于承平 崔永康 綜述 李林強(qiáng) 審校

染色體外環(huán)狀DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的，并存在于染色體外的環(huán)狀DNA分子。Stahl首次提出，DNA可能在高等生物的染色體外以一系列環(huán)狀形式存在。1965年，Zuo等[1]對(duì)公豬精子DNA分離提取并發(fā)現(xiàn)eccDNA，并進(jìn)一步驗(yàn)證該理論。目前研究發(fā)現(xiàn)eccDNA具有獨(dú)立存在于染色體之外的、呈獨(dú)立的環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)、重復(fù)的基因組序列、與染色質(zhì)基因序列相同、數(shù)百堿基至數(shù)千堿基組成等一系列特征。越來越多的證據(jù)已經(jīng)證明了eccDNA在腫瘤的異質(zhì)性、侵襲性、進(jìn)化和化學(xué)抗性方面發(fā)揮功能，大體總結(jié)為通過驅(qū)動(dòng)腫瘤異質(zhì)性使癌細(xì)胞可以快速適應(yīng)治療方案和環(huán)境變化。因此，有人提出eccDNA將會(huì)是癌癥治療的新靶點(diǎn)，還可作為新型生物學(xué)標(biāo)志物用于癌癥診斷和治療預(yù)后評(píng)估。本文就eccDNA的分類、形成機(jī)制、在癌癥中的表達(dá)及作用進(jìn)行綜述。

1 eccDNA的分類

1.1 小多分散DNA(spcDNA)

spcDNA最初是在19世紀(jì)70年代由Radloff在一篇介紹染料浮力密度離心純化環(huán)形DNA的文章中提出的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，spcDNA的長(zhǎng)度為數(shù)百堿基至數(shù)千堿基不等[3]，來源于基因組的重復(fù)序列[2，4-5]。Krolewskla等[4]對(duì)非洲綠猴腎細(xì)胞分離純化得到spcDNA，大小約為300 bp。Hollis等[2]在外周血淋巴細(xì)胞的spcDNA中分離得到人類基因組中短且重復(fù)的序列-Sau3A家族。研究表明，范可尼貧血(Fanconi Anemia，F(xiàn)A)、著色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum，XP)、結(jié)腸癌細(xì)胞和宮頸癌上皮細(xì)胞(HeLa)等組織和細(xì)胞中富含spcDNA[5]。在致癌物誘導(dǎo)正常細(xì)胞癌變的過程中，細(xì)胞產(chǎn)生大量spcDNA[3]：藥物環(huán)乙酰亞胺或抑制DNA復(fù)制的藥物如羥基脲(HU)或1，7-二甲基苯并蒽(DMBA)加萘二酸處理小鼠的細(xì)胞后，細(xì)胞中spcDNA水平升高；同樣在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行烷化劑甲基硝基亞硝基胍(MNNG)和其他致癌物處理后，嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中的spcDNA數(shù)量增加。由此可見，spcDNA的產(chǎn)生與基因組不穩(wěn)定密切相關(guān)。在spcDNA形成過程中，在致癌原影響下染色體重組會(huì)提高基因組的不穩(wěn)定性；spcDNA形成后，致癌原誘導(dǎo)的spcDNA可能作為突變體，進(jìn)一步促使染色體異常[3]。

1.2 端粒環(huán)

端粒是位于每個(gè)染色體臂末端的核蛋白結(jié)構(gòu)，由一個(gè)高度保守的六聚體(TTAGGG)串聯(lián)重復(fù)DNA序列形成[6]，大小約為738bp的整數(shù)倍[7]。其作用在于保護(hù)DNA不被降解和融合。端粒環(huán)最初在哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在原核生物、植物、線蟲和鳥類的端粒中被發(fā)現(xiàn)[8]。端粒環(huán)是端粒DNA的3′末端外伸突出形成單鏈富G重復(fù)序列的套索樣結(jié)構(gòu)，本質(zhì)是保護(hù)端粒的3′末端[6，9]。端粒環(huán)的形成是端粒重復(fù)序列間的基因重組或從端粒中切除的結(jié)果[10]。研究發(fā)現(xiàn)，端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(Telomere repeat binding factor 2，TERF2)促進(jìn)端粒3′端DNA的末端卷曲，并在端粒環(huán)形成和維持過程中至關(guān)重要[9]。當(dāng)端粒環(huán)形成后，其通過滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增不斷增大，產(chǎn)生端粒重復(fù)序列，使端粒延長(zhǎng)[10]。由此可見，端粒環(huán)在維持端粒長(zhǎng)度中起重要作用。也有文獻(xiàn)報(bào)道，端粒環(huán)形成調(diào)控相關(guān)蛋白，如起源識(shí)別復(fù)合物(Origin recognition complex，ORC)和Werner綜合征蛋白(Werner syndrome protein，WRN)[11]，在端粒環(huán)的形成中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)端粒替代延長(zhǎng)機(jī)制(Alternative lengthening of telomeres，ALT)在肉瘤、胃癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤、腎癌(Wilm′s腫瘤)、膀胱癌、間皮瘤、惡性黑色素瘤和生殖細(xì)胞睪丸癌等中發(fā)揮重要作用[7]。目前尚沒有文獻(xiàn)具體闡述端粒環(huán)在ALT中的作用。

1.3 染色體外rDNA環(huán)(Extra-chromosomal Ribosomal Circles，ERCs)

ERCs首次在衰老酵母的核仁中被發(fā)現(xiàn)[11]。rDNA基因序列位于染色體1、12、13、14、15、21、22上，由150～200個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列組成[11-13]。DNA重復(fù)序列的存在，使核糖體DNA基因組具有不穩(wěn)定性[12]。在DNA復(fù)制過程中，DNA雙鏈斷裂可以通過同源重組來修復(fù)，同源重組修復(fù)缺失，導(dǎo)致ERCs的形成[13]。也有證據(jù)表明，酵母中核糖體DNA復(fù)制岔口停滯，從而形成ERCs[14]。在衰老的細(xì)胞中，ERCs的含量大量增加。研究發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞進(jìn)入衰老之前，ERCs的表達(dá)水平呈指數(shù)形式增加[11]。由此可見，ERCs的積累與酵母細(xì)胞衰老呈正相關(guān)。

1.4 微DNA(microDNA，miDNA)

miDNA最早在小鼠的大腦細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，曾被認(rèn)為是eccDNA的唯一存在形式[15]。miDNA長(zhǎng)度僅在200～400 bp之間[16]，主要來源于非重復(fù)基因組序列[17]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠組織及人類細(xì)胞系的基因組5′端、外顯子和CpG基因組中高度富集miDNA。miDNA中含有豐富的GC堿基對(duì)[18]。另外，在miDNA起始段和末端存在長(zhǎng)度為2 bp～15 bp的重復(fù)基因序列[15，17-18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miDNA的產(chǎn)生在一定程度上也與轉(zhuǎn)錄和RNA代謝有關(guān)[17]。Paulsen等[16]應(yīng)用LAMA(Ligase-assisted mini-circle accumulation)技術(shù)對(duì)人腫瘤細(xì)胞的miDNA進(jìn)行測(cè)序，并人工合成相應(yīng)的miDNA，進(jìn)行體內(nèi)外轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)其可以轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的miRNA，這一過程不依賴于經(jīng)典的啟動(dòng)子機(jī)制。不僅如此，miRNA可以發(fā)揮相應(yīng)的作用，通過調(diào)控下游靶基因的變化，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展[19]。

2 eccDNA的形成機(jī)制

2.1 損傷修復(fù)機(jī)制的缺失

正常細(xì)胞通過激活強(qiáng)勁的DNA損傷修復(fù)機(jī)制(DDR)途徑對(duì)DNA損傷做出反應(yīng)，每一種修復(fù)都通過不同的機(jī)制。在細(xì)胞周期的不同階段，至少有七種主要的DNA修復(fù)途徑——堿基切除修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)、錯(cuò)配修復(fù)(MMR)、同源重組(HR)和非同源端連接(NHEJ)、直接化學(xué)逆轉(zhuǎn)切除以及鏈間交聯(lián)(ICLs)修復(fù)，使細(xì)胞能夠修復(fù)DNA損傷[20]。BER和NER具有相對(duì)保真性，但大量堿基或核苷酸切除時(shí)，可能意外激活某種DNA聚合酶，引起堿基、核苷酸聚集，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度不一的eccDNA。NHEJ通路以一種靈活的方式利用蛋白質(zhì)識(shí)別、切割、聚合和連接DNA末端。但NHEJ的缺失極易引起DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs是最危險(xiǎn)的DNA損傷類型，因?yàn)镈SBs可以導(dǎo)致大的染色體結(jié)構(gòu)的游離丟失[21]，且存在產(chǎn)生eccDNA的可能。

2.2 DNA復(fù)制過程中出錯(cuò)

DNA復(fù)制過程中錯(cuò)誤地激活DNA聚合酶且在模板鏈上產(chǎn)生一個(gè)環(huán)形DNA分子，這個(gè)環(huán)被切除并形成一個(gè)圓形結(jié)構(gòu)，并在染色體上留下一個(gè)微小缺口[22]。DNA復(fù)制具有相對(duì)保真性，當(dāng)然這種出錯(cuò)的概率較小，但不排除產(chǎn)生eccDNA的可能。

3 eccDNA的研究新進(jìn)展

越來越多的研究表明，eccDNA在癌癥中異常表達(dá)且發(fā)揮重要作用。Kumar等[15]對(duì)23例惡性腫瘤患者(12例肺癌和11例卵巢癌)的血清及血漿樣本分析發(fā)現(xiàn)，12例肺癌患者中有8例，11例卵巢癌患者中有7例，即近三分之二的患者在腫瘤切除后血漿中miDNA長(zhǎng)度減少，原因可能是原位生長(zhǎng)的腫瘤釋放出更長(zhǎng)的miDNA進(jìn)入血液循環(huán)中。由于涉及倫理學(xué)，尚不能確定其余三分之一患者術(shù)后miDNA較術(shù)前長(zhǎng)是否與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[15]。Mehanna等[23]用甲氨蝶呤(MTX)和L-天冬酰胺酶(ASP)處理人淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(LCLs)誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡和DNA斷裂，然后提取miDNA并測(cè)序發(fā)現(xiàn)，兩種藥物治療的LCLs產(chǎn)生的miDNA數(shù)量顯著多于對(duì)照組，且在MTX組中這一現(xiàn)象更為明顯，表明化療可能影響miDNA的產(chǎn)生及表達(dá)。

文獻(xiàn)報(bào)道，使用中性二維(2D)凝膠電泳，通過與總基因組DNA或特定探針雜交后，可以區(qū)分典型的超卷曲分子、圓形及線性分子[3]。這使得在相對(duì)較小的總DNA樣本中識(shí)別環(huán)形分子，并便于eccDNA的結(jié)構(gòu)及功能研究。果蠅胚胎含有豐富的松弛的環(huán)形分子組成的eccDNA，約占總DNA含量的1%～2%。在通過研究果蠅衰老與eccDNA的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，果蠅的衰老并不伴隨eccDNA的積累；相反，它的水平可能會(huì)逐漸降低[24]。Tunner等[25]通過全基因組測(cè)序，結(jié)合癌癥基因組圖譜(TCGA)，分析13種不同的癌癥發(fā)現(xiàn)，所有擴(kuò)增癌基因均可以以eccDNA的形式存在。eccDNA的表達(dá)水平在不同類型的腫瘤中有所不同。在惡性膠質(zhì)瘤中，eccDNA陽性率較高；而在結(jié)腸癌和血液病中eccDNA陽性率較低[25]。

eccDNA除了在腫瘤組織中表達(dá)豐富外，在自然界生物體也存在環(huán)狀DNA，如乙型肝炎病毒(HBV)通過誘導(dǎo)DNA的前基因組RNA(pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，產(chǎn)生異常結(jié)構(gòu)的松弛環(huán)狀DNA(RC-DNA)。RC-DNA通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)化形成閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，進(jìn)而在體內(nèi)尤以在肝臟器官中表達(dá)顯著[26]。cccDNA 作為新興研究的治愈性靶點(diǎn)，在未來慢性乙型肝炎可能被治愈[27]。

此外，eccDNA與癌癥的耐藥密切相關(guān)。順鉑(DDP)耐藥是降低化療效果的重要因素，從而導(dǎo)致下咽鱗狀細(xì)胞癌(HSCC)局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Wu等[28]證實(shí)eccDNA上編碼的癌基因在腫瘤轉(zhuǎn)錄組中高度表達(dá)。Lin等[29]對(duì)HSCC細(xì)胞系FaDu和DDP抗性細(xì)胞系FaDu/DDP中eccDNA提取分析發(fā)現(xiàn)，DDP抗性細(xì)胞系FaDu/DDP存在大量的eccDNA；eccDNA上RAB3B基因過表達(dá)提高FaDu細(xì)胞對(duì)DDP的抗性，誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞的自噬，進(jìn)而促使HSCC耐藥。文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本的eccDNA中檢測(cè)出大量表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[30-31]，其易突變?yōu)榛钴S的變異體EGFRVⅢ[31]，而EGFRVⅢ對(duì)酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)不敏感，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)TKIs耐受，導(dǎo)致治療效果不佳。另外，eccDNA與宮頸癌的耐藥可能相關(guān)[32]。

4 小結(jié)與展望

目前，eccDNA的神秘面紗已逐漸被揭開，其在癌癥中的表達(dá)及重要作用等已逐漸顯現(xiàn)，但這只是冰山一角。以往對(duì)于癌癥的研究報(bào)道，多是基于染色體的基因進(jìn)行研究，而忽視了染色體外的基因，如eccDNA。另外，eccDNA也可以重新嵌合至染色體形成線性DNA，方式發(fā)生改變且進(jìn)一步發(fā)揮作用，這可能是臨床癌癥治療效果差強(qiáng)人意的重要原因之一。相信隨著研究的逐漸深入、數(shù)量的增多及相關(guān)技術(shù)的不斷成熟，eccDNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制會(huì)逐漸明晰，可為癌癥的早期診斷、治療提供更多的靶點(diǎn)和思路。