譚琳，NWE Ni Win Htet，2，陳償，PAN Zhiqiang

1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，?？?71101；

2.緬甸生物技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室，緬甸 皎施 05151；

3.中國科學(xué)院南海海洋研究所，熱帶海洋生物資源和生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；

4.美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局天然產(chǎn)物利用研究中心，美國 牛津 38677-1848

相容性溶質(zhì)是微生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種對抗外界不斷變化滲透壓的一類化合物［1］。四氫嘧啶類物質(zhì)是一類廣泛分布在嗜鹽菌和非嗜鹽菌中的相容性溶質(zhì)，具有極好的滲透壓保護(hù)功能［2-3］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶不僅是調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞滲透壓的物質(zhì)，還是細(xì)胞及大分子物質(zhì)的生物保護(hù)劑。四氫嘧啶可緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學(xué)試劑對蛋白、核酸、生物膜及整個細(xì)胞的毒害作用［4-6］，且能在人體皮膚保護(hù)［7-9］、抗炎癥治療［10-12］、緩解神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮作用［13］，因此在醫(yī)療、酶工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。由于天然微生物中四氫嘧啶含量很低，提取困難，同時四氫嘧啶僅含有1個手性碳原子，也難以通過化學(xué)方法合成［14］。目前四氫嘧啶的生產(chǎn)大多通過發(fā)酵具有四氫嘧啶合成能力的中度嗜鹽微生物獲得大量的四氫嘧啶。但此方法的缺點(diǎn)是，高鹽濃度下發(fā)酵對設(shè)備損耗較大導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，并且中度嗜鹽微生物不是常用的工業(yè)微生物菌種，生長慢、發(fā)酵周期長、最終產(chǎn)率低［15］。為了簡化這種復(fù)雜的生產(chǎn)工藝，目前將來源于嗜鹽菌中的四氫嘧啶合成基因簇ectABC轉(zhuǎn)入非嗜鹽菌，在非嗜鹽菌中重構(gòu)四氫嘧啶的合成通路。重組菌株在中度鹽離子濃度或者低鹽離子濃度脅迫下合成四氫嘧啶［16］。在本團(tuán)隊前期研究中，對一株來自南海珊瑚礁的新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2進(jìn)行了全基因組序列測定，通過antiSMASH軟件預(yù)測次級代謝產(chǎn)物基因簇，發(fā)現(xiàn)此細(xì)菌基因組中含有四氫嘧啶合成基因簇［17］。本研究旨在分離新的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，并在大腸桿菌BW25113中重構(gòu)四氫嘧啶的合成通路，通過優(yōu)化全細(xì)胞催化條件，為構(gòu)建四氫嘧啶高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、菌株限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ購自Biolabs公司（New England）；氨芐青霉素和1kb DNA Ladder購于生工生物（上海）有限公司。PrimeSTAR?Max DNA polymerase購自TaKaRa公司；四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司；菌株新喀里多尼亞弧菌CGJ02-2由中國科學(xué)院南海海洋研究所陳償研究員提供；pBAD載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliBW25113感受態(tài)購自上海維地生物公司。試驗(yàn)于2020年3月—2021年5月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器高速冷凍離心機(jī)（Thermo-Fisher，Sorvall legend Micro 21R）、恒溫?fù)u床（智誠，ZWY-2102）、電泳儀（Wix-EP600）、PCR儀（Ta-KaRa TP600）、凝膠成像系統(tǒng)（AlphaImager 2401）、納升液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Ekspertnano LC 425/Ultimate 3000/Q-trap 6500+AB sciex 6500+）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取將菌株CJG02-2用

2216E（海博生物公司）培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)過夜，常溫8 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，按照Ta-KaRa微生物基因組DNA提取試劑盒（TaKaRaMini-BEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Ver.3.0）操作步驟，提取基因組DNA。

1.2.2 四氫嘧啶合成基因簇ectABC的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)CGJ02-2全基因組測序結(jié)果，設(shè)計克隆ectABC基因簇的1對引物：EctF:5'-CTAGCTAGCATGATCACATCAGCACCTTGGGT C-3'和EctR：5'-CCGGAATTCTTAGTCAACGAGA GGATAAACACC-3'（下劃線部分別為NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pBAD均用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后通過T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，獲得的重組子用雙酶切鑒定，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析。提取測序正確克隆中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主BW25113感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 ectABC在大腸桿中的重組表達(dá)及鑒定將帶有重組質(zhì)粒pBAD ectABC的陽性克隆接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃過夜。取適量過夜培養(yǎng)物加入LB培養(yǎng)基中（1∶100），37℃培養(yǎng)3 h，使其OD600為0.6。然后將L-阿拉伯糖添加到細(xì)菌培養(yǎng)物中使其終濃度為0.1%，30℃220 r·min-1誘導(dǎo)6 h。收集1 mL細(xì)菌培養(yǎng)液，4℃6 000 r·min-1離心5 min。將細(xì)胞用50μL 1×SDS上樣緩沖液（BOSTER，AR1142）重新懸浮，并在沸水中煮10 min。然后將裂解液在12 000 r·min-1下離心10 min，取10μL上清液，用SDS-PAGE分析重組表達(dá)情況。陰性對照為未添加L-阿拉伯糖的重組菌株BW25113pBAD-ectABC培養(yǎng)產(chǎn)物和添加L-阿拉伯糖的菌株BW25113pBAD（空載體）培養(yǎng)產(chǎn)物。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，從凝膠上切取重組表達(dá)蛋白條帶，送上海交通大學(xué)分析測試中心，通過納升液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定其是否為ectA、ectB、ectC。

1.2.4 重組菌株全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶參照1.2.3中的方法將重組菌株進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)及L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，8 h后，以7 000 r·min-1、4℃離心10 min，收集細(xì)胞，用0.85%NaCl溶液洗滌兩次，然后再懸浮在含有100 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）、50 mmol·L-1天冬氨酸鈉、50 mmol·L-1KCl和100 mmol·L-1甘油的反應(yīng)混合物中，形成細(xì)胞懸浮液。使細(xì)胞懸液在30℃、120 r·min-1、24 h下進(jìn)行催化反應(yīng)。全細(xì)胞催化24 h完成后，9 000 r·min-1離心收獲上清，用0.45 mm濾膜過濾后用型號為BRUKER compact的電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜分析四氫嘧啶的產(chǎn)生。質(zhì)譜條件：掃描范圍為m/z 50-1300，霧化器壓力1.8 Bar，毛細(xì)管出口電壓500 V，毛細(xì)管電壓4 500 V，正離子化模式的電噴霧電離，碰撞能量7 eV，干燥氣溫度250℃。

1.2.5 全細(xì)胞催化的優(yōu)化為了獲得最佳的全細(xì)胞催化條件，在全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)中，首先對底物天冬氨酸濃度（50～300 mmol·L-1）進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，分析了不同濃度KCl（0～300 mmol·L-1）轉(zhuǎn)化液中四氫嘧啶的產(chǎn)率。然后在pH 7.0的情況下，比較了不同溫度（25～40℃）對四氫嘧啶生產(chǎn)的影響。在獲得最適溫度的基礎(chǔ)上，添加最適濃度底物和KCl，使生物轉(zhuǎn)化在pH 6.0～8.0條件下進(jìn)行，獲取最適pH反應(yīng)條件。所有的催化反應(yīng)在細(xì)胞密度OD600=5的條件下進(jìn)行，通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測四氫嘧啶的合成及其產(chǎn)量。HPLC分析檢測條件為：色譜柱waters XBridge Amide，3.5μm，流動相B（乙腈）∶C（水）=75∶25，柱溫30℃，波長210 nm。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC的克隆及重組表達(dá)載體構(gòu)建

以菌株CGJ02-2全基因組DNA為模板，EctF和EctR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物大小約為2 235 bp（圖1），與預(yù)期的ectABC基因簇大小一致。目的片段與載體連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽性克隆，雙酶切鑒定顯示重組質(zhì)粒中有2 235 bp左右的片段插入（圖2），測序后顯示四氫嘧啶合成基因簇ectABC的長度和序列與理論一致。

圖1 四氫嘧啶合成基因簇etcABC PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR of etcABC gene cluster for ectoine

圖2 重組質(zhì)粒pBADetcABC的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pBADetcABC by synthesis double restriction enzyme digestion

2.2 etcABC在大腸桿菌中的重組表達(dá)及鑒定

重組菌株BW25113pBAD-ectABC，經(jīng)0.1%L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)后，采用SDS-PAGE電泳鑒定細(xì)胞裂解液上清，發(fā)現(xiàn)與含有pBAD空載體的菌株誘導(dǎo)以及含有重組表達(dá)載體pBAD-ectABC菌株未誘導(dǎo)細(xì)胞裂解液上清相比，產(chǎn)生了3個重組蛋白（圖3）。其大小分別為15、40、13 kD左右，與ectA（20 kD）、ectB（45.9 kD）、ectC（14.8 kD）的理論值存在差異，可能的原因是某些親水性的氨基酸與SDS結(jié)合率低造成了重組蛋白在電場中的泳動發(fā)生了偏移［18］。進(jìn)一步應(yīng)用飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定了3個重組蛋白的分子量和氨基酸序列。結(jié)果顯示其肽段覆蓋率分別達(dá)94%、91%、74%。其相應(yīng)的分子量分別為20.1、45.9和14.8 kD，與ectA、ectB、ectC的分子量理論值一致。

圖3 SDS-PAGE分析ectA、ectB、ectC的重組表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis for the recombinant expression of ectA,ectB,ectC

2.3 重組菌株全細(xì)胞生產(chǎn)四氫嘧啶

利用高分辨質(zhì)譜鑒定重組菌株BW25113 pBAD-ectABC誘導(dǎo)后全細(xì)胞上清中的四氫嘧啶，以重組菌株未誘導(dǎo)全細(xì)胞上清為陰性對照，四氫嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照。結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)的重組菌株全細(xì)胞催化上清中，有一個化合物的分子量為143.079，分子式為C6H11N2O2。而標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為143.080 5，分子式為C6H11N2O2，這表明重組菌株能夠合成四氫嘧啶，并將其分泌到上清中。

圖4 四氫嘧啶的高分辨質(zhì)譜鑒定Fig.4 Identification of ectoine by high resolution mass spectrometry

2.4 天冬氨酸鈉濃度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

作為四氫嘧啶合成的底物，天冬氨酸的濃度是影響四氫嘧啶產(chǎn)量的重要因素。因此，首先研究了不同濃度天冬氨酸鈉對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖5所示，隨著天冬氨酸鈉濃度的升高，四氫嘧啶產(chǎn)量呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)天冬氨酸鈉濃度達(dá)100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產(chǎn)量最高，為0.86 mg·mL-1，與其他各濃度下生成的四氫嘧啶產(chǎn)量差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)天冬氨酸鈉濃度達(dá)到200 mmol·L-1時，四氫嘧啶產(chǎn)量逐步下降，當(dāng)天冬氨酸鈉濃度為300 mmol·L-1時，四氫嘧啶的產(chǎn)率僅為0.52 mg·mL-1。因此，天冬氨酸鈉的最佳濃度為100 mmol·L-1。

圖5 天冬氨酸鈉濃度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of sodiumasparpate concentration on the yield of ectione

2.5 KCl濃度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

由于KCl濃度對EctB活性的穩(wěn)定性有影響，試驗(yàn)分析了不同濃度KCl對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖6所示，隨著KCl濃度的提高，四氫嘧啶產(chǎn)量隨之升高，當(dāng)KCl濃度為100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產(chǎn)量達(dá)到最大值0.95 mg·mL-1。當(dāng)濃度大于100 mmol·L-1時，四氫嘧啶產(chǎn)量隨之降低。不同濃度KCl對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響差異顯著（P＜0.005），KCl的最佳濃度為100 mmol·L-1。

圖6 KCl濃度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.6 The effect of KCl concentration on the yield of ectione

2.6 溫度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

為了了解溫度對四氫嘧啶合成的影響，試驗(yàn)在最適天冬氨酸濃度和KCl濃度的基礎(chǔ)上，采用不同溫度對全細(xì)胞進(jìn)行催化。結(jié)果如圖7所示，25℃時，四氫嘧啶的產(chǎn)率較低，隨著溫度的提高，四氫嘧啶產(chǎn)量明顯升高，但隨之也呈現(xiàn)出下降趨勢。當(dāng)溫度為30℃，四氫嘧啶的產(chǎn)量最高，為0.94 mg·mL-1。雖然溫度為35℃時，四氫嘧啶產(chǎn)量與30℃時四氫嘧啶產(chǎn)量無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），考慮到能耗原因，選擇全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶的最佳溫度為30℃。

圖7 溫度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.7 The effect of temperature on the yield of ectione

2.7 pH對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

由于不同pH會影響酶活性，因此在確定最適底物濃度、KCl濃度、最適溫度的基礎(chǔ)上，探究了pH對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。如圖8所示，隨著pH的提高，四氫嘧啶產(chǎn)量同樣表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且大部分pH對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響差異顯著。當(dāng)pH為7.0時，四氫嘧啶產(chǎn)量最高，達(dá)1.11 mg·mL-1。然而pH高于7.5后產(chǎn)量下降，當(dāng)pH為8.0時，四氫嘧啶產(chǎn)量為0.8 mg·mL-1。因此，pH 7.0是全細(xì)胞催化生產(chǎn)四氫嘧啶的最適pH。

圖8 pH對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響Fig.8 The effect of pH on the yield of ectione

2.8 最適條件下四氫嘧啶產(chǎn)量

在 天 冬 氨 酸 濃 度100 mmol·L-1，KCl濃 度100 mmol·L-1，溫度30℃，pH7.0的最優(yōu)條件下，測得四氫嘧啶的產(chǎn)量為1.11 mg·mL-1。

3 討論

自發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶以來，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、酶工業(yè)、化妝品領(lǐng)域，國內(nèi)外的科學(xué)家們在其生物合成途徑及制備方法方面開展了大量的研究。目前，人們已經(jīng)從鏈霉菌、鹽單胞菌等多種嗜鹽菌中克隆了四氫嘧啶合成基因簇ectABC［18-21］，并且通過重組表達(dá)載體，將它們導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了四氫嘧啶在低鹽環(huán)境下的重新合成。但研究發(fā)現(xiàn)不同來源的ectABC通過重組表達(dá)后，合成四氫嘧啶的能力有顯著差異，如高波［22］從Streptomyces pactumAct12分離出ectABC，通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達(dá)，重組菌株的四氫嘧啶產(chǎn)量較低，僅為0.437 mg·mL-1。張欣［23］從HalomonasspQHL1中分離的ectABC也通過pET28a在大腸桿菌BL21中表達(dá)，四氫嘧啶產(chǎn)量達(dá)1.109 mg·mL-1。Schuben等［24］從Chromohalobacter salexigens中獲得ectABC，通過pASK-IBA7在大腸桿菌DH5α中表達(dá)，重組菌株四氫嘧啶合成量高達(dá)5.9 mg·mL-1。因此克隆新的四氫嘧啶合成基因簇，以探索其在異源宿主低鹽環(huán)境下四氫嘧啶的產(chǎn)量，仍是研究的熱點(diǎn)。

Naughton等［25］通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，包括新喀里多尼亞弧菌的10類弧菌中含有ectABC基因簇，但是從弧菌中克隆ectABC，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)及合成四氫嘧啶，尚未有報道。本研究從弧菌中獲得的四氫嘧啶合成基因簇ectABC，通過pBAD表達(dá)載體在BW25113中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，且在最佳全細(xì)胞催化條件下，當(dāng)細(xì)胞密度OD600為5時，獲得的重組菌株四氫嘧啶合成量為1.11 mg·mL-1。與一些高產(chǎn)四氫嘧啶菌株相比，本研究獲得的重組菌株四氫嘧啶產(chǎn)量略低，但要遠(yuǎn)高于高波［22］、魏偉偉［26］等構(gòu)建的ectABC重組菌株產(chǎn)量。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能是不同來源的嗜鹽菌中ectABC基因簇編碼ectA、ectB、ectC蛋白序列存在差異。序列分析顯示本研究中ectA、ectB、ectC與其他細(xì)菌來源ectA、ectB、ectC的同源性在60%以下，這可能導(dǎo)致重組表達(dá)的ectA、ectB、ectC蛋白酶活性存在差異，從而影響四氫嘧啶的合成。陳永濤等［27］的研究結(jié)果也顯示，不同來源的ectABC簇構(gòu)建的工程菌株生產(chǎn)四氫嘧啶，產(chǎn)量之間有顯著的差異。此外，全細(xì)胞催化時細(xì)胞密度對四氫嘧啶的合成也有影響。如He［28］等研究發(fā)現(xiàn)，將來自Halomonas elongata的ectABC通過全細(xì)胞催化，當(dāng)發(fā)酵罐中細(xì)胞密度OD600為5時，產(chǎn)量達(dá)到2.67 mg·mL-1，當(dāng)細(xì)胞密度OD600為20時，產(chǎn)量達(dá)到了25.1 mg·mL-1。因此，下一步將通過發(fā)酵罐來生產(chǎn)四氫嘧啶，并探討細(xì)胞密度對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響，同時也將開展分離純化實(shí)驗(yàn)，為工業(yè)化生產(chǎn)四氫嘧啶奠定基礎(chǔ)。