王麒淇 藍 鳳 王 晶 郝柳思琪,2 李 艷 張 羅,2,3,4*

(1.北京市耳鼻咽喉科研究所，鼻病研究北京市重點實驗室，北京100005；2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京100730；3.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院過敏科，北京100730；4.中國醫(yī)學科學院慢性鼻病診療策略研究創(chuàng)新單元，北京100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，又稱變應性鼻炎，是指鼻腔黏膜接觸過敏原后，引起免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導的炎癥反應，臨床上主要表現(xiàn)為鼻癢、流清涕、陣發(fā)性噴嚏及鼻塞[1-2]。近年來AR患病率逐漸升高[3-4]，中國大中城市AR的自報患病率從2005年的11.1%上升到2011年的17.6%，并且15%～38%的AR患者伴發(fā)哮喘[5]，已經(jīng)成為嚴重影響全社會人群健康和生活質(zhì)量的公共健康問題。

鼻腔黏膜上皮屏障損傷導致過敏原滲透增加、分泌炎癥因子共同導致過敏反應，是AR的主要病理特征，與緊密連接、黏附連接等多種細胞連接蛋白表達改變密切相關[6]。多個研究小組[7-9]發(fā)現(xiàn)閉鎖連接蛋白1(zonula occludens protein 1，ZO-1)表達水平降低與AR鼻黏膜上皮屏障功能損傷有關[7]，屋塵螨抗原Derp1[8]、顆粒物[9]等可以使AR患者鼻上皮細胞ZO-1膜定位減少，上皮屏障通透性增加。研究[10-11]顯示，激活Wnt/β-catenin通路能夠抑制ZO-1表達，在卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導的小鼠AR模型中，抑制Wnt/β-catenin激活可以顯著抑制鼻黏膜炎癥水平[12]，但Wnt/β-catenin通路激活水平對AR鼻黏膜上皮細胞ZO-1表達的影響和作用機制尚不明確。

原鈣黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)是原鈣黏蛋白家族的一員[13]，研究[14-16]顯示，PCDH9基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病[14]、哮喘[15]相關，能夠參與Wnt通路調(diào)控[16]，目前尚缺乏PCDH9在AR鼻黏膜上皮中的相關研究。本研究擬探討PCDH9是否通過調(diào)控Wnt通路激活水平影響AR鼻黏膜上皮屏障功能，為進一步理解AR患者上皮屏障損傷的發(fā)生機制，尋找新的藥物研發(fā)靶點提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2019至2021年在首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院鼻過敏科的8例AR患者為病例組，8例非AR健康人為對照組，收集鼻黏膜鼻刷上皮細胞。AR患者入組標準：①AR診斷標準參照2015年《變應性鼻炎診斷和治療指南》[17]標準和過敏原檢測結(jié)果；②血清過敏原IgE檢測陽性；③鼻塞、清水樣涕、鼻癢和噴嚏等癥狀2項或2項以上；④查體可見鼻黏膜蒼白水腫、清水樣分泌物。排除標準：①真菌性鼻竇炎，鼻息肉，囊性纖維化，黏液囊腫，鼻腔鼻竇良、惡性腫瘤等其他鼻部疾??；②一般禁忌證，如自身免疫等疾病患者；③使用口服或鼻噴糖皮質(zhì)激素4周或抗生素2周[18]。對照組為年齡18～60歲的健康人。本研究通過首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準(批號：TRECKY2019-026)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 生物信息學分析

從可公開獲得的GEO(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫中下載包括對照組、AR鼻黏膜上皮細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE118243)，并應用GEO2R在線工具分析AR和正常對照組鼻黏膜的差異基因，選取P<0.05的差異基因。應用DAVID Bioinformatics Resources 2021對差異基因功能進行基因本體(gene ontology, GO)功能富集在線分析(FDR<0.25)。STRING 11.5進行蛋白相互作用網(wǎng)絡分析，并用Cytoscape 3.7.2繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。Panther進行基因功能富集通路分析(http：//pantherdb.org)。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人鼻黏膜上皮細胞系(human nasal epithelial cells，HNEPC)(廣州吉妮歐生物科技有限公司)和人正常支氣管上皮細胞(bronchial epithelial cells， BEAS-2B) [艾凡(上海)生物科技有限公司]，DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃，5%(體積分數(shù))的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞接種于6孔板中，每孔3×105個細胞，培養(yǎng)24 h后，按Lipofectamin 3000說明書對細胞轉(zhuǎn)染，對PCDH9進行過表達或敲除，PCDH9-siRNA和對照siRNA (每孔10 μmol/L，圣克魯斯生物技術，sc-76086，sc-37007)，GV141-3Flag-PCDH9和GV141載體對照(1μg/孔)購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。細胞過表達或敲除PCDH9后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR)或Western blotting實驗。

1.4 Q-PCR

提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Q-PCR檢測PCDH9：上游引物3′-ATGGCAACTCTGATCCCAAC-5′，下游引物3′-CGGTCATTGAACTGGTTCCT-5′;ZO-1：上游引物3′-AGGAGGTAGAACGAGGCATCATCC-5′，下游引物3′-TCTCCAGAAGTCAGCACGGTCTC-5′;CTNNB1：上游引物3′-TGGATTGATTCGAAATCTTGCC-5′，下游引物3′-GAACAAGCAACTGAACTAGTCG-5′;GAPDH：上游引物3′-GATTCCACCCATGGCAAATTC-5′，下游引物3′-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-5′。

1.5 Western blotting

提取細胞總蛋白，Western blotting檢測ZO-1(#13663, CST公司，美國)，β-catenin(#8480, CST公司，美國)，PCDH9(Proteintech，25090-1-AP)表達水平，β-actin(#4970, CST公司，美國)作為內(nèi)參蛋白，Image J軟件分析條帶灰度進行半定量統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad prism 9軟件繪圖，SPSS 26.0統(tǒng)計分析，根據(jù)兩組數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗結(jié)果，分別采用t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCDH9基因在AR患者鼻黏膜上皮細胞中的表達水平

與正常組相比，AR患者鼻腔黏膜上皮細胞中有4 287個基因表達上調(diào)，119個基因表達下調(diào)，對差異表達基因進行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)生物學過程(biological process, BP)主要與G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、檢測與嗅覺感知有關的化學刺激、細胞黏附有關；細胞組成(cellular component, CC)也主要集中在膜的組成部分、質(zhì)膜以及胞外區(qū)上；分子功能(molecular function, MF)主要與G蛋白偶聯(lián)受體活性、RNA聚合酶Ⅱ相關功能以及嗅覺受體活性相關(圖1A)。其中黏附連接的改變與AR患者鼻黏膜上皮屏障損傷顯著相關，采用STRING分析參與調(diào)控黏附連接的39個差異基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction，PPI)，發(fā)現(xiàn)CDH4、NLGN1、TNFAIP6、PCDH9、PRPH2、CDH11、PCDHA9、RS1、RNASE10、PCDHA4、CXCL12和PCDHA12表達水平上調(diào)，CX3CR1、SELP表達水平下調(diào)(圖1B)。并且參與調(diào)控黏附連接的39個基因中有6個基因(PCDH9、PCDHA4、CDH11、PCDHA9、PCDHA12、CDH4)與Panther中Wnt通路調(diào)控有關(圖1C)。進一步Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，AR組患者鼻黏膜上皮細胞中PCDH9表達(中位數(shù)11.16)明顯高于正常對照組(中位數(shù)0.053)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明AR組患者鼻黏膜上皮中PCDH9表達顯著上調(diào)(圖1D)。

圖1 AR患者鼻腔黏膜上皮細胞中PCDH9基因表達水平顯著增高Fig.1 PCDH9 is significantly upregulated in nasal epithelial cells of AR patients

2.2 PCDH9促進鼻黏膜上皮細胞ZO-1基因表達

在HNEPC細胞中分別過表達或敲除PCDH9，Q-PCR檢測參與鼻黏膜上皮細胞緊密連接的關鍵基因ZO-1的表達水平，結(jié)果顯示：干擾HNEPC細胞中的PCDH9(0.5±0.12vs1.05±0.06，t= 7.25，P=0.002，圖2A)表達能顯著抑制ZO-1(0.76±0.12vs1.05±0.06，t= 3.68，P=0.02，圖2B)基因的表達，過表達PCDH9(32.3±16.97vs1.04±0.03，t= -3.19，P=0.03，圖2D)可以促進ZO-1(1.42±0.19vs1.01±0.01，t= -3.68，P=0.02，圖2E)基因表達。

2.3 PCDH9抑制β-catenin蛋白表達，促進鼻黏膜上皮細胞緊密連接ZO-1表達

在BEAS-2B細胞和HNEPC細胞中分別過表達或敲除PCDH9，Western blotting檢測ZO-1、β-catenin的蛋白表達水平，結(jié)果顯示：BEAS-2B或HNEPC細胞過表達PCDH9(BEAS-2B：1.25±0.38vs0.52±0.15，t=-5.44，P=0.03; HNEPC： 1.97±0.67vs1.10±0.44，t=-4.66,P=0.04)可以抑制Wnt信號通路關鍵蛋白β-catenin表達(BEAS-2B：0.65±0.40vs1.00±0.34，t=7.59，P=0.02; HNEPC： 1.09±0.51vs1.63±0.72，t=4.35,P=0.049)，促進ZO-1表達(BEAS-2B： 1.22±0.29vs0.82±0.17，t=-5.95，P=0.03; HNEPC：1.61±0.25vs0.75±0.26，t=-4.72,P=0.04)(圖3A、B)。

進一步的研究顯示，敲除PCDH9(BEAS-2B：1.01±0.48vs1.34±0.60，t=4.51，P=0.046; HNEPC：0.93±0.21vs1.32±0.30，t=7.32,P=0.02)可以促進β-catenin(BEAS-2B： 1.48±0.42vs1.01±0.27，t=-4.78，P=0.04; HNEPC：1.11±0.12vs0.93±0.05，t=-4.36,P=0.049)的蛋白表達，同時ZO-1(BEAS-2B： 0.39±0.50vs0.94±0.63，t=6.35，P=0.02; HNEPC：0.32±0.51vs1.21±0.37，t=9.30,P=0.01)表達水平降低(圖3C、D)。

圖2 PCDH9促進鼻黏膜上皮細胞ZO-1基因表達Fig.2 PCDH9 increases ZO-1 mRNA expression in human nasal epithelial cells(HNEPC)

圖3 PCDH9降低鼻黏膜上皮細胞β-catenin表達，增強ZO-1表達Fig.3 PCDH9 decreases β-catenin expression and enhances ZO-1 expression in nasal epithelium cells

3 討論

鼻腔黏膜上皮屏障損傷是AR疾病的主要特征和致病原因，鼻黏膜上皮細胞緊密連接和黏附連接的破壞使過敏原滲透增加，激活Th2型炎癥反應，導致過敏反應[19]。

本研究首先通過對GEO數(shù)據(jù)庫中GSE118243基因芯片數(shù)據(jù)進行分析。AR和正常鼻黏膜上皮細胞的差異基因參與的生物學過程和功能主要與細胞黏附、細胞膜的組成部分、質(zhì)膜以及胞外區(qū)相關，這些通路功能的改變都和鼻黏膜上皮屏障功能相關。鼻腔黏膜上皮屏障功能主要受上皮細胞-細胞連接的調(diào)節(jié)，包括頂端緊密連接(tight junctions，TJs)和細胞間的黏附連接[20]，多項研究[9,21]顯示，AR患者鼻黏膜上皮細胞ZO-1、E-cadherin、Occludin表達水平降低。對參與細胞黏附的差異基因進一步進行蛋白相互作用網(wǎng)絡分析和Panther通路分析，發(fā)現(xiàn)PCDH9、PCDHA4、PCDHA9、PCDHA12、CDH11、CDH4同時與Wnt通路調(diào)控有關。CDH11和CDH4屬于鈣黏素家族；PCDH9屬于原鈣黏蛋白家族δ亞組，PCDHA4、PCDHA9和PCDHA12屬于α組[22]。研究[23]顯示，原鈣黏蛋白家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中扮演重要角色，在過敏性鼻炎中的作用還鮮有報道。近年來研究[24]顯示，多種δ組PCDHs蛋白參與Wnt通路調(diào)控，PCDH8可以直接與Frizzled結(jié)合激活Wnt通路，PCDH11Y可以促進β-catenin入核。Wnt通路廣泛參與調(diào)控上皮組織的結(jié)構(gòu)和功能，脂多糖激活Wnt/β-catenin通路使肺泡上皮細胞ZO-1表達降低，導致肺纖維化[10]；腦再灌注損傷促進β-catenin表達，抑制ZO-1、Occludin及Claudin-1表達，導致血-腦脊液屏障損傷[11]。在OVA誘導的小鼠AR模型中，抑制Wnt/β-catenin激活可以顯著抑制鼻黏膜炎癥水平[12]，因此Wnt通路可能參與AR鼻黏膜屏障損傷調(diào)控，本研究對可能發(fā)揮直接調(diào)控Wnt-β-catenin通路作用的δ組原鈣黏蛋白PCDH9在AR和正常鼻黏膜上皮細胞進行進一步驗證，發(fā)現(xiàn)PCDH9表達水平在AR鼻黏膜上皮細胞顯著升高。

進一步研究PCDH9對鼻黏膜上皮屏障的影響，發(fā)現(xiàn)在BEAS-2B或HNEPC體外培養(yǎng)模型中，PCDH9能夠促進ZO-1表達，同時抑制β-catenin表達，說明PCDH9可能通過抑制Wnt通路激活水平，促進鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白表達。研究[16,25-27]顯示，PCDH9在肝癌[16]、胃癌[25-26]、膠質(zhì)瘤[27]等腫瘤中表達水平顯著下調(diào)，能夠抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-155-5p能夠促進PCDH9表達，高表達的PCDH9能促進β-catenin降解復合體GSK-3β的活性[16]，進而促進β-catenin磷酸化降解[28]。PCDH9本身作為原鈣黏蛋白家族的一員，發(fā)揮構(gòu)成細胞連接的生理功能。在本研究體外培養(yǎng)模型中，PCDH9表達能夠促進ZO-1表達，但在體內(nèi)，一項特應性皮炎研究[29]顯示，13q21.31區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性與疾病密切相關，13q21.31區(qū)域是IgE的主要基因座，PCDH9是距離該區(qū)域最近的基因，因此筆者推測PCDH9在AR中顯著升高可能與鼻黏膜屏障損傷炎癥的負反饋調(diào)節(jié)以及基因組水平調(diào)控相關，此現(xiàn)象的具體機制仍需要在小鼠等在體模型中進一步研究。

本研究顯示PCDH9在AR患者鼻黏膜上皮中表達水平增加，在體外能夠促進鼻黏膜上皮細胞緊密連接蛋白的表達，抑制Wnt通路激活水平，研究有助于認識PCDH9在AR及鼻腔上皮屏障中發(fā)揮的作用和機制，提高對上呼吸道變態(tài)反應相關疾病發(fā)病機制的科學認識水平，為未來針對AR上皮屏障的治療提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明王麒淇：研究設計，論文撰寫；藍鳳、李艷：數(shù)據(jù)分析；郝柳思琪、王晶：細胞實驗等；張羅：研究設計，論文審定。