陳正永，楊婧，曾曉玲

(1.貴州醫(yī)科大學，貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產科，貴陽 550004； 3.貴州省人民醫(yī)院產科，貴陽 550002)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞等，有助于組織分化和再生等功能[1]。在體內，MSCs的分化作用與細胞外信號轉導、特定的信號通路等有關。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成員可通過控制關鍵轉錄因子的表達和活性調節(jié)MSCs分化為特定細胞的進程[2]。而TGF-β家族成員配體則可在細胞表面與特定的四聚體跨膜受體復合物(由兩種Ⅱ型受體和兩種Ⅰ型受體組成)結合，與受體復合物結合的配體可通過誘導Ⅱ型受體對Ⅰ型受體中的Ⅰ激酶結構域磷酸化導致細胞內信號轉導介質激活[3]。TGF-β家族配體包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、激活素以及生長分化因子等。TGF-β與相應的受體結合后導致該受體發(fā)生磷酸化，從而激活特定的Smad蛋白，這些蛋白易位至細胞核中形成激活或抑制性轉錄調控復合物，從而控制靶基因轉錄[4-5]?，F就TGF-β在MSCs分化中的作用研究進展予以綜述。

1 TGF-β概述

TGF-β在人體內的所有細胞中均表達，對正常發(fā)育和體內平衡起重要作用。TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、生長分化因子和BMP等30多種結構相關的蛋白質；TGF-β家族成員在許多細胞過程中均具有重要作用，包括免疫抑制、生長抑制、上皮-間充質轉化、細胞遷移、侵襲以及細胞外基質重塑等[4]。TGF-β有3個受體，即TGF-β受體(TGF-β receptor，TGFBR)1、TGFBR2和TGFBR3，當3種配體之一與TGFBR2結合時，即會發(fā)生典型的TGF-β信號轉導。TGFBR2可募集并磷酸化TGFBR1，而磷酸化的TGFBR1又可磷酸化下游Smad2和Smad3 C端的絲氨酸殘基(pSmad2/3C)，然后募集Smad4并轉移至細胞核，在核中Smad4調節(jié)TGF-β靶基因轉錄；另一方面，Smad7被募集至激活的TGFBR或pSmad2/3C復合物中，并通過Smad特異性E3連接酶啟動降解功能[3]。TGF-β還可與其受體結合通過刺激多種激酶[如促分裂原活化的蛋白激酶、胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)等]激活非經典TGF-β信號轉導；此外，Smad依賴性和Smad非依賴性信號均可通過與其他信號通路的互相作用調控細胞分化類型的特異性[4]。

2 TGF-β在MSCs分化中的作用

2.1TGF-β在成骨分化中的作用 成骨細胞發(fā)育主要分為增殖、基質成熟和礦化3個階段，這種分化過程取決于Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)和Osterix，成骨細胞可分化為骨細胞，被包裹在礦化骨中，具有調節(jié)代謝、骨重塑等功能[6]。MSCs向成骨細胞的轉化主要由RUNX2誘導，RUNX2是成骨細胞分化的主要轉錄因子，在成骨細胞分化的早期階段可促進MSCs分化為前成骨細胞，同時抑制MSCs向脂肪細胞系轉化；而成骨細胞的分化和成熟則由轉錄因子Osterix驅動，從而增強堿性磷酸酶活性、增加礦化，但RUNX2對于MSCs分化為成熟的成骨細胞并不重要，在分化后期其表達水平降低[7-8]。

TGF-β家族成員可調節(jié)早期骨髓基質向成熟基質分化過程中成骨細胞和骨細胞的分泌。TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3對成骨細胞的影響均具有時間和劑量依賴性，且在其分化的不同階段具有不同的作用。實驗表明，TGF-β可促進骨祖細胞增殖、早期分化和基質產生，同時抑制后期分化和基質礦化[9]。TGF-β配體可通過經典的Smad2和Smad3信號轉導通路以及非經典信號通路調節(jié)成骨細胞分化。成骨細胞中的Smad2過表達，可抑制RUNX2的表達但不影響其轉錄活性；Smad3表達增加可在分化早期降低RUNX2的表達及轉錄活性，在后期卻可增加其表達；激活Smad3可在早期促進成骨細胞的分化進程，并增加堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白以及參與基質礦化蛋白的表達[10]。Smad2可通過ERK通路的非經典TGF-β信號轉導抑制堿性磷酸酶表達、促進膠原蛋白合成，而Smad3可通過ERK1/2和p38信號通路抑制骨鈣素表達；作為一種反饋機制，TGF-β可通過ERK和c-Jun氨基端激酶通路抑制Smad3的轉錄[11-12]。此外，TGF-β還可通過ERK通路阻止終末分化細胞的凋亡，從而控制成骨細胞向骨細胞的分化進程[13]。TGF-β信號與其他信號通路相互作用也可影響成骨細胞分化，特別是BMP對TGF-β通路具有至關重要的作用。BMP-2可通過抑制TGFBR2的表達、促進細胞內重定位，抑制TGF-β信號轉導；此外，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均可通過激活編碼硬化蛋白的SOST(sclerostin)基因抑制骨中的Wnt信號轉導；TGF-β還可通過激活Smad3和PI3K信號通路調控β聯(lián)蛋白的表達，當β聯(lián)蛋白表達降低時，TGF-β則不再抑制骨髓MSCs(bone marrow MSCs，BMSCs)分化，表明TGF-β和Wnt信號協(xié)同可抑制成骨細胞分化[14]。

此外，TGF-β還可調節(jié)多種生長因子的表達。在BMSCs中，TGF-β可通過上調BMSCs中的成纖維細胞生長因子2、胰島素樣生長因子1和結締組織生長因子的基因轉錄水平，促進膠原蛋白基質的產生[14]。腫瘤壞死因子-α可通過核因子κB阻止TGF-β激活Smad2和Smad3，與其抑制Smad1、Smad5和Smad8激活的作用類似，表明腫瘤壞死因子-α具有促進成骨細胞分化的功能[10]。

2.2TGF-β在軟骨分化中的作用 MSCs分化為軟骨細胞需要軟骨細胞轉錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白(sex-determining region Y-box，SOX)9的參與，而SOX9蛋白是高遷移率蛋白轉錄因子家族成員；Nkx3.2(NK3 homeobox 2)可通過阻斷SOX9轉錄抑制劑的表達維持SOX9的表達，且兩者可以相互誘導表達；在分化后期，SOX5、SOX6與SOX9共同促進軟骨細胞分化，但晚期肥大軟骨細胞中的SOX9表達水平降低[15]。

TGF-β在細胞培養(yǎng)和體內研究中均顯示出軟骨誘導能力。研究顯示，TGF-β可誘導胚胎大鼠肌肉MSCs向軟骨細胞分化[16]。TGF-β配體和受體在骨骼系統(tǒng)中廣泛表達，并在間充質凝聚過程中起關鍵作用。TGF-β不會促進在塑料或Ⅰ型膠原上培養(yǎng)的BMSCs向軟骨細胞分化，但可促進在基質膠中培養(yǎng)的BMSCs向軟骨細胞分化[17]。在基質膠中培養(yǎng)BMSCs時，TGF-β可誘導BMSCs中的Wnt7a表達，導致神經鈣黏素表達，從而增加軟骨分化所需的細胞與細胞間的接觸；在骨膜下注射TGF-β可導致軟骨細胞增殖、分化以及軟骨形成增加[16-17]。在軟骨內骨形成過程中，軟骨膜是TGF-β1信號轉導的關鍵部位，TGF-β1可通過調控膠原蛋白X的表達導致跖骨培養(yǎng)物中軟骨細胞增殖和軟骨形成分化部分減少；在培養(yǎng)前去除軟骨膜，則可降低TGF-β1的抑制作用[3]。軟骨膜可產生并分泌控制軟骨細胞分化的生長因子，如印度刺猬因子、音猬因子以及甲狀旁腺素相關肽等。印度刺猬因子和音猬因子可誘導軟骨膜TGF-β2表達，從而誘導甲狀旁腺素相關肽表達并抑制肥大軟骨細胞的產生，但TGF-β1對縱向骨生長的抑制作用與甲狀旁腺素相關肽無關[17]。在軟骨分化和生長板發(fā)育過程中，TGF-β與BMP信號通路存在相互調節(jié)作用。在軟骨細胞中，BMP-2可抑制TGF-β誘導的Smad激活和BMP-Smad信號轉導，在成肌細胞、小鼠胚胎成纖維細胞和肝癌細胞中BMP-2也具有類似的調控作用[18]。研究發(fā)現，在小鼠成軟骨細胞中TGF-β與BMP信號存在相互作用，可通過形成類似于印度刺猬因子和甲狀旁腺素相關肽的反饋回路精確調節(jié)生長板的長度[19]。

2.3TGF-β在成肌細胞分化中的作用 MSCs肌源性分化的關鍵轉錄因子包括生肌調節(jié)因子(myogenic regulatory factor，MRF)5、MRF4、成肌分化抗原以及肌細胞生成素等，這些轉錄因子可與肌細胞增強因子協(xié)同作用。其中，生肌因子5(myogenic factor 5，MYF5)、MRF4和成肌分化抗原對MSCs肌源性分化作用至關重要，而肌細胞生成素與MRF4、成肌分化抗原和肌細胞增強因子2家族成員共同誘導晚期肌肉特異性基因的表達，驅動肌源性分化的進展[4]。TGF-β家族的多個成員均參與協(xié)調細胞分化過程，其對成肌細胞分化的調節(jié)作用取決于細胞類型、分化狀態(tài)以及細胞因子和TGF-β家族配體。

在體外試驗中，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3可抑制成肌細胞增殖、分化和肌管形成，但在胚胎研究中，TGF-β可促進胚胎成肌細胞分化，研究結果不一致的原因可能與胚胎和胎兒成肌細胞表面分子、轉錄因子存在差異表達以及對TGF-β及其配體的敏感性不同有關[20]。使用干擾小RNA沉默Smad2和Smad3可增加大鼠成肌細胞中肌細胞生成素的表達，同時促進后期分化標志物肌球蛋白和肌管融合的表達，表明TGF-β信號轉導可部分抑制早期成肌細胞分化，且是正常晚期成肌細胞分化所必需，其可通過Smad依賴性機制發(fā)揮作用[21]。但TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3對體內成肌細胞具有不同的影響。TGF-β1水平在肌管發(fā)育過程中保持恒定，TGF-β1-/-小鼠顯示正常的肌管形成和肌纖維發(fā)育；TGF-β2在發(fā)育和再生肌肉中由肌管表達，其表達水平隨著發(fā)育過程而增加，表明TGF-β2在晚期成肌細胞分化和體內肌管形成過程中發(fā)揮作用[22]。研究發(fā)現，在小鼠成肌細胞C2C12細胞中過表達失活形式的TGFBR2，然后將過表達的細胞注入小鼠體內，結果未顯示分化作用；肌肉組織受傷后，TGF-β1和TGF-β3從受損的肌肉組織和血小板中釋放出來，并刺激肌肉內的生肌細胞合成TGF-β；TGF-β對炎癥細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)具有趨化作用，而炎癥細胞又可分泌促炎因子(包括成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子和白細胞介素-1)，從而誘導血管生成并促進傷口愈合；此外，TGF-β1還可在損傷修復過程中誘導肌肉缺損周圍細胞外基質蛋白的表達，并促進肌纖維基膜再生[23]。

2.4TGF-β在脂肪細胞分化中的作用 根據功能不同，脂肪組織可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，白色脂肪組織主要用于儲存能量，棕色脂肪組織主要用于產熱。白色脂肪組織和棕色脂肪組織位于身體解剖學上不同的位置，其中，白色脂肪組織位于腹內，也稱為內臟脂肪和皮下脂肪，而棕色脂肪組織最常位于頸部和鎖骨上區(qū)域。冷暴露或β-腎上腺素能刺激均可誘導白色脂肪組織中出現棕色脂肪樣組織，這種現象稱為白色脂肪組織褐變。白色脂肪組織中的棕色脂肪樣組織與棕色脂肪組織表達相同水平的解偶聯(lián)蛋白1，而解偶聯(lián)蛋白1對于產熱至關重要；雖然棕色脂肪組織中的棕色脂肪細胞屬于MYF5+譜系，但白色脂肪組織中的棕色脂肪細胞與白色脂肪組織中的其他細胞則均屬于MYF5-譜系，這些細胞構成了第3種類型的脂肪細胞，即“米色”脂肪細胞或“白褐色”脂肪細胞[24]。未分化的MSCs最初可分化為前脂肪細胞并通過有絲分裂進行增殖，CCAAT/增強子結合蛋白中的β和亞基是刺激前脂肪細胞進一步分化的關鍵，可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ2和CCAAT/增強子結合蛋白α的表達，導致終末分化階段的細胞出現生長停滯[25]。此外，TGF-β在脂肪生成過程中具有抑制作用。TGF-β處理可增加小鼠前脂肪細胞3T3-F442A增殖，并有效抑制小鼠胚胎成纖維細胞向脂肪細胞分化[26]。TGF-β1轉基因小鼠的白色脂肪組織和棕色脂肪組織細胞數量均顯著降低，表明TGF-β可抑制脂肪生成[27]。在脂肪生成過程中，Smad2、Smad3和Smad4的表達水平在前脂肪細胞3T3-F442A中保持不變，而Smad6和Smad7的表達水平則顯著降低；Smad2或Smad3過表達可抑制3T3-F442A前脂肪細胞中的脂質積累，其中以Smad3的作用更顯著；同時，失活的Smad3可抑制TGF-β信號在脂肪生成中的抑制作用，Smad2則無此作用，表明Smad3可抑制TGF-β通路中的脂肪細胞分化[25]。

2.5TGF-β在肌腱細胞分化中的作用 肌腱是一種具有獨特功能的組織，其中Ⅰ型膠原排列成分層的縱向原纖維陣列，并由內腱結合成束，而內腱與血管系統(tǒng)、神經支配和淋巴管穿過的表腱相連。作為肌腱祖細胞的標志物，SCX(scleraxis)基因在肌腱間充質分化中具有重要作用，且持續(xù)存在于成熟的肌腱細胞中[28]。雖然目前關于MSCs向肌腱細胞分化的研究仍不夠完善，但MSCs向肌腱細胞分化的過程與TGF-β、BMP及Smad通路有關。

TGF-β家族成員在肌腱細胞分化和肌腱細胞表型的維持中均發(fā)揮重要作用。其中，BMP-2、BMP-4和BMP-7是可抑制肌腱細胞分化作用的蛋白，而BMP-14、BMP-13和BMP-12可誘導動物模型新肌腱形成[29]；TGF-β可促進SCX表達并維持肌腱細胞表型；Smad在由拉伸和壓縮力產生的相關基因表達中發(fā)揮重要作用，由此可見，TGF-β家族成員對肌腱細胞的形成和再生均至關重要[30]。由于肌腱在肌肉骨骼系統(tǒng)中具有獨特的作用，在保持靈活性的同時還可維持壓縮和伸展的動態(tài)范圍，因此物理力在肌腱細胞分化和功能中起重要作用。研究表明，TGF-β2可誘導MSCs向肌腱細胞譜系方向分化；在機械力作用下，TGF-β3可促進SCX表達并誘導肌腱細胞分化[31]。Smad(特別是Smad2和Smad3)是調節(jié)肌腱基因表達所必需，且這種基因表達由作用于肌腱組織的物理力誘導，其中Smad8已被證明在MSCs的肌腱分化中發(fā)揮作用[32-33]。

3 小 結

TGF-β家族對間充質譜系選擇和分化進展的影響較復雜，且依賴于時間、劑量以及所處的環(huán)境。此外，某些TGF-β蛋白對于MSCs分化過程中的不同階段也有不同的影響，如TGF-β可促進MSCs增殖以及早期分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞祖細胞等，但卻抑制后期分化為成熟的成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞；此外，TGF-β還可抑制成肌細胞增殖、分化和肌管形成。因此，藥理學靶向TGF-β家族成員有益于某些疾病的治療，如骨骼及關節(jié)相關疾病。TGF-β信號通路在MSCs分化中具有重要作用，但將研究成果向臨床轉化還需更深入的研究以確定其有效性及安全性。