曲勃維， 劉莉萍， 魯浩， 李遇梅

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010107)

功能性黑素細(xì)胞的缺乏與破壞會(huì)導(dǎo)致色素脫失性疾病，其中最常見(jiàn)的疾病是白癜風(fēng)[1]。以白癜風(fēng)為代表的色素脫失性疾病尚無(wú)治愈方法，其治療結(jié)果通常不能令人滿意。黑素細(xì)胞移植是治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的方法之一，治療面積大、復(fù)色效果好、不良反應(yīng)的發(fā)生率較低，但自體黑素細(xì)胞難以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)和擴(kuò)增，因此難以滿足具有廣泛病變患者的治療需要[2]。通過(guò)再生醫(yī)學(xué)手段得到大量再生的黑素細(xì)胞并將其應(yīng)用于臨床研究將會(huì)極大地造福色素脫失性疾病的患者[3-4]。多能干細(xì)胞能夠無(wú)限增殖并可以向三個(gè)胚層分化，是細(xì)胞療法治療各種疾病與損傷的潛在來(lái)源[5]。多能干細(xì)胞也可經(jīng)誘導(dǎo)得到黑素細(xì)胞，F(xiàn)ang等[6]于2006年將人胚胎干細(xì)胞成功分化為黑素細(xì)胞，后續(xù)有研究報(bào)道使用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成擬胚體也能夠成功誘導(dǎo)黑素細(xì)胞[7-8]。

Wnt3a蛋白在多能干細(xì)胞向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過(guò)程中起重要作用，它可以直接誘導(dǎo)黑素細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的表達(dá)[9]，調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞特異性酶酪氨酸相關(guān)蛋白1 (TRP1)和酪氨酸酶(TYR) 的表達(dá)量[10]。此外，Wnt信號(hào)能夠調(diào)節(jié)黑色素生成[11]，通過(guò)抑制或刺激個(gè)體遷移前神經(jīng)嵴細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路，可觀察到缺乏 Wnt1和Wnt3a的小鼠幾乎完全沒(méi)有色素細(xì)胞[12]?；赪nt3a在黑素細(xì)胞發(fā)育中的重要作用，且純化的Wnt3a蛋白獲取成本非常高[13]，L-Wnt3a條件培養(yǎng)基作為Wnt3a蛋白的來(lái)源被應(yīng)用于黑素細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)[13-16]。L-Wnt3a條件培養(yǎng)基的傳統(tǒng)收集方案中對(duì)L-Wnt3a細(xì)胞的接種密度、收集的條件與時(shí)機(jī)以及其中含有的Wnt3a蛋白水平并不明確[13]。不同批次間細(xì)胞接種的密度如不相同，將會(huì)導(dǎo)致收集的L-Wnt3a條件培養(yǎng)基所含Wnt3a蛋白含量存在差異，會(huì)造成黑素細(xì)胞分化體系的不穩(wěn)定。

為了建立穩(wěn)定的分化體系，本研究利用ELISA法對(duì)不同細(xì)胞接種密度和不同采集時(shí)點(diǎn)的L-Wnt3a細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Wnt3a蛋白濃度進(jìn)行定量，優(yōu)化L-Wnt3a條件培養(yǎng)基的收集方案。使用含有明確Wnt3a濃度的L-Wnt3a條件培養(yǎng)基和Wnt3a重組蛋白作為多能干細(xì)胞向黑素細(xì)胞誘導(dǎo)體系中Wnt3a來(lái)源進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、主要試劑和儀器

L-Wnt3a細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC公司(CRL-2647TM)，胚胎干細(xì)胞株WA09細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)WiCell公司(WAe009-A)，多能干細(xì)胞株WTC-11細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)Coriell公司(GM25256)，依照江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理許可(AWYXLL20191119-2)分離人表皮黑素細(xì)胞。

低糖DMEM、胰酶、TrypLETM消化酶、胎牛血清、2-巰基乙醇、G-418及GlutaMAXTM(美國(guó)Gibco公司)，高糖DMEM、PBS、青霉素及鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司)，黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Science Cell公司)，佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯(PMA)、霍亂毒素、地塞米松、二甲基亞砜、明膠、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、維生素C、亞油酸-牛血清白蛋白及MCDB培養(yǎng)基(德國(guó)Sigma公司)，基質(zhì)膠(美國(guó)Corning公司)，纖維連接蛋白(美國(guó)BD Biosciences公司)，AccutaseTM消化酶(美國(guó)Innovative Cell Technologies公司)，擬胚體形成培養(yǎng)基、mTeSRTM培養(yǎng)基及ReLeSRTM消化酶(加拿大Stemcell Technologies公司)，干細(xì)胞因子、Wnt3a重組蛋白(美國(guó)RD公司)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子及Y-27632(日本W(wǎng)ako公司)，內(nèi)皮素-3(美國(guó)ENZO公司)，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

移液器吸頭、PCR管(美國(guó)Axygen公司)，離心管、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，ElplasiaTM細(xì)胞培養(yǎng)板(日本Kuraray公司)，0.22 μm濾器(美國(guó)Millipore公司)，加樣槽(中國(guó)Biosharp公司)。CCK-8檢測(cè)試劑(中國(guó)Vazyme公司)，ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)RD公司)，Hoechst染色試劑(中國(guó)Biosharp公司)，Masson-Fontana染色試劑盒(中國(guó)Solarbio公司)，TrizolTM(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR試劑盒(日本Takara公司)。37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速低溫離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀、生物安全柜及熒光定量 PCR 儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 培養(yǎng)基的配制

1.2.1 L-Wnt3a條件培養(yǎng)基的傳統(tǒng)收集方案 使用含0.4 mg/mL G-418 的10% 胎牛血清的高糖 DMEM 維持培養(yǎng)L-Wnt3a細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，使用 0.05%胰酶-EDTA消化細(xì)胞傳代，在顯微鏡下觀察到大多數(shù)細(xì)胞變圓時(shí)，加入含 10% 胎牛血清的高糖 DMEM中和胰酶終止消化；按照 1 ∶10 的比例接種細(xì)胞，培養(yǎng)4 d 在細(xì)胞接近100%融合時(shí)，收集第1批次上清液后使用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，然后在各培養(yǎng)皿中加入高糖 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，收集第2批次上清液后使用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾；將上述2批上清液等體積混合后保存待用。

1.2.2 明確Wnt3a濃度的條件培養(yǎng)基收集方案 當(dāng)L-Wnt3a細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%融合時(shí)，使用0.05%胰酶-EDTA消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，將細(xì)胞消化后得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照預(yù)先設(shè)置好的接種密度接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到達(dá)平臺(tái)期后，棄去培養(yǎng)上清液并加入新鮮的10 mL含1%胎牛血清的高糖DMEM；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，使用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，間隔48 h繼續(xù)重復(fù)收集上清液3次；用ELISA法測(cè)定上清液中Wnt3a蛋白的濃度；以上收集到的3份上清液即為明確Wnt3a濃度的L-Wnt3a條件培養(yǎng)基，保存待用。

1.2.3 黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基(明確Wnt3a濃度) 明確Wnt3a濃度的分化培養(yǎng)基，將第1混合溶液中的各試劑充分混合后使用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，注意避光操作；后添加第2混合溶液中的各個(gè)組分。第1混合溶液：10 mL MCDB 201培養(yǎng)基；1 μL 2.5 mmol/L 地塞米松；2.8 μL 3 mg/mL 霍亂霉素；2.5 μL 1 mmol/L PMA；100 μL 10 mg/mL 維生素C。第2混合溶液：一定量的明確Wnt3a濃度的條件培養(yǎng)基 (根據(jù)所需分化培養(yǎng)基濃度進(jìn)行計(jì)算)；一定量的低糖DMEM(根據(jù)添加明確Wnt3a濃度的條件培養(yǎng)基的量計(jì)算，兩者總體積確定為40 mL)；250 μL 10 μg/mL干細(xì)胞因子；50 μL 100 μmol/L內(nèi)皮素-3；50 μL 4 μg/mL堿性成纖維生長(zhǎng)因子；500 μL 亞油酸-牛血清白蛋白；500 μL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒；500 μL GlutaMAXTM。分化3周后，在不含PMA并補(bǔ)充有0.5%胎牛血清的黑素細(xì)胞特異性分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 L-Wnt3a細(xì)胞分泌Wnt3a蛋白相關(guān)檢測(cè)

1.3.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 使用CCK-8檢測(cè)試劑測(cè)定細(xì)胞活力：① 以96孔板為例，將待測(cè)細(xì)胞樣本進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；② 加入相應(yīng)不同處理方式的試劑到培養(yǎng)板的各孔中；③ 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；④ 吸棄原有培養(yǎng)液，使用PBS或相應(yīng)培養(yǎng)基漂洗樣本；⑤ 于避光條件下在每孔中加入含CCK-8溶液體積分?jǐn)?shù)為10%的新培養(yǎng)基，注意設(shè)置空白對(duì)照；⑥ 在培養(yǎng)箱中避光孵育2 h；⑦ 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本450 nm處光密度值。

1.3.2 Hoechst活細(xì)胞熒光染色 使用Hoechst 33342試劑進(jìn)行染色：① 準(zhǔn)備待測(cè)活細(xì)胞樣本，吸棄原有培養(yǎng)基；② 以35 mm培養(yǎng)皿為例，加入1 mL Hoechst 33342 染色液，充分覆蓋待測(cè)細(xì)胞；③ 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)20～30 min；④ 棄去染色液，使用常溫的PBS或培養(yǎng)液洗滌2～3次；⑤ 于熒光顯微鏡下觀察待測(cè)樣本。

1.3.3 ELISA法測(cè)定Wnt3a濃度 在室溫下按照Wnt3a ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：① 在微孔板中孵育捕獲抗體并封板過(guò)夜；② 吸棄各孔液體并用洗板液清洗，然后垂直拍干孔中水分，重復(fù)洗滌2次，循環(huán)3次；③ 加入封閉液封閉平板1 h；④ 重復(fù)步驟②；⑤ 以倍比稀釋的方法加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品封板孵育2 h；⑥ 重復(fù)步驟②。⑦ 加入檢測(cè)抗體封板孵育2 h；⑧ 重復(fù)步驟②；⑨ 加入Streptavidin-HRP B封板孵育20 min，避光；⑩ 重復(fù)步驟②，避光；配制底物溶液并加入孔內(nèi)孵育20 min，避光；加入終止溶液，并立即上機(jī)檢測(cè)，避光。

1.3.4 定量化分析 使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞圖像數(shù)字化處理，通過(guò)ELISACalc軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及數(shù)據(jù)計(jì)算。

1.4 多能干細(xì)胞向黑素細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)

1.4.1 多能干細(xì)胞的培養(yǎng) 接種多能干細(xì)胞至基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)皿中，添加終濃度為 10 μmol/L的Y-27632并十字搖勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)多能干細(xì)胞克隆足夠大時(shí)進(jìn)行傳代；使用ReLeSRTM消化酶，顯微鏡下觀察待克隆中央出現(xiàn)明顯裂隙時(shí)中止消化；加入 mTeSRTM培養(yǎng)基，輕輕吹打克隆使其變?yōu)樾F(tuán)塊，避免形成單細(xì)胞，將細(xì)胞接種于mTeSRTM培養(yǎng)基中，十字混勻后放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.4.2 單細(xì)胞制作擬胚體 無(wú)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的多能干細(xì)胞生長(zhǎng)到足夠大時(shí)，使用AccutaseTM消化酶消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察到大多數(shù)細(xì)胞變圓時(shí)，中和消化酶后加入1 mL AggreWellTM擬胚體形成培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)；以24孔ElplasiaTM板為例，每孔接種(2.5～5.0)×105個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)基2 mL；添加終濃度為 10 μmol/L的Y-27632后十字搖勻,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后可形成擬胚體，將其轉(zhuǎn)移至超低黏附培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.3 黑素細(xì)胞懸浮分化方案 當(dāng)擬胚體的直徑達(dá)300～400 μm時(shí)，可以開(kāi)始黑素細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：收集擬胚體，轉(zhuǎn)移至離心管中，等待其自然沉降后小心吸棄上清液；加入明確Wnt3a濃度的黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至超低黏附培養(yǎng)板中進(jìn)行懸浮誘導(dǎo)分化；每2～3 d進(jìn)行半量換液；在分化第14天時(shí)將擬胚體轉(zhuǎn)移至纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中,繼續(xù)使用明確Wnt3a濃度的黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基；在分化第21天時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞傳代，使用 TrypLETMExpress消化酶，收集細(xì)胞懸液離心后棄去上清液，使用明確Wnt3a濃度的黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中，每隔2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.4.4 誘導(dǎo)黑素細(xì)胞的培養(yǎng) 在細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代；使用TrypLETMExpress消化酶，收集細(xì)胞懸液后離心，使用黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中，每隔2～3 d更換培養(yǎng)基。

1.5 RT-PCR基因檢測(cè)

使用TRIzolTM提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。熱循環(huán)反應(yīng)：95 ℃持續(xù)30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。PCR反應(yīng)結(jié)束后，檢查確認(rèn)融解曲線及擴(kuò)增曲線，檢查運(yùn)行結(jié)果；以GAPDH作為對(duì)照，計(jì)算各目的基因的ΔCt值，計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

1.6 Masson-Fontana染色

使用Masson-Fontana染色試劑盒：① 4%多聚甲醛固定樣本15 min；② 加入氨銀溶液，在56 ℃孵育40 min，避光；③ 用純水清洗樣本，海波溶液處理5 min后用超純水清洗樣本；④ 使用95%乙醇-無(wú)水乙醇脫水，二甲苯處理后封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同接種密度獲取的培養(yǎng)上清液中Wnt3a蛋白濃度的比較

以6.25×103個(gè)/cm2(低)、1.25×104個(gè)/cm2(中)、2.50×104個(gè)/cm2(高)3個(gè)密度組分別接種L-Wnt3a細(xì)胞，接種48 h的細(xì)胞密度差異明顯，其中高接種密度組的細(xì)胞已完全融合(圖1)。以傳統(tǒng)方案收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，對(duì)收集到的上清液中Wnt3a蛋白總量定量分析結(jié)果表明，各組Wnt3a的分泌總量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，提示以不同密度接種L-Wnt3a細(xì)胞獲取的培養(yǎng)上清液中Wnt3a蛋白的濃度差異很大(圖2)。

圖1 顯微鏡下觀察不同接種密度的L-Wnt3a細(xì)胞在接種48 h的細(xì)胞狀態(tài)(×100)

圖2 不同接種密度的傳統(tǒng)法收集培養(yǎng)上清液中所含Wnt3a蛋白總量

2.2 L-Wnt3a 條件培養(yǎng)基收集參數(shù)的定量比較及方案優(yōu)化

中接種密度組的L-Wnt3a細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，培養(yǎng)1～4 d的L-Wnt3a細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，培養(yǎng)4 d后細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，且細(xì)胞的維持培養(yǎng)時(shí)間至少可達(dá)22 d。測(cè)定每24 h收集的培養(yǎng)上清液中Wnt3a蛋白濃度并計(jì)算分泌累計(jì)量，結(jié)果顯示培養(yǎng)1～4 d的細(xì)胞處于增殖期，Wnt3a蛋白分泌水平也逐漸升高；培養(yǎng)5～10 d的細(xì)胞處于平臺(tái)期，Wnt3a蛋白分泌量可維持在高水平；培養(yǎng)10 d后分泌量逐漸下降，但仍高于1～4 d的水平。說(shuō)明在細(xì)胞到達(dá)生長(zhǎng)平臺(tái)期后的6 d內(nèi)，Wnt3a蛋白在培養(yǎng)上清液中的分泌量較高且處于高效率分泌的水平，由此提示此時(shí)段可作為高效率收集L-Wnt3a細(xì)胞培養(yǎng)上清液的關(guān)鍵點(diǎn)位，按照“1.2.2”收集培養(yǎng)上清液的方案，于細(xì)胞到達(dá)平臺(tái)期后每隔2 d收集上清液，共收集3批。生長(zhǎng)曲線顯示高、中、低接種密度組分別在培養(yǎng)2、4、6 d進(jìn)入平臺(tái)期。Wnt3a蛋白的分泌情況顯示，3種接種密度收集得到的上清液在細(xì)胞到達(dá)平臺(tái)期后的6 d內(nèi)收集到的蛋白總量較高，遠(yuǎn)高于平臺(tái)期前收集到的蛋白總量，3種接種密度在其相對(duì)應(yīng)收集批次的Wnt3a蛋白分泌累計(jì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高接種密度組的收集方式用時(shí)最短。見(jiàn)圖3。

A：特定接種密度L-Wnt3a細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；B：不同時(shí)段L-Wnt3a細(xì)胞分泌Wnt3a蛋白到上清液中的情況；C： 3種接種密度L-Wnt3a細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；D：3種接種密度組以新型上清液收集方式獲得的Wnt3a總量比較

2.3 利用明確Wnt3a濃度的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)黑素細(xì)胞生成

使用10、50、100 ng/mL 3種濃度Wnt3a蛋白的黑素細(xì)胞分化培養(yǎng)基對(duì)胚胎干細(xì)胞株WA09及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株WTC-11細(xì)胞進(jìn)行黑素細(xì)胞的懸浮誘導(dǎo)分化，分化28 d時(shí)的結(jié)果顯示，各組最終得到的細(xì)胞在形態(tài)上都呈現(xiàn)樹(shù)突狀，與黑素細(xì)胞接近，且都具有較好的增殖能力；各組的分化細(xì)胞均高表達(dá)黑素相關(guān)基因MITF、PAX3、SOX10、PMEL、TYR，TYRP1及DCT，低表達(dá)SOX2及NANOG基因，幾乎不表達(dá)OCT4、LIN28、DNMT3B等多能干性基因(圖4)。分化42 d的Masson-Fontana染色結(jié)果顯示，與人表皮黑素細(xì)胞相比較，在誘導(dǎo)得到的細(xì)胞中能夠觀察到被染為黑色的黑色素(圖5)。以上結(jié)果驗(yàn)證了在新型的分化體系，即應(yīng)用了新型上清液收集方案的明確Wnt3a濃度的培養(yǎng)分化系統(tǒng)中，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞失去干細(xì)胞的特性，趨向成熟黑素細(xì)胞分化。

圖4 分化28 d時(shí)WA09、WTC-11分化組黑素

2.4 明確濃度的條件培養(yǎng)基與重組蛋白在黑素細(xì)胞誘導(dǎo)中的效價(jià)比較

使用Wnt3a濃度為50 ng/mL的條件培養(yǎng)基與相應(yīng)濃度的Wnt3a重組蛋白進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，分化21 d時(shí)各組均有黑素發(fā)育相關(guān)基因如MITF、PAX3、SOX10、PMEL、TYR、TYRP1及DCT的表達(dá)(圖6)。在分化后期對(duì)兩株多能干細(xì)胞分化的黑素細(xì)胞進(jìn)行Masson-Fontana染色，在條件培養(yǎng)基以及重組蛋白各組中均能觀察到被染為黑色的黑色素(圖7)。結(jié)果表明，明確Wnt3a濃度的條件培養(yǎng)基與相應(yīng)濃度的重組Wnt3a蛋白均可作為黑素細(xì)胞分化中Wnt3a蛋白的來(lái)源，能夠達(dá)到相似的效果。

圖6 分化第21天WA09、WTC-11

圖7 黑素細(xì)胞的功能鑒定(Masson-Fontana染色，×200)

3 討論

黑素細(xì)胞由神經(jīng)嵴發(fā)育而來(lái)，在人體中黑素細(xì)胞通過(guò)與周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞、組成表皮黑素單元并以黑素小體的形式傳遞黑色素，黑色素是保護(hù)皮膚抵御紫外線輻射損傷及形成膚色的重要基礎(chǔ)。通過(guò)多能干細(xì)胞分化來(lái)大量擴(kuò)增并替代治療白癜風(fēng)等功能性黑素細(xì)胞缺乏與破壞導(dǎo)致的疾病，有符合倫理要求、細(xì)胞來(lái)源廣泛、能夠大量擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)。而多能干細(xì)胞的分化是一個(gè)復(fù)雜和長(zhǎng)期的過(guò)程，不斷優(yōu)化分化方案、使多能干細(xì)胞分化的條件更為穩(wěn)定及可控是當(dāng)前研究的重點(diǎn)方向。

Fang等[6]在人胚胎干細(xì)胞分化為黑素細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中使用了L-Wnt3a條件培養(yǎng)基作為分化體系中Wnt3a蛋白的來(lái)源。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成擬胚體也能夠成功誘導(dǎo)黑素細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用較均一的擬胚體進(jìn)行三維黑素細(xì)胞分化較傳統(tǒng)方法具有更高的分化效率[17]，而形狀規(guī)則的、光滑的非囊性擬胚體與具有明亮或黑暗空腔的囊狀擬胚體相比，更易分化成黑素細(xì)胞[8]。

以上研究針對(duì)分化使用的生長(zhǎng)因子以及分化條件進(jìn)行探索，但并未對(duì)分化體系中提供Wnt3a蛋白來(lái)源的L-Wnt3a條件培養(yǎng)基制作條件進(jìn)行精密的控制。本研究通過(guò)對(duì)L-Wnt3a細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分時(shí)段收集培養(yǎng)上清液并利用ELISA法測(cè)定蛋白含量，對(duì)Wnt3a蛋白分泌水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。設(shè)計(jì)了不同于傳統(tǒng)方法[6，17-18]的明確了細(xì)胞接種密度、培養(yǎng)上清液按批次收取且不互相混合并標(biāo)定其濃度的新型收集方案。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的全程，這種細(xì)胞均能夠分泌Wnt3a蛋白，在生長(zhǎng)到達(dá)平臺(tái)期后的6 d內(nèi)，分泌Wnt3a蛋白的效率高于其他時(shí)段，與初始接種密度無(wú)關(guān)。這種方案在細(xì)胞接種8 d后即可收集3個(gè)批次、可用于后續(xù)研究的條件培養(yǎng)基，極大地提升了效率。

應(yīng)用于黑素細(xì)胞分化體系中的Wnt3a蛋白濃度如果不明確，會(huì)造成分化體系的不穩(wěn)定，從而對(duì)后續(xù)的多能干細(xì)胞來(lái)源的黑素細(xì)胞生成效率造成影響。使用本研究設(shè)立的明確Wnt3a濃度的黑素細(xì)胞懸浮誘導(dǎo)分化系統(tǒng)，能夠較穩(wěn)定地對(duì)胚胎干細(xì)胞株WA09及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞株WTC-11細(xì)胞維持分化并得到誘導(dǎo)黑素細(xì)胞。在分化過(guò)程中多能干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)并逐漸表達(dá)黑素相關(guān)基因，誘導(dǎo)得到的細(xì)胞具有與人表皮黑素細(xì)胞類似的樹(shù)突狀生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，Masson-Fontana染色陽(yáng)性提示有成熟的黑色素顆粒生成，提示明確Wnt3a濃度的黑素細(xì)胞懸浮誘導(dǎo)分化體系能夠成功得到誘導(dǎo)黑素細(xì)胞。使用L-Wnt3a條件培養(yǎng)基與Wnt3a重組蛋白作為分化培養(yǎng)基中的Wnt3a來(lái)源，均能夠?qū)芍甓嗄芨杉?xì)胞進(jìn)行黑素細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，從而得到誘導(dǎo)黑素細(xì)胞。

本研究建立的明確Wnt3a蛋白濃度的培養(yǎng)上清液收集方案操作簡(jiǎn)便、收集周期短并能應(yīng)用于多能干細(xì)胞誘導(dǎo)黑素細(xì)胞分化體系，進(jìn)一步減少黑素細(xì)胞再生過(guò)程中的未知因素。而Wnt3a蛋白作為重要的生長(zhǎng)因子，在其他類型細(xì)胞的再生中也是重要的研究方向，本研究可為其提供一定的參考與思路。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化的L-Wnt3a培養(yǎng)上清液收集方案能夠穩(wěn)定高效地獲取Wnt3a蛋白，應(yīng)用于明確Wnt3a蛋白濃度的多能干細(xì)胞黑素細(xì)胞分化體系，成功得到誘導(dǎo)黑素細(xì)胞，L-Wnt3a 條件培養(yǎng)基與重組Wnt3a蛋白在多能干細(xì)胞來(lái)源的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)中具有相似效價(jià)。