郭正昌 綜述 周 波 審校

哺乳動物的干細胞具有自組織能力，在體外對干細胞進行培養(yǎng)可得到具有三維構象的培養(yǎng)物。近年來對干細胞生長微環(huán)境有了進一步認識，2009年Sato et al[1]通過在基質膠中培養(yǎng)富含亮氨酸重復序列G-蛋白偶聯受體5(LGR5)基因表達的腸道干細胞率先完成小腸類器官的體外構建。隨后視網膜、大腦、肝、腎等類器官相繼誕生。其基本原理是按照特定的時間添加干細胞生長所需的多種誘導因子，使具有分化潛能的細胞自發(fā)分化成相應的類器官。類器官可以在體外培養(yǎng)體系中廣泛擴增并且能夠長期保持生理及遺傳信息的穩(wěn)定[2-4]，類器官的組織可來源于患者，因此在作為臨床前模型方面有著獨到的優(yōu)勢。該文綜述了幾種體外培養(yǎng)體系成熟的類器官的研究現狀及其作為臨床前模型的應用。

1 成體干細胞構建類器官

成體干細胞位于分化成熟的組織器官之中，分離的成體干細胞在添加適當細胞因子的體外培養(yǎng)體系中可以誘導成相應的類器官。

1.1 小腸類器官Sato et al[1]在前人對腸道干細胞生長微環(huán)境研究的基礎上，分離腸道隱窩，在富含層黏連蛋白的基質膠中培養(yǎng)LGR5基因表達的腸道干細胞，待基質膠完全聚合后，加入干細胞增殖、分化所需的R脊椎蛋白1、表皮生長因子和頭蛋白等細胞因子。在這個體外培養(yǎng)系統(tǒng)中成功的培養(yǎng)出了具有隱窩-絨毛結構的小腸上皮即小腸類器官，經過驗證，該小腸類器官含有腸道上皮所有的細胞類型[1]。小腸類器官成熟后能以1 ∶5的比例進行傳代培養(yǎng)，并且能在體外培養(yǎng)體系中連續(xù)傳代培養(yǎng)超過1.5年，且在此過程中依然保持基因型及生理功能的穩(wěn)定[5]。

1.2 腎臟類器官腎的功能單位由腎小球和腎小管組成，其功能依賴于其復雜的組織結構。腎在發(fā)育過程需要中胚層的輸尿管芽與后腎間質之間的相互作用。Li et al[4]在適當的三維培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)誘導多能干細胞來源的腎單位祖細胞，實現了腎單位祖細胞在體外培養(yǎng)體系中的長期擴增，擴增的腎單位祖細胞依然能保持基因組的穩(wěn)定性、分子的均一性和發(fā)育成腎臟的潛能。培養(yǎng)的腎單位祖細胞可以形成腎臟類器官，植入新生小鼠及雞胚體內的腎臟類器官可以與循環(huán)系統(tǒng)建立聯系，形成異位腎樣結構，將腎類器官移植到免疫缺陷小鼠網膜中，可產生尿液樣濾液[4]。

1.3 生殖系統(tǒng)類器官在生殖系統(tǒng)中，利用非妊娠女性子宮內膜和蛻膜的樣本，建立了遺傳穩(wěn)定的子宮內膜類器官，這些類器官可以對性激素的作用產生轉錄反應，并在催乳素和胎盤激素刺激下再現了妊娠期子宮內膜特征性的早孕信號[6]，這為了解早期妊娠期間子宮內膜分泌和子宮內膜-胎盤之間的相互作用奠定了基礎。此外，男性生殖系統(tǒng)的類器官培養(yǎng)也取得了一些進展。Baert et al[7]發(fā)現人類初級睪丸細胞在新生小鼠睪丸類器官培養(yǎng)的條件下能夠自組織成人睪丸類器官，盡管缺乏睪丸特異性的形貌，但這些微小組織中存在精原細胞及其重要的細胞生態(tài)位，同時這些細胞在長期培養(yǎng)過程中仍保留著特定的功能，這表明體外再造人睪丸微環(huán)境是可能的。

2 多能干細胞類器官構建

多能干細胞包括誘導多能干細胞和胚胎干細胞，此兩種多能干細胞類型均可以自我更新并分化成所有的細胞類型 ，多能干細胞的這一特性為類器官的構建提供了理論支持。類器官的發(fā)展得益于人們對器官生長微環(huán)境的進一步認識，由于來源于多能干細胞的類器官是同質群體經過不同的階段定向分化形成的，因此在培養(yǎng)過程中需要動態(tài)調整其階段性的微環(huán)境。

在二維培養(yǎng)的條件中，多能干細胞在沒有任何誘導信號的情況下，會成為神經元，分化的神經上皮細胞可以自組織成神經前體細胞花環(huán)結構。在此研究基礎上，Eiraku et al[8]建立了神經外胚層類器官，這些類器官中的神經元表現出新生皮層腦組織的特性，并且類器官培養(yǎng)重現了早期皮質發(fā)生過程中的時空調控，通過這種方法產生的神經上皮細胞受到刺激后，表現出特定的腦區(qū)功能特性。研究[9]表明神經上皮細胞在基質膠中三維培養(yǎng)時，通過特定的細胞因子誘導，神經上皮細胞可自組織成由視網膜色素上皮和神經上皮組成的視杯。形態(tài)學、組織學和轉錄分析表明，這些大腦類器官包含了大腦相互依賴的各個部分[10]。單細胞RNA測序顯示大腦類器官中具有祖細胞和分化表型的神經細胞及間充質細胞。同時在類器官和胎兒組織之間發(fā)現了顯著的轉錄相似性，這為大腦類器官可作為人類皮質發(fā)育模型提供了依據[11]。

同樣，多能干細胞來源的肝類器官的構建已有報道。用單細胞RNA測序法在二維培養(yǎng)的多能性的基礎上重建了肝細胞譜系，之后在體外重建了肝臟、基質和內皮細胞之間的相互作用，解構了肝芽發(fā)育過程中的異質性，最終成功構建了肝芽類器官[12]。將肝芽類器官與胎兒和成人肝臟單細胞RNA序列數據進行對比，發(fā)現肝芽類器官與胎兒肝細胞之間存在顯著的對應關系[13]，這為闡明肝臟發(fā)生發(fā)展提供了更加直接的證據。

3 應用

3.1 疾病模型腸類器官可以高度還原腸上皮細胞的體內生理環(huán)境和組織結構特征，并且可以排除腸道其他因素對研究的干擾，使得單獨研究某種致病因素對腸道上皮的影響成為可能，因此在腸道感染性疾病研究中具有獨到的優(yōu)勢。腹瀉病現在仍然是世界上最大的健康問題之一，利用結腸、小腸類器官模擬腸道感染，既能研究宿主-病原體的相互作用，又能尋找治療靶點。輪狀病毒感染至今依然是威脅兒童健康的一大問題，每年導致超過45萬5歲以下兒童死亡[13]。人源性腸類器官易受輪狀病毒感染且對輪狀病毒感染較為敏感，受感染的腸類器官能夠產生感染性輪狀病毒顆粒，使用干擾素α或利巴韋林治療可抑制輪狀病毒在人及小鼠腸類器官中的復制。重要的是，人源性腸類器官能有效支持患者來源的輪狀病毒株的感染，并有可能用于抗病毒藥物療效的個性化評估[14]。二氫乳清酸脫氫酶(DHODH)是嘧啶從頭生物合成途徑中的限速酶。研究表明DHODH抑制劑——布雷奎納(BQR)和來氟米特(LFM)在常規(guī)人腸Caco2細胞系以及人腸類器官中強烈抑制輪狀病毒復制。BQR和LFM通過靶向DHODH消耗嘧啶核苷酸池發(fā)揮其抗輪狀病毒作用[15]。因此，靶向嘧啶的生物合成代表了開發(fā)針對輪狀病毒的抗病毒策略的潛在方法。此外，小腸類器官模型同樣已用來研究諾如病毒、星狀病毒[16]等腸道感染性疾病。

3.2 篩選抗癌藥物現已成功從結腸、肝臟、乳腺和胰腺的原發(fā)性腫瘤中培養(yǎng)出相應的腫瘤類器官。Vlachogiannis et al[17]從人源性的轉移性胃腸道腫瘤組織中培養(yǎng)出腫瘤類器官，并在體外再現了這些患者對抗腫瘤藥物的反應。研究證實人源性腫瘤類器官的表型和基因型與原發(fā)腫瘤有高度的相似性并且原發(fā)腫瘤細胞的特性可以在腫瘤類器官中保留，同時腫瘤類器官的分子分析與藥物篩選結果相匹配。在預測患者對靶向藥物或化療的反應方面有100%的敏感性、93%的特異性、88%的陽性預測值和100%的陰性預測值。人源性腫瘤類器官還可以用于腫瘤的功能基因組學研究，在體外模擬腫瘤行為，并將分子病理學應用到早期臨床試驗的決策過程中。人源性腫瘤類器官可以在體外再現患者對抗腫瘤藥物的反應，這些患者組織來源的腫瘤類器官作為臨床前模型，在篩選個體對抗腫瘤藥物的治療反應方面有很強的特異性，腫瘤類器官的構建有望實現抗腫瘤藥物使用的個性化。類器官模型同樣在腫瘤耐藥方面有著巨大的應用潛力，對于耐藥機制的研究及藥物篩選方面有著巨大的應用空間[2]。

3.3 藥物開發(fā)藥物開發(fā)是一個低效率、資源密集的過程，在大多數情況下新藥開發(fā)很難獲得成功。由于許多藥物在Ⅲ期試驗中失敗或上市后才發(fā)現嚴重副作用，因此開發(fā)新藥的平均成本往往超過10億美元，這使得研究人員在選擇最適合藥物開發(fā)的臨床前模型的過程變得尤為重要[18]。動物模型的可預測性有限導致了90%的藥物在人體試驗中失敗[19]。動物模型與人體的差異同樣可能使研究者錯過本有治療效果的藥物，因為在動物身上的副作用不一定轉化為人類。這些假陽性和假陰性的結果造成了巨大的財政負擔，從而導致在決策過程中，更注重藥物的潛在盈利能力而不是潛在的疾病治愈能力[20]。類器官在結構和功能上更接近人體，可以作為更準確的預測藥物毒性的模型，現已證明腎臟類器官能夠預測黑磷量子點[21]和順鉑[22]的腎毒性作用。此外，由于小腸上皮細胞含有大量的藥物代謝酶和外源加工蛋白，在藥物和外源物質的代謝、消化、營養(yǎng)吸收等過程中起著至關重要的作用，因此小腸類器官作為臨床前模型現已用于藥物開發(fā)[23]。神經元類器官作為神經疾病的研究模型在藥物開發(fā)方面也已取得一些進展，例如與Timothy綜合征突變相關的L型鈣通道的藥物調節(jié)劑，該藥可恢復皮層神經元的遷移[24]。此外，神經元類器官在與內皮細胞共培養(yǎng)的過程中再現了血腦屏障的特征，從而為篩選靶向中樞神經系統(tǒng)藥物提供了可能[25]。因此，類器官因其對人體器官結構和功能的高度還原，在測試藥物作用及副作用方面有著巨大的應用空間。

3.4 基因和細胞療法將結腸、肝臟、視網膜類器官分別移植到對應的受體器官中可觀察到移植的類器官與受體發(fā)生功能整合。將體外培養(yǎng)的結腸類器官移植到小鼠結腸上皮損傷部位，發(fā)現結腸類器官會很快與小鼠結腸受損部位發(fā)生整合，覆蓋上皮損傷部位，4周后供者來源的細胞形成單層上皮，形成功能和組織結構正常的上皮結構，并能維持上皮的更新[26]，這給腸道損傷修復提供了一個新的治療策略。人的胰腺類器官移植到免疫缺陷小鼠后能形成胰島素分泌細胞，利用胰腺類器官移植來降低血糖已在動物實驗得以證實[27]。現已有一些支持細胞療法可行性的證據，包括與自然組織的形態(tài)學相似性、建立與受體的聯系、上皮通透性和對疾病及損傷的修復的能力[28]。利用CRISPR/Cas 9基因組編輯技術，通過同源重組來糾正囊性纖維化患者腸干細胞中的囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子的突變，恢復了囊性纖維化患者結腸器官中囊性纖維化跨膜傳導調節(jié)因子蛋白的功能[29]。這些研究表明，在未來的細胞治療方法中，類器官可能是細胞的來源。然而，還需要更多的研究來評估這種方法的有效性和安全性。

4 展望

類器官在組織工程及再生醫(yī)學中擁有著廣泛的前景，可以為器官移植提供新的思路。但仍存在許多挑戰(zhàn)，如動物源性和化學成分未明的細胞外基質之間的可變性可能會影響高通量篩選。因此在將基礎研究成果轉化為臨床應用時，此類外源性物質的作用使得轉化過程也有存在問題的可能。為了解決這些問題，科學工作者正在開發(fā)能夠根據需要改變其生物物理和生物化學性質的合成基質。此外，在體外培養(yǎng)體系培養(yǎng)類器官時會缺乏一些重要的生理過程，包括血管化和神經支配，這可能會阻礙類器官的研究。另外，在類器官體外培養(yǎng)體系中對生物物理外環(huán)境的控制、模擬組織-組織間的聯系方面也存在挑戰(zhàn)。為更精確地模擬體內器官的內環(huán)境及器官之間的相互作用，研究人員開發(fā)了類器官芯片，利用微流控技術更好地模擬器官生存的體內環(huán)境及實現多器官的聯動[30]，但要真正實現對體內環(huán)境的精準模擬依舊任重道遠。雖然類器官技術的應用依然存在諸多挑戰(zhàn)，但其正以極其強勁的勢頭發(fā)展，隨著體外培養(yǎng)技術的逐日完善及各種組織類器官的構建，這必將為疾病機制的探究、個體化治療及藥物開發(fā)提供強有力的實驗模型。

綜上所述，類器官與二維培養(yǎng)的細胞相比更接近原位組織的生理功能，相比于動物實驗，類器官的操作更加簡單直觀，并且為那些在動物實驗中無法準確建模的實驗提供了一種替代方法。可以為器官發(fā)育、體內穩(wěn)態(tài)和發(fā)病機制提供更直接的認知，并可能為疾病的診斷和治療提供新的轉化途徑?；颊呓M織來源的類器官可作為臨床前模型，給臨床研究開辟新的轉化途徑。類器官技術是一項有著廣闊應用前景的新型技術，可能會給生物醫(yī)學研究提供新的視角，完善類器官技術需要多學科的合作，以實現對人體環(huán)境的精準模擬及調控。