梁 園, 付敬強, 沈銘輝, 駱 軒, 游偉偉, 柯才煥

方斑東風螺3個選育世代遺傳多樣性和遺傳結構的微衛(wèi)星分析

梁 園1, 3, 付敬強2, 3, 沈銘輝4, 駱 軒1, 3, 游偉偉1, 3, 柯才煥1, 3

(1. 廈門大學 海洋與地球?qū)W院, 福建 廈門 361102; 2. 廈門大學 環(huán)境與生態(tài)學院, 福建 廈門 361102; 3. 廈門大學 福建省海洋經(jīng)濟生物遺傳育種重點實驗室, 福建 廈門 361102; 4. 海南省海洋與漁業(yè)科學院 海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術重點實驗室, 海南 ?？?571126)

采用12個多態(tài)性微衛(wèi)星標記對方斑東風螺()泰國選育系TF4～TF6連續(xù)3代選育群體的遺傳多樣性與遺傳結構進行了分析。3個群體的多態(tài)信息含量分別為0.730、0.717和0.708, 均高于0.5, 表現(xiàn)出較高的多態(tài)性。平均等位基因數(shù)()、有效等位基因數(shù)(e)、觀測雜合度(o)、期望雜合度(e)和Shannon’s信息指數(shù)()的變化范圍分別為11.667～12.583、6.334～6.915、0.658～0.672、0.737～ 0.787和1.837～2.003, 整體呈降低趨勢, 但差異并不顯著(>0.05)。分子方差分析結果顯示, 群體間的遺傳變異僅占總變異的0.95%; 群體間的遺傳分化系數(shù)(st)介于0.00569～0.01324, 處于低等分化水平(st0.05)。主坐標分析和STRUCTURE分析結果顯示, 3個群體呈現(xiàn)出相似的遺傳背景和遺傳結構。以上研究結果表明, 經(jīng)過連續(xù)多代的人工選育, 方斑東風螺選育群體保持著較高的遺傳多樣性水平, 遺傳變異和遺傳分化水平較低, 遺傳結構趨于穩(wěn)定, 仍具有較高的遺傳選育潛力。

方斑東風螺(); 選育群體; 微衛(wèi)星標記; 遺傳多樣性; 遺傳結構

方斑東風螺()俗稱花螺, 是生活于熱帶、亞熱帶海域的腐肉食性淺海底棲腹足類動物[1], 在中國主要分布于海南、廣東、廣西、福建和臺灣等東南沿海地區(qū)[2, 3]。方斑東風螺不僅生長速度快, 肉質(zhì)鮮美, 氨基酸含量高, 還富含人體所需的EPA和DHA[1], 深受消費者的喜愛。目前, 方斑東風螺已成為中國重要的經(jīng)濟貝類養(yǎng)殖品種[4, 5]。隨著其養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 養(yǎng)殖過程中個體大小差異大, 生長速度減緩, 抗逆性差以及病害頻發(fā)等問題日益突出[4, 6], 因此, 培育出生長速度快、抗逆性強的方斑東風螺優(yōu)良養(yǎng)殖品種具有十分重要的意義。

選擇育種作為一種傳統(tǒng)的育種方法, 能夠有效改善育種目標性狀[7]。在人工選育過程中, 部分不利基因被淘汰, 與目標性狀相關的基因逐漸趨向于純合, 選育群體的遺傳結構逐漸趨向于穩(wěn)定, 遺傳基礎會逐漸得到純化[8-10]。但與此同時, 選育可能導致群體遺傳多樣性水平出現(xiàn)不同程度的下降, 而較低的遺傳多樣性則不利于物種的生存和適應[11-13]。為了對方斑東風螺進行遺傳改良, 從2011年開始, 本實驗室對其開展了生長性狀相關的群體選擇育種研究。此前, FU等[14]對該選育系TF0-TF33代選育群體進行了遺傳多樣性分析, 結果表明, 經(jīng)過連續(xù)3代的人工選育, 選育群體的遺傳多樣性水平略有下降, 但差異不顯著。但是, 再次經(jīng)過連續(xù)3代的選育, 該選育系各世代群體的遺傳多樣性水平變化如何, 目前并不清楚。

微衛(wèi)星標記具有種類多、分布廣、多態(tài)信息含量高、操作簡單等優(yōu)點[15], 已被廣泛應用于大黃魚()[8]、刺參()[16]、太平洋牡蠣()[17]、文蛤()[18]、海灣扇貝()[19]、馬氏珠母貝()[20]等水產(chǎn)動物的遺傳多樣性分析。為了解人工選育對方斑東風螺泰國選育群體TF4～TF6分子遺傳水平上產(chǎn)生的影響, 本研究采用12個微衛(wèi)星標記對這3代選育群體的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析, 以期為進一步的良種選育和遺傳改良提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從2011年開始, 本實驗室針對生長性狀開展了連續(xù)6代的群體選擇育種研究。本研究所用到的選育群體(TF4、TF5、TF6)是2017—2020年連續(xù)3代從生長快的個體中截留親本選育而成, 選擇強度為10%, 具體方法見FU[14]的報道。從每代選育群體中隨機選取30個6月齡的樣品, 取適量腹足肌于無水乙醇中脫水保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗內(nèi)容與方法

1.2.1 基因組DNA的提取

使用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取方斑東風螺的基因組DNA。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性, 使用NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測DNA的濃度與純度, 于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星引物的篩選

從已報道的文獻[14, 21-23]中篩選出12對多態(tài)性較好的微衛(wèi)星引物用以遺傳多樣性分析。利用FAM、HEX和ROX 3種不同顏色的熒光在上游引物的5’端進行標記, 熒光引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物的詳細信息見表1。

1.2.3 PCR擴增與檢測

PCR反應體系體積為25 μL, 包括: 10×PCR Buffer (含Mg2+)5.0 μL、dNTPs (10 mmol/L) 2.0 μL、上游引物(10 mmol/L) 1.0 μL、下游引物(10 mmol/L) 1.0 μL、rTaq DNA Polymerase (5 U/μL) 0.25 μL、模板DNA 2.0 μL和ddH2O 13.75 μL。

表1 12對微衛(wèi)星引物信息表

F. forward primer, 上游引物; R. reverse primer, 下游引物; N. pure, 連續(xù)的微衛(wèi)星序列; n. interrupted, 有間隔的微衛(wèi)星序列

PCR反應程序為: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 退火溫度30 s(引物退火溫度見表1), 72 ℃ 1 min, 30個循環(huán); 72 ℃ 10 min; 4 ℃保溫。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 將其置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否擴增出目的片段。將PCR擴增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司, 使用ABI 3500xl基因分析儀進行毛細管電泳, 檢測熒光信號; 使用軟件GeneMapper ID v3.2分析微衛(wèi)星位點的片段長度[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

使用GenAlEx v6.5[24]計算等位基因數(shù)(number of alleles,)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,e)、觀測雜合度(observed heterozygosity,o)、期望雜合度(expected heterozygosity,e)、Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index,)和固定系數(shù)(fixation index,)。使用PIC-CALC 0.6軟件計算多態(tài)信息含量(polymorphism information content,)。使用NeEsti-mator v2.0.1[25], 采用連鎖不平衡方法(linkage disequi-li-brium method)[26]和卡方檢驗估算有效群體大小(effect-tive population size,e), 最低等位基因頻率取0.01。

使用Arlequin v3.5[27]進行分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA), 計算群體間遺傳分化指數(shù)(st)。使用GenAlEx 6.5軟件[24]進行主坐標分析(principal coordinates analysis, PCoA)。使用STRUCTURE v2.3.4[28]分析群體遺傳結構, 采用混合模型(admixture model), 設定群體間等位基因頻率相關; 設置值為1到3, 每個值重復估算10次; 設定運行參數(shù)MCMC的不作數(shù)迭代(lenth of Burnin period)為100 000次, 迭代后的MCMC (number of MCMC reps after Burnin)為500 000次。使用CLUMPP 1.1.2[29]進行重復抽樣分析, 并使用Distruct 1.1[30]將其結果轉(zhuǎn)化為圖形。

2 結果

2.1 遺傳多樣性

12對微衛(wèi)星引物在連續(xù)3代選育群體(TF4、TF5和TF6)中共擴增獲得188個等位基因, 每個群體檢測到的總等位基因數(shù)分別為146、151和140, 每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)介于4～34。3個群體的遺傳多樣性參數(shù)如表2所示, 多態(tài)信息含量()分別為0.730、0.717和0.708, 均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性(>0.5)[31]。另外, 等位基因數(shù)()、有效等位基因數(shù)(e)、觀測雜合度(o)、期望雜合度(e)和Shannon’s信息指數(shù)()的范圍分別為11.667±2.061～12.583±1.869、6.334±1.366～6.915±1.274、0.658±0.072～0.672±0.059、0.737±0.058～0.787±0.039和1.837±0.224～2.003±0.187。3個群體的平均觀測雜合度(o)均低于對應的平均期望雜合度(e), 且平均固定系數(shù)()均大于0(表2), 表明存在雜合子缺失的情況?？偟膩碚f, 經(jīng)過連續(xù)3代的選育, 各遺傳多樣性參數(shù)的大小整體呈降低趨勢, 但世代間的差異并不顯著(>0.05)。

表2 方斑東風螺3個群體的遺傳多樣性參數(shù)

注: a.同一字母表示群體間差異不顯著(>0.05)

此外, 獲得3個群體的有效群體大小(e)如表3所示, TF4～TF6依次為無窮大、223.0和628.9。

2.2 遺傳分化與變異

利用分子方差分析(AMOVA)和遺傳分化系數(shù)(st)對3個群體間的遺傳變異與遺傳分化進行分析。AMOVA結果見表4, 絕大部分變異來源于各群體內(nèi)部(99.05%), 群體間的變異僅占總變異的0.95%。群體間的遺傳分化系數(shù)(st)介于0.005 69～ 0.013 24(表5), 其中TF4與TF5的遺傳分化水平最高(st=0.013 24), TF5與TF6的遺傳分化水平最低(st=0.005 69)且差異不顯著。根據(jù)White對遺傳分化系數(shù)的界定[32], 3個群體的遺傳分化均處于低等水平(st0.05)。

2.3 遺傳結構變化

利用主坐標分析(PCoA)比較3個群體的遺傳聚類(圖1)。所有個體重疊交錯分布, 群體間未表現(xiàn)出明顯的分離現(xiàn)象。STRUCTURE分析結果(圖2)顯示,=2或=3時, 3個群體均表現(xiàn)出相似的遺傳背景。遺傳分化和遺傳結構的分析結果保持一致, 即3個群體間的遺傳差異較小, 遺傳結構趨于穩(wěn)定。

表3 方斑東風螺3個群體的有效群體大小(Ne)

表4 方斑東風螺3個群體的分子方差分析(AMOVA)

ST= 0.00953;<0.01

表5 方斑東風螺3個群體的遺傳分化系數(shù)(Fst)

**.<0.01; ns.>0.05

圖1 方斑東風螺3個群體的主坐標分析(PCoA)

圖2 方斑東風螺3個群體的STRUCTURE分析

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的核心[33], 一般來說, 種群的遺傳多樣性越高, 其適應環(huán)境的能力越強, 相應的選育潛力也越大[34]。在針對生長性狀的人工選育過程中, 目的性狀相關基因會不斷趨于純合[35-37], 同時部分與適應性和抗逆性相關的等位基因很容易丟失, 選育群體的遺傳多樣性可能會有所下降, 甚至發(fā)生近交衰退而失去繼續(xù)選育的價值[38]。選育群體的遺傳多樣性水平隨著選育世代的推進而不斷下降的現(xiàn)象在太平洋牡蠣[39]、馬氏珠母貝[40]、中國對蝦()[41]、羅氏沼蝦()[42]、尼羅羅非魚()[43-44]等水產(chǎn)動物中均有報道。此前FU等[14]對方斑東風螺海南和泰國兩個選育系(HT0～HT3, TH0～TH3)的遺傳多樣性水平進行了比較分析, 結果顯示選育群體存在微弱但不顯著的下降趨勢。因此, 有必要繼續(xù)對方斑東風螺人工選育過程中各世代群體遺傳多樣性的變化進行監(jiān)測。

有效等位基因數(shù)和期望雜合度等參數(shù)是衡量選育群體遺傳多樣性水平的重要指標[45]。本研究中, 由遺傳多樣性參數(shù)所揭示的3個群體的遺傳多樣性水平接近, 相比于TF4和TF5, TF6的遺傳多樣性水平略有下降, 但群體間的差異并不顯著(>0.05), 3個群體均保持著較高的遺傳多樣性水平。此前, FU等[14]利用10對微衛(wèi)星標記獲得了TF0～TF34個群體的遺傳多樣性參數(shù), 其中等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)的變化范圍分別為8.10±0.89～ 10.30±1.32、4.26±0.48～5.22±0.90和1.62±0.13～1.78±0.17;而本研究中TF4～TF6對應參數(shù)的變化范圍分別為11.667±2.06～12.583±1.869、6.334±1.366～6.915±1.274和1.837±0.224～2.003±0.187, 高于TF0～TF3。本研究使用了12對微衛(wèi)星標記, 與TF0～TF3相比有所增加, 微衛(wèi)星標記數(shù)量和多態(tài)性的不同有可能是TF4～TF6部分遺傳多樣性參數(shù)升高的原因[46-48]。此外, 在養(yǎng)殖或選育群體中, 相比于等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù), 短時間內(nèi)外界環(huán)境因素對雜合度的影響更小[39, 49]。NEI[50]認為, 在小群體中, 期望雜合度是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。本研究中, TF4～TF6的期望雜合度(0.737±0.058～0.787±0.039)未表現(xiàn)出明顯的下降趨勢, 并且與TF0～TF3的水平較一致(0.726±0.040～ 0.759±0.028)。由此可見, 再次經(jīng)過連續(xù)3代的人工選育, 方斑東風螺泰國選育群體仍保持著較高的遺傳多樣性水平, 具有一定的遺傳選育潛力。

有效群體大小往往是影響群體近交率和遺傳漂變率的重要參數(shù)[12]。在連續(xù)多代的人工選育過程中, 不合理的育種操作常常會引起選育群體有效群體數(shù)量下降而近交幾率上升[51]。為了解有效群體大小對遺傳多樣性變化的影響, LIND等[52]在珠母貝(.)的3個野生群體與5個人工培育群體中進行了比較分析, 發(fā)現(xiàn)兩種群體的有效群體大小變化范圍分別為109.6～432.4和3.5～9.2, 而等位基因豐富度的變化范圍分別為12.6±1.4～14.0±1.2和7.5±1.1～9.4±1.4, 人工培育群體的等位基因豐富度與野生群體相對比減少了29%～44%。另外, 在南非鮑()的選擇育種中, 當有效群體大小從F1的471.6減少到F2的52.5時, F2的等位基因大約減少了30%[53]。在FU等[14]的前期研究中, TF0～TF3的有效群體大小e從最初的436.0逐漸降至151.8, 且選育群體遺傳多樣性的降低并不顯著。而本研究中TF4～TF6的有效群體大小的變化為無窮大、223.0和628.9, 相對于TF3有所增加, 這可能是3個群體保持較高遺傳多樣性的原因之一。維持一定的有效群體數(shù)量能夠在一定程度上降低近交和遺傳多樣性損失所帶來的負面影響[49], 因此, 在后續(xù)的選育過程中仍需重視有效群體數(shù)量的管理。

眾多研究表明, 在選擇壓力的驅(qū)動下, 選育群體相鄰世代間的遺傳分化會逐漸減弱, 遺傳相似性逐漸升高, 遺傳結構與選育性狀會逐漸穩(wěn)定[8, 37, 38]。本研究中3個群體整體的遺傳變異(0.95%)和遺傳分化水平(ST= 0.00953)很低, TF5與TF6的遺傳分化水平(st: 0.00569,0.05)與TF0～TF3中相鄰世代(st: 0.0103～0.0308)相比明顯下降[14]。此外, PCoA分析和STRUCTURE分析的結果均顯示出3個群體在遺傳結構上的相似性。由此可知, 經(jīng)過連續(xù)多代的人工選育, 方斑東風螺選育群體的遺傳分化和遺傳變異水平逐漸降低, 遺傳結構逐漸趨于穩(wěn)定, 經(jīng)進一步選育可望獲得較穩(wěn)定的品系。

4 結論

本研究利用12對微衛(wèi)星標記對方斑東風螺3代選育群體(TF4～TF6)的遺傳多樣性與遺傳結構進行了分析比較。結果顯示, 方斑東風螺選育群體的遺傳多樣性水平較高且未表現(xiàn)出明顯的下降趨勢, 遺傳變異與遺傳分化水平較低, 遺傳結構趨于穩(wěn)定。連續(xù)多代的人工選育并未對其遺傳多樣性和遺傳結構造成不利影響, 該選育群體仍具有較高的遺傳選育潛力。在后續(xù)的選育進程中, 可繼續(xù)保持一定的選擇強度, 同時應注意增加有效親本的數(shù)量, 減少近交發(fā)生的幾率, 從而確保方斑東風螺優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳。

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Microsatellite analysis on genetic diversity and genetic structure of three successive selected generations of

LIANG Yuan1, 3, FU Jing-qiang2, 3, SHEN Ming-hui4, LUO Xuan1, 3, YOU Wei-wei1, 3, KE Cai-huan1, 3

(1. College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2. College of the Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 3. Fujian Key Laboratory of Genetics and Breeding of Marine Organisms, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 4. Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences, Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Maricultural Technologies, Haikou 571126, China)

We analyzed the genetic diversity and genetic structure among three successive selected generations (TF4–TF6) ofusing 12 polymorphic microsatellite markers. Polymorphism information content () was 0.730, 0.717, and 0.708, showing relatively high polymorphisms (>0.5). Additionally, number of alleles (), effective number of alleles (e), observed heterozygosity (o), expected heterozygosity (e), and Shannon’s information index () ranged from 11.667 to 12.583, 6.334 to 6.915, 0.658 to 0.672, 0.737 to 0.787, and 1.837 to 2.003, respectively, suggesting an overall decreasing but not significant trend (0.05). Furthermore, analysis of molecular variance (AMOVA) showed that genetic variation among generations only accounted for 0.95% of the total variation, whilestranged from 0.00569 to 0.01324, belonging to the low differentiation level (st0.05). Moreover, principal coordinates analysis (PCoA) and STRUCTURE analysis illustrated a similar genetic background and genetic structure among the three generations. These results suggested that the three generations maintained a high level of genetic diversity after consecutive generations of artificial breeding, with a low level of genetic variation and differentiation and a stable genetic structure. The results also indicated that a highly selective potential still existed in the breeding populations of..

; selective population; microsatellite marker; genetic diversity; genetic structure

Oct. 7, 2021

S917.4

A

1000-3096(2022)10-0085-09

10.11759/hykx20211007003

2021-10-07;

2022-01-13

海南省重點研發(fā)項目(ZDYF2022XDNY234); 福建省科技計劃項目高校產(chǎn)學合作項目(2020N5001); 國家自然科學基金資助項目(32202900); 海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術重點實驗室項目(TMTOF-202003)

[Hainan Province Science and Technology Special Fund, No. ZDYF2022XDNY234; Fujian Provincial S & T Project, No. 2020N5001; National Natural Science Foundation of China, No. 32202900; The Project of Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Maricultural Technologies, No. TMTOF-202003]

梁園(1998—), 女，滿族, 遼寧鳳城人, 碩士, 主要從事東風螺遺傳育種研究, E-mail: liangyuan@stu.xmu.edu.cn; 柯才煥(1962—),通信作者, E-mail: chke@xmu.edu.cn

(本文編輯: 譚雪靜)