張 威，滕 瑩，黃徐駿，李志紅，張亞波，舒金平＊，王浩杰

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省杭州市富陽區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 杭州 311400；3.浙江省遂昌縣妙高林業(yè)工作中心站，浙江 遂昌 323300)

“覓食”是生物生存與繁衍的基礎(chǔ)，是生物間食物鏈的關(guān)鍵一環(huán)，也是生物學(xué)及進(jìn)化生態(tài)學(xué)的核心內(nèi)容[1-2]。而植物揮發(fā)物（VOCs）在寄主植物-植食性昆蟲-天敵三級(jí)營養(yǎng)鏈連接中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是植食性昆蟲及天敵昆蟲搜尋和定位寄主的重要信號(hào)物質(zhì)[3-6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在植食性昆蟲與寄主互作研究中，超98%的報(bào)道是以地面昆蟲（多以成蟲為主）為對(duì)象，對(duì)于地下昆蟲的關(guān)注較少[7-8]。相對(duì)于地面昆蟲而言，在黑暗（視覺刺激缺失）、復(fù)雜的土壤環(huán)境中昆蟲如何定位到寄主植物知之不多[9-11]。自Doane等[12]首次證實(shí)馬鈴薯叩甲（Ctenicera destructor(Brown)）幼蟲依靠植物根系釋放的CO2定位寄主以來，胡蘿卜根實(shí)蠅（Psila rosaeF.）、玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgiferaLeconte）及大栗鰓金龜（Melolontha hippocastaniFabricius）幼 蟲等多種地下昆蟲被證實(shí)對(duì)CO2有顯著的正趨向性[9,13]，CO2一度被認(rèn)為是地下植食性昆蟲定位寄主的唯一信號(hào)物質(zhì)[14-15]。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)相比于CO2，根部釋放的揮發(fā)物對(duì)土壤植食性昆蟲定位寄主更有效[11,16-17]，如大麥（Hordeum vulgareL.）根系釋放的hexanal、(E)-hex-2-enal及(E)-non-2-enal等4種揮發(fā)物能顯著激發(fā)金針蟲（鞘翅目（Coleoptera）叩甲科（Elateridae）昆蟲幼蟲的統(tǒng)稱）的定向移動(dòng)[11]。植物根系揮發(fā)物在地下植食性昆蟲寄主搜尋過程中發(fā)揮著重要作用，但研究報(bào)道并不多。篩胸梳爪叩甲（Melanotus cribricollis(Faldermann)）是我國南方竹林金針蟲的優(yōu)勢種[18]，主要蛀食雷竹（Phyllostachys violascens(Carriere) Riviere &C.Riviere）、毛 竹（Ph. edulis(Carriere) J.Houzeau）及烏哺雞竹（Ph. vivaxsMcClure）等多種筍用竹種，造成鮮筍腐爛和退筍，部分林分鮮筍受害率超70%，留養(yǎng)的種筍受害率高達(dá)100%，嚴(yán)重影響竹筍的產(chǎn)量和質(zhì)量，威脅竹筍產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[19]。前期研究表明，與普通小麥（Triticum aestivumL.）、玉米（Zea maysL.）等禾本科（Poaceae）作物相比，篩胸梳爪叩甲幼蟲偏好取食雷竹筍，竹筍特有的揮發(fā)物可能發(fā)揮了重要作用[20]，但竹筍揮發(fā)物的組成及與CO2的引誘活性差異尚未明確。本研究監(jiān)測比較雷竹筍揮發(fā)物和CO2釋放劑對(duì)篩胸梳爪叩甲幼蟲的引誘作用，并鑒定了竹筍揮發(fā)物組分，旨在探索竹林金針蟲的寄主定位及識(shí)別機(jī)制，為竹林金針蟲的高效監(jiān)測及防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx、竹筍和CO2釋放劑顆粒

2020年3—4月，在浙江省德清縣雷竹種植區(qū)（120°04′12″ E，30°32′08″ N）采集篩胸梳爪叩甲幼蟲，帶回至中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所恒溫養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)（養(yǎng)蟲室溫度20±1 ℃，相對(duì)濕度60% ± 10%）。飼養(yǎng)時(shí)，將采集的金針蟲用無菌水沖洗數(shù)次后，依據(jù)個(gè)體大小分裝于養(yǎng)蟲箱中（42 cm×28 cm×22 cm），單箱飼養(yǎng)50頭，養(yǎng)蟲箱中的無菌土濕度控制在10%±1%，于黑暗條件下飼養(yǎng)，以鮮筍喂食（定期更換）。試驗(yàn)時(shí)選取個(gè)體大小相近、齡期一致、健康活躍的幼蟲個(gè)體供試[21]。

本研究所選用的竹筍為雷竹筍，均采自浙江省杭州市富陽區(qū)永昌鎮(zhèn)雷竹種植區(qū)。試驗(yàn)當(dāng)天，在雷竹林挖掘新鮮健康竹筍（筍尖出土＜2 cm）1 000 g，保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室供試。CO2釋放劑顆粒由加拿大農(nóng)業(yè)與食品研究中心Todd Kabaluk教授贈(zèng)送，主要成分為酵母（Saccharomyces cerevisiaeReess ex Hansen）、小麥淀粉和藻酸鈣[22]。

1.2 雙向選擇儀

雙向選擇儀用實(shí)木材料（杉木）制成，由中心蟲室B（10 cm×5 cm×10 cm）和左右兩側(cè)2個(gè)大小相同的選擇室A和C（15 cm×10 cm×10 cm）所構(gòu)成（圖1）。中心蟲室兩側(cè)隔板（10 cm×10 cm×0.1 cm）能手動(dòng)拔除，使蟲室和選擇室連通，金針蟲可自由移動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)再插入隔板，使中心蟲室和選擇室分離，便于統(tǒng)計(jì)不同選擇端的金針蟲數(shù)量。中心蟲室用于放置供試金針蟲，左右兩側(cè)選擇室用于放置竹筍或CO2釋放劑顆粒。篩胸梳爪叩甲幼蟲在雙向選擇儀中可自由移動(dòng)，空白試驗(yàn)（兩側(cè)均為無菌土）及同食物誘餌（等量竹筍）預(yù)實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，自制雙向選擇儀對(duì)金針蟲的選擇行為無顯著影響（GP=0.06，P＞0.05；GH=17.71，P=0.54，G檢驗(yàn)，其中GP指每個(gè)處理組合中所有重復(fù)選擇蟲數(shù)總量的G值；GH指重復(fù)之間異質(zhì)性G值，下同）。

圖1 雙向選擇儀Fig.1 Dual-choice olfactometer for wireworms attraction

1.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲監(jiān)測

1.3.1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)竹筍的行為反應(yīng) 將1.75 kg含水量為10%的無菌土加入到雙向選擇儀內(nèi)，水平震蕩木盒，使盒內(nèi)土面平整，各部分土壤質(zhì)地均勻一致，插入分隔板，備用。將新鮮雷竹筍（林地土壤以下的部分）的中間部分切成若干段，分別稱取10、20和40 g，作為3個(gè)處理，隨機(jī)埋入雙向選擇儀的任意一側(cè)選擇室的中心，另一側(cè)選擇室作空白對(duì)照（不放置竹筍）。同時(shí)，在中心蟲室的無菌土中放入10頭金針蟲（饑餓24 h，下同），并取出分隔板。24 h后，插入分隔板。首先取出中心蟲室的無菌土，在托盤內(nèi)仔細(xì)分離統(tǒng)計(jì)其內(nèi)金針蟲的數(shù)量（標(biāo)記為“未作出選擇”），然后依次統(tǒng)計(jì)兩側(cè)選擇室內(nèi)金針蟲的數(shù)量。

上述試驗(yàn)均在黑暗條件下進(jìn)行（室內(nèi)溫度25±1 ℃，相對(duì)濕度80%±10%），每個(gè)處理共計(jì)20個(gè)重復(fù)。

1.3.2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)CO2的行為反應(yīng) 取CO2釋放劑顆粒10粒（2 g）、20粒（4 g）和40粒（8 g），隨機(jī)埋入雙向選擇儀的一側(cè)選擇室的中心，另一側(cè)作為對(duì)照。同時(shí)，將10頭金針蟲在中心蟲室的無菌土內(nèi)釋放，并取出隔板。24 h后統(tǒng)計(jì)各區(qū)域金針蟲的數(shù)量。

上述試驗(yàn)均在黑暗條件下進(jìn)行（室內(nèi)溫度25±1 ℃，相對(duì)濕度80%±10%），每個(gè)處理共計(jì)20個(gè)重復(fù)。

1.3.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲的選擇行為 取30 g雷竹筍和20粒CO2釋放劑顆粒，分別埋入雙向選擇儀的左右兩側(cè)選擇室的中心。同時(shí)，在中心蟲室內(nèi)釋放10頭金針蟲。設(shè)置24、48 h兩個(gè)處理，于24、48 h后統(tǒng)計(jì)各區(qū)域金針蟲數(shù)量。

上述試驗(yàn)均在黑暗條件下進(jìn)行（室內(nèi)溫度25±1 ℃，相對(duì)濕度80%±10%），每個(gè)處理共計(jì)20個(gè)重復(fù)。

1.4 竹筍揮發(fā)物組分測定

1.4.1 揮發(fā)物收集 利用固相微萃法提取揮發(fā)物。稱取雷竹筍50 g，放入潔凈的150 mL錐形瓶內(nèi)（錐形瓶使用前用95%酒精清洗，并置于烘箱中120 ℃烘120 min），用Parafilm封口，靜置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，平衡30 min。將活化的SPME萃取裝置（美國Supelco公司生產(chǎn)，100 μm PDMS萃取頭）插入錐形瓶內(nèi)，推出萃取頭，使其固定在竹筍上方5 cm處，萃取時(shí)間為60 min。萃取結(jié)束后，立即將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口（Agilent HP 6890GC/5975B）進(jìn)行解析。實(shí)驗(yàn)于暗室中進(jìn)行（溫度25±1 ℃，相對(duì)濕度60%～70%），每組處理3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 氣-質(zhì)聯(lián)用儀操作條件 色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（極性，柱長30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚25 μm）；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，維持2 min，14 ℃·min-1升至180 ℃，再以25 ℃·min-1升至260 ℃，維持7 min。以99.999%的高純氦氣作為載氣，流量1.0 mL·min-1[17]。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，電子倍增器電壓1 340 V，掃描質(zhì)量范圍50～550 aum。

1.4.3 揮發(fā)物組分鑒定與分析 根據(jù)氣-質(zhì)聯(lián)用儀的分析結(jié)果，比對(duì)譜庫（NIST 2015）中標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜峰，對(duì)不同組分進(jìn)行初步的物質(zhì)鑒定；然后購買標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷稀釋成一定濃度的溶液，按照與樣品相同的升溫程序和質(zhì)譜條件，在氣-質(zhì)聯(lián)用儀中進(jìn)樣1 μL，將標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)與樣品中相應(yīng)峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，從而確定其揮發(fā)物組分。揮發(fā)物各組分的定量分析，應(yīng)用峰面積百分比法（某物質(zhì)峰面積/總物質(zhì)峰面積×100%）計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

選擇性試驗(yàn)中，對(duì)于金針蟲在不同組合和處理間（包括空白對(duì)照）的選擇偏好均采用重復(fù)適合性（Repeated Goodness-of-fit）G檢驗(yàn)。不同質(zhì)量竹筍間以及不同濃度CO2間的誘蟲差異分析均采用R×C列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)（Pearson卡方檢驗(yàn)）。利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V19.05（杭州睿豐信息技術(shù)有限公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Excel 2019、PowerPoint 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)不同質(zhì)量竹筍的行為反應(yīng)

鮮筍誘集試驗(yàn)表明，雷竹鮮筍對(duì)篩胸梳爪叩甲幼蟲表現(xiàn)出顯著的吸引作用（表1），但不同質(zhì)量的竹筍間差異不顯著（χ2=0.576，df=2，P＞0.05；圖2）。釋放金針蟲24 h后，大多數(shù)金針蟲選擇在埋有竹筍的一端，聚集在竹筍周圍或鉆入竹筍內(nèi)蛀食。供試的200頭金針蟲，10 g竹筍端有128頭，占供試金針蟲的64.00%（GP=69.43，P＜0.001；GH=21.10，P=0.331；表1）；20 g竹筍端有118頭，占供試金針蟲的59.00%（GP=61.62，P＜0.001；GH=23.64，P=0.210；表1）；40 g竹筍端有136頭，占供試金針蟲的68.00%（GP=84.17，P＜0.001；GH=8.74，P=0.977；表1）。釋放金針蟲24 h后，不同處理均有20%左右的金針蟲仍停留在中心蟲室，未作出選擇的金針蟲在不同質(zhì)量鮮筍處理中無顯著差異（圖2）。

圖2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)鮮筍的趨向行為Fig.2 Preference behavior of M.cribricollis larvae towards bamboo shoots in a dual-choice olfactometer

表1 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)不同質(zhì)量竹筍的選擇Table 1 Choice tests of M.cribricollis larvae towards different weight bamboo shoots in a dual-choice olfactometer

2.2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)CO2的行為反應(yīng)

CO2對(duì)篩胸梳爪叩甲幼蟲有顯著的吸引作用，且不同濃度的CO2對(duì)金針蟲引誘力差異顯著（χ2=7.945，df=2，P＜0.05；表2，圖3）。放入10粒CO2釋放劑顆粒時(shí)，供試的200頭金針蟲中161頭作出了選擇，CO2端有99頭，占供試金針蟲的49.50%（GP=8.58，P＜0.01；GH=9.21，P=0.970）；放入20粒CO2釋放劑顆粒時(shí)，作出選擇的有141頭，CO2端有107頭，占供試金針蟲的53.50%（GP=36.70，P＜0.001；GH=22.22，P=0.274）；放入40粒CO2釋放劑顆粒時(shí)，作出選擇的有149頭，CO2端有107頭，占供試金針蟲的53.50%（GP=29.33，P＜0.001；GH=11.82，P=0.893）。20粒CO2釋放顆粒劑對(duì)金針蟲的引誘力最強(qiáng)，與10粒CO2釋放顆粒劑相比有顯著差異，但與40粒CO2釋放顆粒劑間差異不顯著（圖3）。

圖3 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)不同濃度CO2的趨向行為Fig.3 Preference behavior of M.cribricollis larvae towards CO2 of different concentrations in a dual-choice olfactometer

表2 篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)不同濃度CO2的選擇Table 2 Choice tests of M.cribricollis larvae towards CO2 of different concentrations in a dual-choice olfactometer

2.3 篩胸梳爪叩甲幼蟲在竹筍和CO2間的選擇行為

在竹筍和CO2釋放劑顆粒之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好竹筍，竹筍的吸引力強(qiáng)于CO2，但不同的時(shí)間處理（24 h和48 h）間差異不顯著（χ2=0.314，df=1，P＞0.05）。供試的200頭金針蟲中，24 h后竹筍端有139頭（占供試金針蟲的69.5%），CO2端有34頭（GP=68.37，P＜0.001；GH=15.40，P=0.697；表3），而48 h后，竹筍端有142頭（占供試金針蟲的71.0%），CO2端有35頭（GP=47.69，P＜0.001；GH=15.40，P=0.749；表3）。

表3 篩胸梳爪叩甲幼蟲在竹筍和CO2釋放物間的選擇Table 3 Choice tests of M.cribricollis larvae between bamboo shoots and CO2 resource in a dual-choice olfactometer

2.4 雷竹筍揮發(fā)物組分

固相微萃取法收集、鑒定雷竹筍揮發(fā)物17種，其中萜烯類化合物7種（均是倍半萜），羧酸類化合物2種，醇類、酯類及酚類化合物各1種，還有1種烷烴和1種烯烴類化合物（表4）。17種化合物中，相對(duì)含量最高的為烯烴類化合物，相對(duì)含量占比達(dá)66.62%，其次是倍半萜（27.98%），而7種倍半萜中以α-葎草烯含量最高，占16.49%（表4）。

表4 雷竹筍揮發(fā)物的成分及其相對(duì)含量Table 4 Relative content (%) and volatile components of Ph.violascens shoot collected by HS-SPME

3 討論

植物揮發(fā)物在植食性昆蟲搜尋和定位寄主過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其在黑暗、環(huán)境更為復(fù)雜的地下植食性昆蟲的覓食過程中更為重要[13,15,23]。大量研究表明，CO2是地下植食性昆蟲寄主定位的重要信號(hào)物質(zhì)[23-24]，如0.5%的CO2對(duì)玉米根螢葉甲幼蟲有很強(qiáng)的引誘作用[25]，且CO2濃度能調(diào)節(jié)其遠(yuǎn)距離寄主搜尋和定位行為[23]。本研究利用CO2釋放劑證實(shí)了篩胸梳爪叩甲幼蟲（竹林金針蟲）對(duì)土壤中的CO2表現(xiàn)出顯著的吸引作用，同時(shí)CO2濃度對(duì)竹林金針蟲的定向移動(dòng)有顯著影響，與其它金針蟲的相關(guān)研究結(jié)果吻合[12,17]。CO2濃度與金針蟲行為密切相關(guān)，過低或過高均影響金針蟲的定向選擇，CO2濃度過低金針蟲難以探測，過高的CO2濃度對(duì)金針蟲表現(xiàn)出驅(qū)避或毒性作用[25-26]，研究表明，4 g CO2釋放劑顆粒的引誘效果最佳，增加CO2釋放劑的量對(duì)竹林金針蟲的趨向行為影響不顯著。

盡管CO2對(duì)金針蟲、蠐螬等地下植食性昆蟲有吸引作用，但土壤環(huán)境中CO2普遍存在且濃度多變，地下植食性昆蟲仍能快速找到寄主，有學(xué)者認(rèn)為，地下植食性昆蟲在缺乏視覺輔助的情況下，擁有更為精巧的化學(xué)通訊和寄主識(shí)別機(jī)制。植物在生長過程中，根系會(huì)釋放大量的CO2和自身代謝產(chǎn)物（初生及次生代謝物），尤其是次生代謝物對(duì)地下昆蟲的寄主搜索和選擇行為有重要影響[11,15,27]。本研究中，在竹筍和CO2釋放劑之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好竹筍，這也表明竹筍的揮發(fā)物在金針蟲寄主搜尋和定位過程中發(fā)揮重要作用。

目前對(duì)慈竹（Bambusa emeiensisL.C.Chia&H.L.Fung）、麻竹（Dendrocalamus latiflorusMunro）及綠竹（B. oldhamiiMunro）等叢生竹筍[28-29]，毛竹[30-31]和苦竹（Pleioblastus amarus(Keng) Keng f.）等散生竹筍的揮發(fā)物成分研究有過報(bào)道。竹筍揮發(fā)物組分因竹種、提取方法及提取部位的不同，揮發(fā)物組分差異顯著，呈現(xiàn)出一定的風(fēng)味特征。本研究采用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法收集鑒定了雷竹筍（地下部分）揮發(fā)物組分17種，其中以烯烴和萜烯類化合物為主。萜烯類化合物是最為常見的植物揮發(fā)性組分，在植食性昆蟲產(chǎn)卵及搜尋寄主過程中常發(fā)揮重要的作用[32-33]。如β-caryophyllene是玉米根螢葉甲[34]、α-葎草烯是甘薯蟻象（Cylas formicariusFabr.）[35]、α-pinene及β-pinene是鰓金龜（M. melolonthaL.）[36]等地下植食性昆蟲幼蟲定位寄主的關(guān)鍵信號(hào)物質(zhì)。Barsics等研究表明，大麥根釋放的hexanal,(E)-hex-2-enal及(E)-non-2-enal等4種醛類揮發(fā)物能吸引金針蟲的定向移動(dòng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)的α-葎草烯等7種相對(duì)含量較高的倍半萜，是否為篩胸梳爪叩甲幼蟲定位竹筍的關(guān)鍵物質(zhì)，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步測定。

大多地下植食性昆蟲是世界性重大害蟲，危害周期長、隱蔽性強(qiáng)，種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測及防治一直是植物保護(hù)工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)[37]。近年來，金針蟲在浙江、福建及江西等核心竹筍產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，如何綠色、經(jīng)濟(jì)、有效地控制竹林金針蟲是竹筍產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展中亟待解決的問題。本研究證實(shí)了竹筍揮發(fā)物及CO2對(duì)竹林金針蟲有顯著的吸引作用，并鑒定了竹筍揮發(fā)物組分，為對(duì)竹林金針蟲具有引誘活性的信號(hào)物質(zhì)的篩選及基于引誘劑的金針蟲AK技術(shù)（Attract and kill strategy）研發(fā)提供了重要依據(jù)。

4 結(jié)論

研究表明，篩胸梳爪叩甲幼蟲對(duì)新鮮雷竹筍和CO2釋放劑顆粒均有顯著趨性，在竹筍和CO2釋放劑之間，篩胸梳爪叩甲幼蟲顯著偏好新鮮竹筍，相比CO2釋放劑，竹筍萌發(fā)時(shí)所釋放的揮發(fā)物對(duì)竹林金針蟲搜尋寄主更為有效。本研究分離鑒定了17種可能對(duì)篩胸梳爪叩甲幼蟲具有吸引作用的萜烯類化合物，為研發(fā)高效的金針蟲引誘劑，探索竹林金針蟲的新型防控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。