秦文欣，王永晨

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚性病科，哈爾濱 150086)

黑色素瘤又稱黑素瘤，是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤[1-2]，可發(fā)生于黑色素細(xì)胞存在的部位，常見于皮膚，亦可見于皮膚黏膜，具有侵襲性強、惡性程度高、預(yù)后差、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、對放化療不敏感等特征[3-4]。近年來，黑色素瘤的發(fā)病率和病死率呈持續(xù)升高趨勢。2019年，美國確診新發(fā)黑色素瘤患者約96 480例，因黑色素瘤死亡約7 230例[5]。近年我國黑色素瘤患者也逐漸增多，黑色素瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的疾病之一[6]。研究表明，黑色素瘤的發(fā)生與黑色素細(xì)胞內(nèi)的多種基因突變密切相關(guān)，其中v-raf鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因突變率較高，一半以上的晚期黑色素瘤患者體內(nèi)存在BRAF基因第600位的突變[7]。我國皮膚黑色素瘤患者也存在BRAF基因突變，且主要以第600位的突變?yōu)橹鱗8]。針對突變BRAF基因的靶向藥物包括威羅菲尼及達(dá)拉菲尼，其用于黑色素瘤治療取得了顯著進(jìn)展，對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移且無法行手術(shù)治療的患者，基因靶向治療起效快，患者遠(yuǎn)期生存率高，但靶向藥物治療后，大多數(shù)患者很快產(chǎn)生耐藥[9-10]?，F(xiàn)就細(xì)胞自噬及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路對黑色素瘤可能產(chǎn)生耐藥性的分子機制進(jìn)行綜述，以期為黑色素瘤耐藥性的研究提供幫助。

1 黑色素瘤對基因靶向藥物產(chǎn)生耐藥

黑色素瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞癌基因BRAF的突變激活密切相關(guān)[11]。目前檢測到BRAF突變已逾30種，突變常發(fā)生在核酸序列第600位上，導(dǎo)致編碼的纈氨酸突變成谷氨酸，即BRAF V600E突變，占80%以上。BRAF基因?qū)儆赗AF家族，可編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶。此外，BRAF基因還負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，指導(dǎo)細(xì)胞正常的生長、增殖、分化和生存。BRAF基因突變可導(dǎo)致細(xì)胞的生長、增殖、分化和代謝的改變。因此，發(fā)生BRAF V600E突變黑色素瘤患者的治療反應(yīng)較差、生存率低。鑒于以上問題，針對 BRAF V600E突變靶位的靶向藥物相繼問世，如威羅菲尼和達(dá)拉菲尼已被批準(zhǔn)用于臨床黑色素瘤的治療[12]。這些靶向藥物的使用在黑色素瘤患者的治療中取得了重大突破。BRAF抑制劑可抑制促分裂原活化的蛋白激酶信號通路的異常激活，進(jìn)而抑制黑色素瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。在使用BRAF抑制劑治療的早期試驗中，靶向藥物可通過刺激適應(yīng)證患者的免疫能力，使黑色素瘤的瘤體迅速縮小。然而，大多數(shù)患者的療效持續(xù)時間較短，黑色素瘤細(xì)胞很快對靶向藥物產(chǎn)生耐藥，耐藥性的產(chǎn)生在很大程度上降低了黑色素瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，故黑色素瘤重新生長。因此，揭示BRAF抑制劑的耐藥性機制并解決BRAF抑制劑的耐藥問題，成為治療BRAF V600E突變黑色素瘤亟待解決的問題。

2 細(xì)胞自噬與黑色素瘤耐藥的相關(guān)性

近年來，細(xì)胞自噬在黑色素瘤的發(fā)病機制和治療中的作用受到廣泛關(guān)注，細(xì)胞自噬水平升高可能維持黑色素瘤細(xì)胞的活力并導(dǎo)致其耐藥性產(chǎn)生，而對細(xì)胞自噬的深入研究有助于更好地理解黑色素瘤的發(fā)病機制及耐藥的相關(guān)性。

2.1細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的生物代謝途徑，其進(jìn)化過程高度保守。細(xì)胞自噬通過溶酶體降解自身的細(xì)胞內(nèi)容物，屬于溶酶體降解途徑。機體通過細(xì)胞自噬對細(xì)胞內(nèi)廢棄或受損的生物大分子及細(xì)胞器進(jìn)行清除、降解以及回收利用，細(xì)胞自噬的存在有利于細(xì)胞內(nèi)成分的循環(huán)利用，對維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有重要作用[13-14]。細(xì)胞自噬可以“基礎(chǔ)性細(xì)胞自噬”和“誘導(dǎo)性細(xì)胞自噬”兩種不同形式被激活[15]。在生理條件下，“基礎(chǔ)性細(xì)胞自噬”作為細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制途徑發(fā)揮作用，有利于細(xì)胞質(zhì)成分的周轉(zhuǎn)；“誘導(dǎo)性細(xì)胞自噬”通常在一些不利條件下被激活，當(dāng)細(xì)胞的營養(yǎng)和生長因子被剝奪、病原體感染和能量消耗時，為滿足細(xì)胞應(yīng)激期間的營養(yǎng)需求，“誘導(dǎo)性細(xì)胞自噬”常被激活?！盎A(chǔ)”和“誘導(dǎo)”類型的細(xì)胞自噬對于維持細(xì)胞存活和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。在哺乳動物中，細(xì)胞自噬的發(fā)生途徑為伴侶介導(dǎo)的自噬、微自噬、巨自噬3種，其中巨自噬與黑色素瘤的關(guān)系更為密切，下文所述自噬均為巨自噬。

2.2細(xì)胞自噬在腫瘤形成過程中的不同作用 自噬在腫瘤中的作用高度復(fù)雜，且尚有爭議[16]。自噬在腫瘤形成過程中的作用具有兩面性，既可發(fā)揮促進(jìn)作用，又可發(fā)揮抑制作用[14]?！盎A(chǔ)性細(xì)胞自噬”對早期腫瘤細(xì)胞有抑制作用[17]。在早期腫瘤細(xì)胞內(nèi)，自噬通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的基因序列保護(hù)基因組免受傷害，從而減少腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生與發(fā)展。當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平過高時，自噬性細(xì)胞死亡以非依賴性細(xì)胞凋亡方式抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，且自噬不僅可為T細(xì)胞免疫反應(yīng)提供能量，還可影響抗原交叉呈遞，且自噬小體是腫瘤抗原的有效載體之一，有利于早期腫瘤細(xì)胞的清除?！罢T導(dǎo)性細(xì)胞自噬”對晚期腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)作用。在晚期腫瘤細(xì)胞內(nèi)，自噬可增強腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于乏氧、饑餓、感染、物理損傷等不良環(huán)境時，細(xì)胞內(nèi)自噬激活、耐受力增強，這有助于維持細(xì)胞穩(wěn)定[14]。當(dāng)手術(shù)、放療及化療時，“誘導(dǎo)性細(xì)胞自噬”通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自身休眠引發(fā)治療抵抗，這是腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原因之一[18]。綜上，在腫瘤發(fā)生早期階段，自噬可能有助于控制或殺死癌細(xì)胞，而對于已經(jīng)發(fā)展的晚期腫瘤細(xì)胞，抑制自噬可以阻斷其促進(jìn)腫瘤的作用。

2.3細(xì)胞自噬可增加黑色素瘤細(xì)胞的耐藥性 在惡性黑色素瘤細(xì)胞中，自噬的上調(diào)可能增加其耐藥性。研究報道，有些已經(jīng)癌變的細(xì)胞可以利用“誘導(dǎo)性細(xì)胞自噬”的保護(hù)作用避免因藥物和電離輻射等治療造成的傷害，使癌變細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，甚至導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[18]。在黑色素瘤小鼠模型中，自噬相關(guān)蛋白5的雜合缺失增強了黑色素瘤對BRAF抑制劑達(dá)拉菲尼的有效反應(yīng)[19]，因此自噬抑制劑被認(rèn)為是一種提高黑色素瘤細(xì)胞對治療敏感性的有效策略。在使用BRAF抑制劑單獨治療或聯(lián)合促分裂原活化的蛋白激酶激酶抑制劑治療的黑色素瘤患者中，有74%的患者自噬水平增高，聯(lián)合使用自噬抑制劑后，黑色素瘤患者對BRAF抑制劑的藥物敏感性提高；此外，還可通過抑制自噬相關(guān)基因Beclin1靶向抑制自噬，使自然殺傷細(xì)胞滲入黑色素瘤，以提高化療效果、增強腫瘤的免疫反應(yīng)[15]。M?ller等[20]發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可抑制黑色素瘤的病程進(jìn)展。對移植黑色素瘤細(xì)胞小鼠的實驗研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細(xì)胞的自噬水平越高，移植組織的致瘤性和侵襲性越強，而抑制自噬則可提高黑色素瘤細(xì)胞對治療的敏感性，使黑色素瘤細(xì)胞重新發(fā)生凋亡[21]。

2.4細(xì)胞自噬可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 黑色素瘤中存在自噬，且自噬在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移及發(fā)展中起重要作用[17]。當(dāng)自噬發(fā)生時，胞質(zhì)分散型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ會轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合型LC3-Ⅱ，因此LC3常作為檢測自噬活性的標(biāo)志蛋白，其相對表達(dá)量可大致反映自噬水平。Lazova等[22]對皮膚組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并觀察自噬標(biāo)志物L(fēng)C3抗體的實驗顯示，正常皮膚組織中黑色素細(xì)胞內(nèi)染色不明顯，而只發(fā)生皮膚播散型黑色素瘤組織細(xì)胞的LC3抗體染色明顯。此外，氯喹作為一種溶酶體藥物和自噬抑制劑作用于黑色素瘤細(xì)胞，可誘導(dǎo)自發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞死亡并減少轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的克隆增殖[15]。

3 PI3K/Akt/mTOR信號通路與黑色素瘤耐藥的相關(guān)性

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期等生理病理活動，該通路的失調(diào)與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。PI3K/Akt/mTOR信號通路可通過減少黑色素瘤細(xì)胞中凋亡發(fā)生的程序觸發(fā)另一種細(xì)胞生存途徑，使黑色素瘤對BRAF抑制劑產(chǎn)生耐藥。因此，深入探討PI3K/Akt/mTOR信號通路有助于全面了解黑色素瘤耐藥的原因。

3.1PI3K/Akt/mTOR信號通路

3.1.1PI3K PI3K是一種脂質(zhì)激酶，廣泛分布于多種哺乳動物的細(xì)胞質(zhì)中，并作為PI3K/Akt/mTOR信號通路的起始因子以及傳遞細(xì)胞間信息和調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)囊泡運輸?shù)男攀筟24]。目前已發(fā)現(xiàn)3種不同類別的PI3K，根據(jù)作用底物不同可將其劃分為 3個亞型[25]：PI3KⅠ、PI3KⅡ、PI3KⅢ。PI3KⅠ是由兩種不同亞基(p110催化亞基、p85調(diào)節(jié)亞基)所構(gòu)成的異源二聚體，其在細(xì)胞內(nèi)較為活躍，可將膜結(jié)合的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸。磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸被認(rèn)為是觸發(fā)募集和激活激酶的二級信使，其受到人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因的調(diào)節(jié)而發(fā)生去磷酸化，導(dǎo)致磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸活躍持續(xù)時間減少。PI3KⅡ和PI3KⅢ可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)和自噬途徑中的膜運輸[26-27]，間接影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.1.2Akt Akt是由反轉(zhuǎn)錄病毒安基因V-Akt基因編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是PI3K下游離子靶向電位調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子之一，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。當(dāng)Akt的T308和S473殘基被磷酸化時，Akt被完全激活?；罨腁kt可以磷酸化多種酶，包括胱天蛋白酶9等[28]。目前已發(fā)現(xiàn)3種Akt家族成員[Akt1、Akt2、Akt3(又稱PKBα、PKBβ、PKBγ)]均參與下游底物的活化過程，但在不同的細(xì)胞環(huán)境中，上述Akt家族成員的功能存在差異[29-30]。Akt1廣泛分布于組織細(xì)胞中，可調(diào)控細(xì)胞增殖和生長，參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過程。Akt2主要分布在肌肉和脂肪細(xì)胞中，在人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因功能缺失的前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮作用。Akt3在大腦和睪丸中表達(dá)較多，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成、糖原合成和葡萄糖攝取等生物學(xué)過程。

3.1.3mTOR mTOR是PI3K/Akt的下游激酶，屬于PI3K相關(guān)激酶家族成員之一。mTOR是PI3K/Akt/mTOR信號通路的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)及能量代謝控制中心[31]。mTOR可分為mTOR復(fù)合物(mTOR complex，mTORC)1和mTORC2兩種類型，其中mTORC1在PI3K/Akt/mTOR信號通路中發(fā)揮主要作用。mTORC1對雷帕霉素的敏感性高，而mTORC2對雷帕霉素不敏感。mTORC1受激素、生長因子、營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞應(yīng)激等各種環(huán)境信號所調(diào)節(jié)，通過增加蛋白質(zhì)的生物合成來影響細(xì)胞的生長和存活。此外，mTORC1還參與了細(xì)胞骨架組織的調(diào)節(jié)，可通過Akt的磷酸化和激活在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，但mTORC2的確切作用尚不完全明確[25]。當(dāng)營養(yǎng)豐富時，mTOR信號被激活，蛋白合成增加，細(xì)胞體積增加；當(dāng)營養(yǎng)不足時，mTOR信號被抑制，能量消耗和蛋白合成減少[32]。

3.2PI3K/Akt/mTOR信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬 自噬產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜。mTOR是多條調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬信號通路的重要聚合點，是產(chǎn)生自噬過程的核心因素，可負(fù)性調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生[32-33]。在mTOR上游主要有兩條信號通路具有激活mTOR的作用，即PI3K/Akt信號通路和Raf/促分裂原活化的蛋白激酶激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路。細(xì)胞自噬主要受PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)[19]。PI3K是mTOR的上游激活劑，通過磷酸化下游重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Akt調(diào)控mTOR，mTOR可通過Akt直接或間接磷酸化而被激活，磷酸化后被激活的mTOR可抑制自噬的發(fā)生[34-35]。mTOR可通過多種途徑影響自噬途徑[36]：①通過增強4E結(jié)合蛋白-1的磷酸化，使其與真核細(xì)胞翻譯起始因子4E分離，從而抑制自噬。②從Unc-51樣激酶1復(fù)合物上解離的mTOR通過防止Unc-51樣激酶1的外源活化，促進(jìn)Unc-51樣激酶1自身活化FIP200和自噬相關(guān)蛋白13，減少自噬泡形成，進(jìn)而抑制自噬。③死亡相關(guān)蛋白1作為mTOR的作用底物，可抑制自噬。④mTOR可通過調(diào)控Ambra1(autophagy/Beclin 1 regulator 1)的磷酸化抑制自噬的活性。

3.3PI3K/Akt/mTOR信號通路在黑色素瘤耐藥性中的作用 抑制自噬上游負(fù)性調(diào)控的PI3K/Akt/mTOR信號通路后，黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的自噬水平明顯升高，黑色素瘤細(xì)胞凋亡明顯減弱，黑色素瘤細(xì)胞對藥物抵抗性明顯增強[37]。在BRAF抑制劑治療早期，BRAF突變黑色素瘤細(xì)胞對藥物治療反應(yīng)良好，腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化受到抑制，瘤體有所縮小，患者狀態(tài)有所改善，但大部分患者于治療約6個月時出現(xiàn)耐藥[38-39]。細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt/mTOR信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，故推測，在BRAF抑制劑治療一段時間后，由于黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路長期受到影響，其持續(xù)的低水平表達(dá)可能促進(jìn)了細(xì)胞自噬水平的上調(diào)蓄積，而黑色素瘤細(xì)胞通過這種“誘導(dǎo)”自噬獲取了較多的胞內(nèi)營養(yǎng)支持，使其對基因靶向藥物的耐受性增加，抗細(xì)胞凋亡能力增強，導(dǎo)致黑色素瘤耐藥性的發(fā)生。

4 小 結(jié)

黑色素瘤惡性程度高，可選擇的治療方法有限，且黑色素瘤細(xì)胞廣泛的耐藥性導(dǎo)致治療效果欠佳，患者生存率較低。因此，亟須更好地了解黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的分子機制，以促進(jìn)黑色素瘤治療的進(jìn)展。黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的分子機制目前尚不完全明確。黑色素瘤對基因靶向藥物BRAF抑制劑產(chǎn)生耐藥可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路及細(xì)胞自噬相關(guān)，隨著研究的不斷深入，對黑色素瘤產(chǎn)生耐藥性的分子機制的認(rèn)識將逐漸明確，這將為未來黑色素瘤的治療提供很大幫助。