賈鑫，劉英琳，楊贊章，張丹，李明然，張銘連

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是眼科最常見的糖尿病并發(fā)癥，是中老年人視力障礙的主要原因之一[1-2]。DR 發(fā)病機制復(fù)雜，目前認(rèn)為其與炎癥、氧化應(yīng)激等多因素有關(guān)[3]。研究[4-5]表明，糖尿病患者的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致炎癥因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物產(chǎn)生過多，損傷血-視網(wǎng)膜屏障形成滲漏；隨著病程進(jìn)展，缺氧刺激促炎、促血管生成因子過度表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管生成，最終導(dǎo)致患者視力降低、甚至失明。張銘連教授在多年中醫(yī)眼科疾病臨床診療實踐中，基于絡(luò)病理論創(chuàng)立了止血明目方（ZXMM），用于治療DR取得了較好的臨床效果。本研究以ZXMM 干預(yù)實驗性DR 大鼠，觀察大鼠視網(wǎng)膜病理改變情況，檢測血清及視網(wǎng)膜中炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）、抗氧化酶類超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血管內(nèi)皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）水平，探討其治療DR 的作用機制，為該方的臨床應(yīng)用及中醫(yī)藥防治DR的研究工作提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只（80 只眼），體重（220±20）g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)于河北省眼科醫(yī)院實驗動物室，環(huán)境溫度22℃～24℃，相對濕度50%～60%，明暗交替，自由攝食飲水。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑、儀器與藥物

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma 公司，S0130），0.1 M 檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，C1013、G1121），羥苯磺酸鈣（calcium dobesilate，CD）膠囊（寧夏康亞藥業(yè)股份有限公司，H20110031），IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml102828V、ml003031V、ml059387 V、ml630359V）。

血糖測量儀及試紙（美國Johnson 公司，OneTouch Verio），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，CKX41），酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，RT-6100），低溫高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16gR），超低溫冰箱（美國Thermo公司，Thermo902）。

ZXMM 藥物由墨旱蓮、丹參、郁金、蒲黃、赤芍、牡丹皮、荊芥、夏枯草、川芎、三七、茜草炭組成，由河北省眼科醫(yī)院中藥房提供，藥材購自安國市盛方中藥飲片有限公司。經(jīng)水煎，濃縮為含生藥3.06 g/mL和4.59 g/mL的低、高劑量藥液。

1.3 DR模型的建立

40 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為正常組8 只（control group，CG）和DR 模型組32 只（model group，MG），采用單次腹腔注射STZ的方法建立糖尿病模型。禁食禁水8 h，STZ溶于0.1 M 檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），MG 大鼠腹腔注射1% STZ（45 mg/kg），CG 大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，注射后30 min 內(nèi)恢復(fù)自由攝食飲水。STZ 注射72 h 后，經(jīng)尾靜脈采血使用血糖測量儀和血糖試紙測定大鼠空腹血糖，選取血糖值≥16.7 mmol/L 者為糖尿病模型大鼠[6]，32只大鼠均造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后，對糖尿病大鼠進(jìn)行熒光素眼底血管造影檢查，根據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)選取發(fā)生視網(wǎng)膜病變的大鼠作為DR模型大鼠，共26只。

1.4 分組與給藥

選取24 只DR 大鼠隨機分組為MG、CD、ZXMM低劑量組（LZXMM）和ZXMM 高劑量組（HZXMM），另設(shè)正常大鼠為CG，每組6 只。LZXMM 和HZXMM 分別予濃度3.06 g/mL、4.59 g/mL 的ZXMM藥液10 mL/kg（30.6 g/kg、45.9 g/kg）灌胃，CD 給予羥苯磺酸鈣膠囊水溶劑0.135 g/kg 灌胃，CG 和MG 給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃30 d。

1.5 體重及血糖測定

給藥0 d、15 d、30 d 后，分別測量各組大鼠的體重，采用尾靜脈取血法經(jīng)血糖儀測定各組大鼠的血糖值。

1.6 樣本采集與處理

各組大鼠腹腔麻醉后迅速摘除雙側(cè)眼球，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗去除殘留血液。摘除的一側(cè)眼球置于4%多聚甲醛溶液中，室溫固定待檢；同一只大鼠的另一側(cè)眼球置于顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織，稱重后加入適量磷酸鹽緩沖液，低溫裂解組織，使用低溫離心機5,000 ×g 離心15 min，取上清液保存于-80℃冰箱內(nèi)待檢。同時，摘除眼球的大鼠經(jīng)眶靜脈采血，將收集于血清分離管的全血標(biāo)本室溫放置30 min，使用低溫離心機1,500×g 離心15 min，取血清保存于-80 ℃冰箱內(nèi)待檢。

1.7 HE染色

固定于4%多聚甲醛溶液的大鼠眼球常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟水洗，按照HE 染色試劑盒操作說明，依次進(jìn)行蘇木素染液染色、分化液分化、返藍(lán)液返藍(lán)和伊紅染色，之后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，置于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 血清與視網(wǎng)膜中相關(guān)因子的測定

血清與視網(wǎng)膜組織中IL-6、sICAM-1含量、SOD活性及VEGF-A 水平均采用ELISA 法測定，使用酶標(biāo)儀于波長450 nm 處測量各樣本的吸光度值，計算樣本的濃度。操作方法按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，當(dāng)P＜0.05時被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及血糖情況

CG 大鼠在飼養(yǎng)過程中，體重隨著周齡增大而逐漸增加，血糖均在正常范圍內(nèi)。5 組間大鼠體重和血糖值比較，給藥0 d 時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），給藥15 d 和30 d 時，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（體重：F15d=11.208，F(xiàn)30d=12.987；血糖：F15d=112.488，F(xiàn)30d=502.665，均P=0.000）。在給藥15 d和30 d 時，與CG 比較，MG、CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠體重均顯著減輕（15 d：tMG=4.270，P=0.002；tCD=6.045，P=0.000；tLZXMM=5.012，P=0.001；tHZXMM=7.344，P=0.000。30 d：tMG=4.621，P=0.001；tCD=7.465，P=0.000；tLZXMM=5.338，P=0.000；tHZXMM=7.712，P=0.000），血糖值均顯著升高（15 d：tMG=-18.996，tCD=-13.154，tLZXMM=-34.015，tHZXMM=-56.657，均P=0.000；30 d：tMG=-52.809，tCD=-34.659，tLZXMM=-39.717，tHZXMM=-49.120，均P=0.000）。結(jié)果表明，糖尿病大鼠模型建立成功，持續(xù)保持高血糖水平，而ZXMM 不影響糖尿病大鼠體重及血糖水平（表1）。

表1 各組大鼠體重及血糖變化（，n=6）

表1 各組大鼠體重及血糖變化（，n=6）

注：*與CG比較，P＜0.05；CG 正常對照組；MG 模型組；CD 羥苯磺酸鈣組；LZXMM 止血明目方低劑量組；HZXMM 止血明目方高劑量組

2.2 ZXMM對DR大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響

CG大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列均勻致密，形態(tài)無異常改變（圖1A）；與CG比較，MG大鼠視網(wǎng)膜變薄，細(xì)胞排列松散不規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)空泡樣改變（圖1B）。與MG比較，CD大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，各層細(xì)胞排列致密（圖1C）；LZXMM 和HZXMM 大鼠視網(wǎng)膜厚度增加，細(xì)胞排列基本規(guī)則，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多，表明ZXMM 對視網(wǎng)膜組織具有保護(hù)作用（圖1D、圖1E）。

圖1 止血明目方對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響（HE染色，×40）

2.3 ZXMM 對DR 大鼠血清和視網(wǎng)膜IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A水平的影響

5組間大鼠血清和視網(wǎng)膜IL-6、sICAM-1、SOD、VEGF-A 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（血清：FIL-6=21.828，F(xiàn)sICAM-1=21.713，F(xiàn)VEGF-A=19.092，F(xiàn)SOD=17.956，均P=0.000；視網(wǎng)膜：FIL-6=24.227，F(xiàn)sICAM-1=83.921，F(xiàn)VEGF-A=59.096，F(xiàn)SOD=37.982，均P=0.000）。

兩兩比較，①IL-6：與CG 比較，MG 大鼠血清和視網(wǎng)膜IL-6 水平升高（血清：t=-8.090，視網(wǎng)膜：t=-8.946，均P=0.000）；與MG 比較，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和視網(wǎng)膜IL-6水平降低（血清：tCD=6.445，tLZXMM=5.237，tHZXMM=7.190，均P=0.000。視網(wǎng)膜：tCD=6.067，P=0.000；tLZXMM=3.907，P=0.003；tHZXMM=8.004，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。②sICAM-1：與CG 比較，MG 大鼠血清和視網(wǎng)膜sICAM-1 水平升高（血清：t=-13.221，視網(wǎng)膜：t=-18.487，均P=0.000）；與MG 比較，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和視網(wǎng)膜sICAM-1 水平降低（血清：tCD=6.584，P=0.000；tLZXMM=4.301，P=0.002，tHZXMM=5.891，P=0.000。視網(wǎng)膜：tCD=7.522，tLZXMM=12.737，tHZXMM=14.507，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。③VEGF-A：與CG比較，MG 大鼠血清和視網(wǎng)膜VEGF-A 水平升高（血清：t=-7.135，視網(wǎng)膜：t=-20.695，均P=0.000）；與MG比較，CD 和HZXMM 大鼠血清和視網(wǎng)膜、LZXMM 大鼠視網(wǎng)膜VEGF-A 水平降低（血清：tCD=6.734，P=0.000；tHZXMM=4.243，P=0.002。視網(wǎng)膜：tCD=7.208，tLZXMM=5.620，tHZXMM=13.648，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。④SOD：與CG 比較，MG 大鼠血清和視網(wǎng)膜SOD 水平降低（血清：t=7.442，視網(wǎng)膜：t=10.718，均P=0.000）；與MG 比較，CD、LZXMM 和HZXMM 大鼠血清和視網(wǎng)膜SOD 水平升高（血清：tCD=-3.193，P=0.010；tLZXMM=-2.346，P=0.041；tHZMXX=-5.021，P=0.001。視網(wǎng)膜：tCD=-7.919，tLZXMM=-8.314，tHZMXX=-10.054，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 ZXMM對DR大鼠血清及視網(wǎng)膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A、SOD水平的影響（，n=6）

表2 ZXMM對DR大鼠血清及視網(wǎng)膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A、SOD水平的影響（，n=6）

注：*與CG 比較，P＜0.05；#與MG 比較，P＜0.05。IL-6 白細(xì)胞介素-6；sICAM-1 可溶性細(xì)胞間黏附分子-1；VEGF-A 血管內(nèi)皮生長因子-A；SOD 超氧化物歧化酶；CG 正常對照組；MG 模型組；CD 羥苯磺酸鈣組；LZXMM 止血明目方低劑量組；HZXMM 止血明目方高劑量組

3 討論

目前DR 的發(fā)病機制尚未完全明確，有觀點認(rèn)為炎癥因子的釋放和白細(xì)胞對毛細(xì)血管的異常黏附聚集是其發(fā)展的初始事件[7]。IL-6 是一種強效促炎因子，在機體炎性級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮核心作用。sICAM-1 是細(xì)胞黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的循環(huán)形式，可增加白細(xì)胞在毛細(xì)血管內(nèi)的黏附聚積。在高血糖狀態(tài)下，IL-6、sICAM-1 等炎癥因子大量釋放，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎性細(xì)胞活化聚集等，進(jìn)一步誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病理性新生血管形成[3]。VEGF 是一類特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控因子，其中VEGF-A 被認(rèn)為是引起血管滲漏及新生血管形成的關(guān)鍵介質(zhì)[8]。研究[9-10]證實，DR 患者血清IL-6、sICAM-1、VEGF 高表達(dá)，且其水平與視網(wǎng)膜病變程度呈正相關(guān)。氧化應(yīng)激是DR 的又一個主要致病因素。高血糖狀態(tài)亦加劇了機體氧化應(yīng)激程度，抗氧化防御系統(tǒng)功能降低，從而引起視網(wǎng)膜組織損傷[11]。SOD 是主要的內(nèi)源性抗氧化酶家族，其活性反映了機體與組織的抗氧化應(yīng)激能力[12]。

中醫(yī)藥在防治DR 早期發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)具有突出優(yōu)勢[13]。張銘連教授基于中醫(yī)絡(luò)病理論和中醫(yī)眼科專家龐贊襄“目病多郁論”學(xué)術(shù)思想提出了“目絡(luò)理論”，并以此為指導(dǎo)結(jié)合多年臨床診療經(jīng)驗創(chuàng)立了ZXMM，可有效改善DR 患者眼部微循環(huán)，顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜和玻璃體內(nèi)出血吸收，改善患者視力[14]。DR 中醫(yī)病機概括為“腎虛是根、陰虛為本、血瘀為標(biāo)”[15]，治療當(dāng)以涼血止血、滋補肝腎、活血化瘀為基本法則[16-17]。ZXMM 以墨旱蓮、三七為主藥進(jìn)行組方，墨旱蓮滋補肝腎、涼血止血，三七止血散瘀；輔以丹參疏通血脈，郁金、川芎行氣解瘀，赤芍清熱涼血，蒲黃、牡丹皮、荊芥等止血化瘀；佐以夏枯草、茜草炭平肝解郁，共奏滋陰止血、散瘀寧絡(luò)之功效，符合DR 疾病治療的法則。羥苯磺酸鈣作為一種血管保護(hù)藥物，臨床用于治療DR 或糖尿病腎病[18-19]。研究[20-21]表明，該藥可降低糖尿病大鼠炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，抑制視網(wǎng)膜血管白細(xì)胞黏附及VEGF 過表達(dá)，常作為糖尿病微血管并發(fā)癥治療藥物研究的陽性對照藥[22]。

本研究采用STZ 誘導(dǎo)DR 大鼠，發(fā)現(xiàn)與CG 相比，MG 大鼠血糖水平顯著升高，視網(wǎng)膜組織病理損傷明顯，血清及視網(wǎng)膜組織中抗氧化酶類SOD 活性顯著下降，炎癥因子IL-6、sICAM-1 及血管生長調(diào)控因子VEGF-A 水平均顯著升高。因此，嚴(yán)重的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是實驗性糖尿病大鼠發(fā)生視網(wǎng)膜病變的重要因素。藥物干預(yù)后，CD、LZXMM、HZXMM 大鼠視網(wǎng)膜病理損傷表現(xiàn)有所改善，血清及視網(wǎng)膜中SOD 活性較MG 升高，IL-6、sICAM-1 及VEGF-A 水平較MG 均降低，且HZXMM的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于LZXMM，提示ZXMM 能減少DR 大鼠體內(nèi)及視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量并增強其抗氧化應(yīng)激能力，緩解了炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。此外，本研究證實IL-6、sICAM-1、VEGF-A 水平在糖尿病大鼠血清和視網(wǎng)膜中均升高，且ZXMM 治療后其水平均降低，提示血清和視網(wǎng)膜中同一炎癥因子變化的相關(guān)性[23-24]。

綜上所述，ZXMM 能降低DR 大鼠血清和視網(wǎng)膜IL-6、sICAM-1、VEGF-A 水平，提高SOD 活性，抑制炎癥反應(yīng)并減輕氧化應(yīng)激損傷，有效改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜病理損傷。本研究初步探究了ZXMM的作用機制，為該方的臨床應(yīng)用以及中醫(yī)藥防治視網(wǎng)膜新生血管性疾病研究提供了實驗證據(jù)。