綠素總量(Chl)均有較明顯上升，但除噴施0.2%硫酸鋅達(dá)到極顯著水平外，其他處理沒有達(dá)到顯著差異。說明各種中微量元素的補(bǔ)充對緩解烤煙生長后期煙株葉片色素的降解具有較好的作用。

表1 烤煙生長后期噴灑微量元素對煙葉綠體色素的影響 mg/(g·FW)

2.2 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉光合參數(shù)的影響

由表2可見，噴施5種中微量元素后，葉片光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)明顯提高，其中噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂、0.5%硫酸亞鐵后，Pn分別提高了3.56、3.08、3.27、3.35、2.20倍，Tr分別提高了2.34、1.71、2.30、2.61、1.77倍，Gs分別提高了2.10、1.61、2.02、2.09、1.49倍。胞間CO2濃度(Ci)明顯降低，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂、0.5%硫酸亞鐵后，Ci分別下降了30.74%、36.19%、32.31%、26.82%、23.56%。說明對照處理在后期生長中光合結(jié)構(gòu)受到較嚴(yán)重破壞，再加上氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致Ci上升，噴施中微量元素很好地緩解了破壞程度。

表2 烤煙生長后期噴灑微量元素對煙葉光合參數(shù)的影響

2.3 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表3可見，噴施中微量元素后，煙株葉片F(xiàn)o和Fo/Fm顯著下降，F(xiàn)m、Fv、Fv/Fm和Fv/Fo顯著上升。其中，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂、0.5%硫酸亞鐵后，F(xiàn)o分別下降了26.94%、23.74%、21.05%、20.38%、17.14%；Fo/Fm分別下降了46.69%、36.24%、37.80%、35.02%、39.55%；Fm分別提高了26.73%、19.75%、16.89%、18.70%、20.86%，F(xiàn)v分別提高了0.98、0.82、0.69、0.50、0.34倍，F(xiàn)v/Fm分別提高了62.91%、37.32%、50.94%、47.18%、44.60%，F(xiàn)v/Fo分別提高了1.67、0.99、1.09、1.05、1.58倍。說明噴施中微量元素后，PSⅡ反應(yīng)中心活性增強(qiáng)，過剩光能減少，參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射和原初光能轉(zhuǎn)化效率提高。

表3 烤煙生長后期噴灑微量元素對煙葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉NR活性的影響

從圖1可見，除噴施硫酸鎂外，噴施不同中微量元素后，葉片NR活性均有顯著提高，特別是噴施0.2%的硫酸鋅和0.1%的鉬酸處理提高更為顯著。說明在烤煙生長后期，噴施一定的中微量元素很好地維持了葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，葉片氮的代謝維持在較高的水平，有利于煙葉正常成熟，增強(qiáng)煙株抗逆性，減少因高溫強(qiáng)光傷害導(dǎo)致假熟現(xiàn)象的發(fā)生，有利于煙葉正常成熟，對煙葉烘烤特性的提高具有較顯著的作用。

圖1 不同處理對煙株葉片NR活性的影響

2.5 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉細(xì)胞膜透性的影響

從圖2可見，對照處理細(xì)胞膜相對透性為14.74%，噴施中微量元素后，煙株葉片細(xì)胞膜相對透性下降，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂、0.5%硫酸亞鐵后，細(xì)胞膜相對透性分別下降了17.50%、14.45%、14.12%、7.54%和15.26%。相應(yīng)地，噴施中微肥處理的細(xì)胞膜傷害率顯著下降。說明噴施中微量元素對保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性具有較顯著的作用。

圖2 不同處理對煙株葉片細(xì)胞膜相對透性及傷害率的影響

2.6 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉抗氧化酶活性的影響

從圖3可見，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸和0.1%硫酸錳后煙株葉片CAT酶活性，以及噴施0.2%硫酸鋅和0.1%鉬酸后葉片SOD活性，均顯著上升，其他處理酶活性也明顯上升，但沒有達(dá)到顯著水平。說明烤煙生長后期煙株葉片CAT和SOD酶活性均能保持較高的活性，對清理自由基保持較強(qiáng)能力，可很好緩解煙株受到的高溫強(qiáng)光傷害。

圖3 不同處理對煙株葉片SOD和CAT活性的影響

從圖4可見，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸和0.5%硫酸亞鐵后，煙株葉片POD酶活性顯著上升，而噴施0.1%硫酸錳和0.5%硫酸鎂后葉片POD酶活性顯著下降。說明不同的中微量元素對煙株葉片POD活性的影響不一致，鋅、鉬和鐵表現(xiàn)為促進(jìn)，而錳和鎂表現(xiàn)為抑制。

圖4 不同處理對煙株葉片POD活性的影響

2.7 烤煙生長后期噴灑中微量元素對煙葉MDA含量的影響

從圖5可見，對照處理的MDA含量為25.19 μmol/(g·FW)，噴施0.2%硫酸鋅、0.1%鉬酸、0.1%硫酸錳、0.5%硫酸鎂后，葉片中MDA含量顯著下降，分別下降27.29%、19.90%、13.65%和12.38%；噴施0.5%硫酸亞鐵后，葉片MDA含量比對照下降4.30%，但差異不顯著。說明噴施中微量元素很好地保護(hù)了葉片免受自由基的傷害，傷害產(chǎn)物明顯減少。

圖5 不同處理對煙株葉片MDA含量的影響

3 結(jié)論

與對照（葉面噴施清水）相比，葉面噴施不同中微量元素后，Chla、Chlb和Chl均有較明顯上升，光合色素降解減緩，葉片Pn、Tr和Gs明顯提高，F(xiàn)o和Fo/Fm顯著下降，F(xiàn)m、Fv、Fv/Fm和Fv/Fo顯著上升，表明中微量元素的補(bǔ)充有利于維持煙株葉片光合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高光能轉(zhuǎn)化效率；NR活性顯著提升，有利于維持煙株生長后期較高氮代謝，促進(jìn)煙葉正常成熟；細(xì)胞膜相對透性顯著降低，表明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高；CAT和SOD酶均能保持較高的活性，而MDA含量顯著下降，說明中微量元素的補(bǔ)充可很好減緩活性氧傷害，減輕膜脂過氧化程度，緩解煙株葉片的傷害與衰老，提高上部煙葉的適烤性。

4 討論

光合作用是植物吸收光能、合成有機(jī)物的重要過程，是煙草品質(zhì)和產(chǎn)量形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18]。中微量元素參與調(diào)節(jié)植物光合產(chǎn)物合成、代謝和運(yùn)輸，對植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)質(zhì)量具有重要影響[4]。施用微肥可以調(diào)控相關(guān)酶的活性，調(diào)節(jié)葉綠體色素的合成，進(jìn)而改變?nèi)~片光合速率[9]?？緹熒L期間的高溫強(qiáng)光天氣常導(dǎo)致煙葉高溫逼熟。其中一個(gè)原因可能是強(qiáng)光導(dǎo)致葉片吸收光能過剩，葉片產(chǎn)生大量自由基，最終傷害葉片膜系統(tǒng)，煙葉采收后進(jìn)入烘烤階段，葉片內(nèi)部還要發(fā)生大量的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，膜系統(tǒng)的破壞必然影響煙葉烘烤特性。而鎂和鋅等中微量元素可以很大程度上緩解強(qiáng)光傷害[19-20]。本研究中，噴施不同中微量元素后，Chla、Chlb、Chl、Pn、Tr和Gs均明顯提高，說明與對照相比，各種微量元素的補(bǔ)充有利于緩解色素降解和煙葉衰老，提高煙株光合作用效率，增強(qiáng)葉肉細(xì)胞的光合活性，這與汪丹丹[21]、鄭璞凡[9]、姜麗麗[22]、張舒玄[23]等的研究一致。光合色素的變化直接或間接影響葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。葉綠素?zé)晒庵饕獊碓从诠庀到y(tǒng)PSⅡ的葉綠素a，植株P(guān)SⅡ在脅迫條件下活性減弱，能量捕獲和傳遞受到抑制，光化學(xué)效率降低，葉綠素?zé)晒鈪?shù)可用于評價(jià)光合系統(tǒng)功能和逆境下環(huán)境脅迫的影響[24-27]。噴施不同微量元素后Fo減少，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo極顯著提高，表明光合有效輻射減少，原始光能轉(zhuǎn)化效率和光合捕獲效率提高。張衡鋒等[28]研究表明，葉面噴施不同微肥對藏紅花葉片光合色素含量、光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)均有一定影響，適宜濃度下有利于提高葉片光合效率。

NR是氮代謝的關(guān)鍵酶，其活性大小反映植物的營養(yǎng)狀況和氮代謝能力[29]。除噴施硫酸鎂外，噴施不同微量元素后，葉片NR活性均有顯著提高，煙葉氮代謝能力增強(qiáng)。這與劉領(lǐng)等[30]噴施微肥能在烤煙成熟期提高上部葉NR活性的結(jié)論一致。

細(xì)胞膜是防止胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的屏障，對于維持細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義，細(xì)胞膜透性是反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要參數(shù)，細(xì)胞膜透性增加時(shí)，電解質(zhì)外滲增加，影響細(xì)胞正常生理代謝[31]。噴施中微量元素后，細(xì)胞膜透性和傷害率極顯著降低，說明噴施中微量元素有利于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，降低電解質(zhì)外滲量，緩解細(xì)胞膜脂過氧化作用，維持煙株代謝平衡。

植物細(xì)胞在外界脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生活性氧簇，為抵御活性氧危害，植物自身會(huì)產(chǎn)生SOD、POD、CAT等保護(hù)酶防御外界脅迫，其活性升高可以延緩植物細(xì)胞衰老，延長生育期[22]。SOD可將超氧自由基氧化為H2O2，CAT和POD進(jìn)一步將H2O2分解為H2O和O2，從而維持植物細(xì)胞活性氧代謝平衡。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，其含量標(biāo)志著膜受逆境脅迫大小及膜脂過氧化程度[32-33]。噴施不同中微量元素后，SOD、CAT酶活性明顯上升，說明中微量元素的補(bǔ)充有利于消除活性氧影響，提高植株抗衰老能力；MDA含量顯著降低說明中微量元素的補(bǔ)充有利于緩解膜脂過氧化，提高煙株抗逆性。不同的微量元素對煙株葉片POD活性的影響不一致，鋅、鉬和鐵表現(xiàn)為促進(jìn)，而錳和鎂表現(xiàn)為抑制，表明合理施用不同中微肥有利于提高煙株抗氧化能力。目前，噴施微肥對烤煙內(nèi)在活性氧代謝的研究較少，主要研究方向?yàn)楣狻?、干旱等因素脅迫下或脅迫條件下施用外源調(diào)節(jié)劑對煙株體內(nèi)活性氧代謝的影響[34-38]。

本試驗(yàn)主要研究5種中微量元素單一濃度對烤煙葉片生理代謝的影響，對于其他微量元素、不同施用濃度及不同微量元素配施條件下對烤煙生長代謝的影響還有待后續(xù)研究。