楊 雪，王 添，謝永麗,*，喬有明，陳海龍，陳 蘭，武玲玲

(1.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016；3.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

燕麥(Avenasativa)是一年生禾本科植物，植株高大，須根系發(fā)達(dá)，覆蓋面積廣，具有耐寒、耐鹽堿、抗旱等特點，適宜青藏高原獨特的自然地理環(huán)境，是治理草地退化的先鋒物種[1-2]。同時，燕麥的莖稈嫩而多汁，營養(yǎng)豐富，適宜青飼和曬制干草，是優(yōu)質(zhì)的飼草飼料，能夠解決青藏高原冬季家畜飼草短缺及營養(yǎng)不足的問題[3-5]。因此，燕麥對于高寒地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)都具有重要的意義。芽孢桿菌作為重要的植物根際促生菌[6]，可以通過產(chǎn)生植物激素[7]、增加植物對多種營養(yǎng)元素的吸收[8]、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[9]、與病原菌競爭生態(tài)位[10]等方式與寄主植物建立有益的互作關(guān)系，提高植物葉綠素、脯氨酸的含量，且增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展帶來了新的機(jī)遇[11]。因此，了解微生物-植物之間的互作機(jī)制，使有益菌能夠更好的適應(yīng)環(huán)境，對提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的應(yīng)用價值。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠從整體研究物種在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下基因的表達(dá)水平，并因其靈敏度高，能發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本等特點，為研究植物生長發(fā)育過程的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、食品營養(yǎng)和衛(wèi)生等多個領(lǐng)域[12]。因此，從植物響應(yīng)芽孢桿菌的角度了解促生機(jī)制，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析有助于更好地了解植物應(yīng)答根際促生菌信號傳導(dǎo)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。Sun等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌TR21通過調(diào)節(jié)JA(茉莉酸)和BRs(油菜素內(nèi)酯)生物合成途徑，提高香蕉植物對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的抗性，縮短生長期并增加香蕉的產(chǎn)量[13]。芽孢桿菌還可以提高植物對逆境脅迫的耐受能力，Samaras等報道稱枯草芽孢桿菌MBI600能夠激活水楊酸信號通路中的基因PR-1A和GLUA，茉莉酸/乙烯信號通路中的基因CHI3，LOXD，PAL等與防御機(jī)制相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果表明，在番茄植株上施用促生菌后激活了番茄系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)了對病原菌的抵抗能力[14]。

解淀粉芽孢桿菌DGL1分離自海拔3 010 m的大格勒干旱沙地白刺(N.tangutorum)根圍，具有較好的固氮活性和降解纖維素活性，且能夠抑制銳頂鐮孢病菌(Fusariumacuminatum)、瓜類枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)病菌，并發(fā)現(xiàn)菌株DGL1能夠顯著提高燕麥‘青燕1號’的發(fā)芽率、根長、芽長[15]，但其促生分子機(jī)制尚不清楚，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)初步探究芽孢桿菌DGL1對燕麥品種‘青燕1號’促生作用的調(diào)控機(jī)理，以期為芽孢桿菌菌肥促高寒牧草生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：燕麥(Avenasativa)品種為‘青燕1號’，由青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點實驗室提供。

供試菌株：解淀粉芽孢桿菌DGL1(B.amyloliquefaciens)保藏于-80℃超低溫冰箱。

1.2 DGL1菌懸液制備

采用三區(qū)劃線法將DGL1菌株接種于無菌的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h后，再將新長出的單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上(37℃，200 r·min-1)培養(yǎng)12 h，將發(fā)酵液離心收集菌體，用無菌水調(diào)整菌液細(xì)胞濃度為106cfu·mL-1，制成芽孢桿菌DGL1菌懸液[16]。

1.3 燕麥與DGL1菌懸液互作

挑選種皮完好、大小均等、無病蟲害的燕麥草種‘青燕1號’，將種子置于20% 次氯酸鈉溶液消毒處理30 min，無菌水反復(fù)沖洗5次后，播入滅菌營養(yǎng)土的穴盆中(30株·盆-1)，每3 d澆灌20 mL蒸餾水，培養(yǎng)條件為25℃，光周期16 h/8 h；將培養(yǎng)12 d的燕麥幼苗從穴盆中取出，分為5組，無菌水清洗根部數(shù)次，濾紙吸去根部水分；其中4組燕麥根部完全浸于細(xì)胞濃度為1×106cfu·mL-1的DGL1菌懸液中，建立燕麥與菌液DGL1的互作體系，互作時間為2 h，4 h，8 h，12 h，其余1組為燕麥根部浸于無菌水處理，作為CK對照組(圖1)。

圖1 燕麥根部與菌懸液互作

1.4 燕麥葉部RNA提取及測序文庫構(gòu)建

將互作2 h，4 h，8 h，12 h的燕麥植株分別從菌懸液取出，濾紙吸去根部液體；快速用滅菌剪刀剪斷葉部，分別用錫紙包好，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存待用，每一處理組3次重復(fù)。樣品委托上海美吉醫(yī)藥生物公司完成RNA提取、測序和文庫構(gòu)建。轉(zhuǎn)錄組測序試驗步驟如下：將燕麥葉部提取總RNA(5組樣品，每組3個重復(fù)，共15個樣品)，對提取到的15個樣品進(jìn)行RNA質(zhì)檢，將完整的mRNA片段化，將mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)成cDNA，隨后合成二鏈，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，最后上機(jī)測序[17]。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.5.1差異表達(dá)基因分析 運(yùn)用TopHat2軟件將測序數(shù)據(jù)與燕麥參考基因組序列進(jìn)行比對；使用DESeq2軟件對比較組間差異表達(dá)的基因進(jìn)行統(tǒng)計分析，默認(rèn)參數(shù)：p-adjust <0.05、|log2FC|≥1，以無菌水互作的燕麥組為對照，使用SeqPrep軟件進(jìn)行測序數(shù)據(jù)質(zhì)控。

1.5.2GO功能分析及KEGG富集分析 采用軟件Goatools進(jìn)行GO富集分析[18]，分析燕麥與菌株DGL1互作后的差異表達(dá)基因功能，利用KEGG[19]數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行富集分析，并分析基因的表達(dá)變化情況，本研究主要分析與促生相關(guān)差異基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本研究采用Illumina測序平臺完成轉(zhuǎn)錄組測序，對獲得的15個樣品的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行Q20，Q30質(zhì)量值進(jìn)行堿基準(zhǔn)確性的評估，共完成15個樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得220.87 Gb Clean Data，15個樣品的Clean Data均達(dá)到6.24 Gb以上，Q30在95.16%以上，表明數(shù)據(jù)測序錯誤率低，測序質(zhì)量較好。使用SeqPrep軟件去除掉接頭序列、低質(zhì)量、含N過多的reads，運(yùn)用TopHat2軟件將15個樣本分別與燕麥參考基因組序列進(jìn)行比對，比對率均大于86.68%，GC含量在54%～57%之間(表1)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 差異表達(dá)基因分析

將4個處理組b2(2 h互作組)、b4(4 h互作組)、b8(8 h互作組)、b12(12 h互作組)與對照組(CKb)比對。結(jié)果表明：隨著互作時間的增長，差異表達(dá)基因(DEGs)的數(shù)量也隨之增加，分別在互作2，4，8和12 h時篩選到1 894，6 130，8 033和12 215個差異表達(dá)基因。在互作2 h時，619個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，1 275個基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)；在互作4 h時，1 998個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，4 232個基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)；在互作8 h時，3 010個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，5 023個基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)；在互作12 h時，4 678個基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，7 537個基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)(圖2)。

圖2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計量匯總

通過差異表達(dá)維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，燕麥與芽孢桿菌互作4個不同時間處理組共有410個差異表達(dá)基因，b2(2 h互作組)與b4(4 h互作組)共有581個差異表達(dá)基因(圖3)，b8(8 h互作組)與b12(12 h互作組)共有3 248個差異表達(dá)基因，b4(4 h互作組)與b8(8 h互作組)共有1 843個差異表達(dá)基因，b2(2 h互作組)和b8(8 h互作組)共有686個差異表達(dá)基因，b2(2 h互作組)和b12(12 h互作組)共有746個差異表達(dá)基因(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計量匯總

2.3 差異表達(dá)基因GO富集分析

采用軟件Goatools對4個處理組的差異基因進(jìn)行GO富集，分別闡述互作2 h，4 h，8 h，12 h組中差異表達(dá)基因所參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分的信息。

互作2 h，在生物過程中，差異表達(dá)基因顯著富集在多胺分解代謝過程(GO:0006598)等與植物細(xì)胞代謝相關(guān)過程中；在細(xì)胞成分過程中，基因顯著富集在與膜的組成部分(GO:0016021)、胞間連絲(GO:0009506)、細(xì)胞連接(GO:0030054)等與植物細(xì)胞、細(xì)胞膜的形成相關(guān)過程中(圖4A)。

互作4 h，在生物過程中，基因顯著富集在光系統(tǒng)(GO:0006720)、對光刺激反應(yīng)(GO:0009416)、葉綠素生物合成(GO:0015995)相關(guān)過程中；在細(xì)胞過程中，基因顯著富集在與葉綠體類囊體膜(GO:0009535)、光系統(tǒng)II(GO:0009523)、光系統(tǒng)I(GO:0009522)相關(guān)過程中(圖4B)。

互作8 h過程中，在生物過程中，基因顯著富集在光合作用中光能的捕獲(GO:0009765)、植物細(xì)胞壁的生物合成(GO:0009832)有關(guān)過程中；在細(xì)胞過程中，基因顯著富集在與光系統(tǒng)I(GO:0009522)、細(xì)胞器膜的形成(GO:0031967)相關(guān)過程中；在分子功能過程中，基因顯著富集在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性(GO:0008964)、四吡咯結(jié)合(GO:0046906)相關(guān)過程(圖4C)。

互作12 h，在生物過程中，基因顯著富集在硫胺素生物合成(GO:0052837)、多胺分解代謝(GO:0006598)等與植物的生長發(fā)育以及脅迫相關(guān)的代謝過程；在細(xì)胞組分中，基因顯著富集在與葉綠體膜間隙形成(GO:0031972)、質(zhì)體膜間隙(GO:0009529)等與植物細(xì)胞、細(xì)胞器、膜相關(guān)的過程；在分子功能中，基因顯著富集在蘇氨酸醛縮酶活性(GO:0004793)、蘋果酸合酶活性(GO:0004474)等與植物催化活性相關(guān)的過程中(圖4D)。

圖4 GO功能分類結(jié)果圖

綜上所述，芽孢桿菌DGL1與燕麥根部互作，主要影響燕麥葉部細(xì)胞光合器官結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、光合碳同化、氨基酸代謝等途徑以此調(diào)控燕麥的生長發(fā)育[20]?；プ? h時，差異表達(dá)基因顯著富集在多胺分解代謝過程，多胺與植物生長發(fā)育和外界環(huán)境的脅迫反應(yīng)密切相關(guān)，推測DGL1可以誘導(dǎo)多胺分解代謝，從而促進(jìn)燕麥的花器官、根的形成，提高環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力；互作4 h，差異基因顯著富集在與光合作用相關(guān)的代謝通路中，預(yù)測DGL1能夠促進(jìn)葉綠體膜等細(xì)胞器膜、光合色素、光系統(tǒng)等的合成，加快光合速率，積累光合產(chǎn)物?；プ? h時，差異基因顯著富集在與光合作用、細(xì)胞壁、細(xì)胞器膜的合成過程中，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxyki-nase，PEPC)是參與C4碳同化途徑中固定CO2的酶[21]，推測DGL1可能通過促進(jìn)燕麥PEPC酶的活性，促使C3植物燕麥進(jìn)行一定程度的C4碳同化方式“濃縮”CO2，提高燕麥的光合效率，此外，推測燕麥通過PEPC酶促進(jìn)草酰乙酸，為保衛(wèi)細(xì)胞提供蘋果酸，增強(qiáng)環(huán)境脅迫耐受性?；プ?2 h時，差異基因顯著富集在硫胺素、多胺等與生物脅迫及非生物脅迫響應(yīng)方面，蘇氨酸醛縮酶主要參與植物氮素代謝[22]，預(yù)測DGL1能夠通過提高蘇氨酸醛縮酶活性，增加蛋白質(zhì)的含量，提高燕麥產(chǎn)量。

2.4 KEGG富集分析

為了進(jìn)一步探究菌株DGL1促燕麥生長的分子機(jī)制，將4個處理組的差異基因富集到KEGG數(shù)據(jù)庫。分析結(jié)果表明：互作2 h，差異基因顯著富集在β-丙氨酸代謝途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑、甘油脂代謝途徑、鞘脂代謝途徑、類胡蘿卜素生物合成途徑等(圖5A)；互作4 h，差異基因顯著富集在光合作用-天線蛋白代謝途徑、卟啉和葉綠素代謝途徑、β-丙氨酸代謝途徑、氰基氨基酸代謝途徑、光合生物中的碳同化途徑(圖5B)；互作8 h，差異基因顯著富集在光合作用-天線蛋白代謝途徑、植物晝夜節(jié)律途徑、β-丙氨酸代謝途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑、硫胺素代謝等(圖5C)；互作12 h，差異基因顯著富集到植物晝夜節(jié)律途徑、β-丙氨酸代謝途徑、硫胺素代謝途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑、α-亞麻酸代謝途徑等(圖5D)。

圖5 差異基因Pathway富集結(jié)果

KEGG富集分析表明，燕麥植株與芽孢桿菌DGL1互作，燕麥葉片組織的代謝通路發(fā)生了顯著的變化。差異表達(dá)基因主要富集在精氨酸、甘油脂等與氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、多胺合成等相關(guān)途徑中，推測DGL1促進(jìn)燕麥蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的合成及代謝，促進(jìn)燕麥的生長發(fā)育并增強(qiáng)逆境脅迫抗逆性；在互作4 h，8 h時，基因顯著富集在光合作用-天線蛋白代謝、卟啉和葉綠素代謝等與光合作用相關(guān)的代謝通路中，推測DGL1通過促進(jìn)燕麥的光合作用，積累碳水化合物、有機(jī)酸等光合產(chǎn)物，促進(jìn)燕麥的生長。

2.5 燕麥應(yīng)答DGL1相關(guān)代謝通路分析

2.5.1植物激素信號通路分析 植物激素作為胞間信號調(diào)控植物整個生命周期的生長和發(fā)育，并在多種非生物脅迫響應(yīng)中扮演著重要的角色[23-24]。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌DGL1與燕麥互作2 h，4 h，8 h，12 h，誘導(dǎo)了燕麥葉部色氨酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、光合作用-天線蛋白通路、苯丙氨酸代謝、茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因差異表達(dá)。篩選出位于細(xì)胞膜上的生長素早期響應(yīng)AUXI蛋白、Aux/IAA蛋白的編碼基因在菌株DGL1的作用下，在4個處理組中均上調(diào)表達(dá)，推測芽孢桿菌DGL1可通過誘導(dǎo)燕麥IAA的形成，促進(jìn)燕麥細(xì)胞的分裂、根的伸長、以及果實的發(fā)育。

茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心受體編碼基因COI1在互作2 h上調(diào)2.5倍，互作4 h上調(diào)3.1倍，互作8 h上調(diào)5.7倍，互作12 h上調(diào)3.6倍；推測菌株DGL1促進(jìn)了燕麥的茉莉酸介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。已有相關(guān)報道稱，茉莉酸代謝途徑能夠誘導(dǎo)促分裂原活化蛋白激酶(MAP)級聯(lián)反應(yīng)，鈣通道以及與乙烯、水楊酸和脫落酸相關(guān)激素代謝通路之間的相互作用，提高對逆境的抵抗能力[25]。

類胡蘿卜素通過將吸收的光能傳遞到反應(yīng)中心葉綠素a分子來促進(jìn)光合作用，可以擴(kuò)展光合作用過程中的吸收光譜，同時具有保護(hù)強(qiáng)光傷害的功效，通過散熱以保護(hù)膜和蛋白質(zhì)免受紫外線的傷害，還為脫落酸的生物合成提供底物[26-28]。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，菌株DGL1誘導(dǎo)燕麥ABA受體蛋白編碼基因PYL4基因在互作2 h，4 h，8 h，12 h均上調(diào)表達(dá)，而ABA的合成能夠有效地調(diào)節(jié)植物種類胡蘿卜素的合成，據(jù)鄧昌哲等[29]報道，外源噴施脫落酸，能夠使木薯葉片中胡蘿卜素含量升高，且涉及類胡蘿卜素合成基因上調(diào)表達(dá)，因此，推測菌株DGL1能夠促進(jìn)燕麥中PYL4基因上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)類胡蘿卜素代謝通路，從而促進(jìn)燕麥對光能的轉(zhuǎn)化與吸收，促進(jìn)光合作用，提高生物量。

2.5.2次生代謝產(chǎn)物通路分析 苯丙烷類生物代謝途徑是合成植物生長發(fā)育所需要的黃酮、木質(zhì)素、花青素等次生代謝產(chǎn)物主要方式之一，參與植物細(xì)胞分化，色素、細(xì)胞壁的形成等生理過程[30]。芽孢桿菌DGL1與燕麥互作，誘導(dǎo)燕麥葉部的苯丙烷生物代謝途徑，發(fā)現(xiàn)該通路的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶編碼基因PAL在4個處理組均上調(diào)表達(dá)，作為苯丙烷類生物代謝中最重要的酶，其活性的高低能夠成為衡量植物抗病性的指標(biāo)[31]，因此，推測菌株DGL1通過促進(jìn)合成苯丙氨酸解氨酶，從而促進(jìn)次生代謝物的合成，誘導(dǎo)了燕麥的抗病能力，間接促進(jìn)了燕麥的生長。

2.5.3光合作用相關(guān)通路分析 光合作用-天線蛋白通路途徑檢測到光系統(tǒng)Ⅰ中的光合蛋白編碼基因Lhca1，Lhca2，Lhca3，Lhca4，與光系統(tǒng)Ⅱ中的捕光色素蛋白編碼基因Lhcb1，Lhca2，Lhcb3，Lhcb4，Lhcb5，Lhcb6均上調(diào)表達(dá)。捕光色素蛋白在光能的捕獲、傳遞、分配兩個光系統(tǒng)PSI和PSII中的能量平衡，還能維持光合作用主要細(xì)胞器膜類囊體膜的結(jié)構(gòu)[32](圖6)，推測DGL1能夠通過誘導(dǎo)燕麥細(xì)胞葉綠體中光合鏈相關(guān)組分及光系統(tǒng)中相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)，穩(wěn)定和增強(qiáng)葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)燕麥光合性能、提高光合速率，促進(jìn)燕麥生物量的增加。

圖6 差異基因Pathway富集結(jié)果

2.6 促生相關(guān)基因分析

芽孢桿菌DGL1與燕麥互作，篩選出多個與促生相關(guān)差異表達(dá)基因顯著上調(diào)。

2.6.1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答 生物及非生物脅迫應(yīng)答方面，合成絲氨酸/蘇氨酸的蛋白磷酸酶基因PP2C在4個處理組均過度表達(dá)，在互作2 h上調(diào)7.9倍，互作4 h上調(diào)4.2倍，互作8 h上調(diào)6.8倍，互作12 h上調(diào)5.4倍；已有研究表明PP2C蛋白在植物激素ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要的作用，能夠參與調(diào)控種子萌發(fā)、營養(yǎng)器官發(fā)育以及增加植物抗逆性[33]。絲裂原活化蛋白激酶MAPKKK27表現(xiàn)出在互作2 h上調(diào)6.6倍，互作4 h上調(diào)7.1倍，互作8 h上調(diào)6.8倍，互作12 h上調(diào)8.3倍，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，MAPK級聯(lián)激活調(diào)控植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與多種生物、非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[34]。編碼細(xì)胞色素b5蛋白的基因Cytb5在互作2 h上調(diào)1.1倍，互作4 h上調(diào)1.0倍，互作8 h上調(diào)1.6倍，互作12 h上調(diào)2.3倍，細(xì)胞色素b5蛋白是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的血紅素蛋白，能夠參與植物細(xì)胞中的各種氧化還原反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)活性氧(ROS)的平衡，提高植物抗逆境脅迫能力[35]。

2.6.2糖類代謝 在糖類代謝方面，調(diào)控多糖β-葡聚糖合成的CSLH基因在4個處理組均上調(diào)表達(dá)，互作2 h上調(diào)1.3倍，互作4 h上調(diào)1.1倍，互作8 h上調(diào)1.8倍，互作12 h上調(diào)1.9倍；編碼葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的基因glgC互作2 h上調(diào)1.8倍，互作4 h上調(diào)3.1倍，互作8 h上調(diào)3.0倍，互作12 h上調(diào)3.1倍(圖7)。

圖7 差異基因Pathway富集結(jié)果

2.6.3氮素代謝、生長發(fā)育 此外，氮素代謝、生長發(fā)育相關(guān)的基因顯著上調(diào)。植物氮同化代謝中起到重要作用的編碼銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AMT在4個處理組中均上調(diào)表達(dá)，在互作2 h上調(diào)1.7倍，互作4 h上調(diào)2.2倍，互作8 h上調(diào)2.3倍，互作12 h上調(diào)1.6倍；位于細(xì)胞膜上的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠促進(jìn)植物對氮素的吸收，提高植物的產(chǎn)量[36]。合成胼胝質(zhì)合成酶的編碼基因CALS2互作2 h上調(diào)6.4倍，互作4 h上調(diào)6.1倍，互作8 h上調(diào)6.4倍，互作12 h上調(diào)7.1倍；胼胝合成酶在花粉發(fā)育和植物營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸具有重要的作用。

綜上所述，芽孢桿菌DGL1誘導(dǎo)了燕麥體內(nèi)PP2C,MAPKKK27,Cytb5基因的表達(dá)，這些蛋白質(zhì)與植物應(yīng)答生物、非生物脅迫的耐受反應(yīng)相關(guān)，因此，推測這些蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)可能會增加燕麥對環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)能力；基因CSLH，glgC與植物β-葡聚糖、淀粉的合成相關(guān)，推測這些多糖編碼基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能會增加燕麥體內(nèi)儲存的養(yǎng)分，為燕麥細(xì)胞正常生命活動提供能源；基因AMT與銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成相關(guān)，因此，AMT的誘導(dǎo)表達(dá)可能增加燕麥對氮素的營養(yǎng)吸收，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成；胼胝質(zhì)合成酶是存在植物細(xì)胞壁上的特殊成分，能夠調(diào)節(jié)胞間營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，DGL1誘導(dǎo)基因CALS2上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)了燕麥細(xì)胞間的運(yùn)輸能力，為生長發(fā)育輸送更多的營養(yǎng)物質(zhì)。

3 討論

在生長發(fā)育過程中，植物根系與根際促生菌PGPR保持著共生關(guān)系，植物為微生物生存與繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，微生物也通過直接和間接作用促進(jìn)植物生長，增加植物對生物和非生物脅迫的適應(yīng)能力[37]。解淀粉芽孢桿菌DGL1能夠促進(jìn)冷地早熟禾(Poacrymophila)、燕麥(Avenasativa)、紫羊茅(Festucarubra)等植物生長，并對多個植物病原真菌具有拮抗活性[38]。為了探究芽孢桿菌DGL1促燕麥生長的分子機(jī)制，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析DGL1與燕麥互作后，燕麥葉片對菌株的應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果表明，互作后差異基因主要富集在影響燕麥細(xì)胞生長發(fā)育、代謝、光合作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御反應(yīng)等相關(guān)途徑中。

據(jù)報道，芽孢桿菌可通過產(chǎn)生植物生長類激素供給宿主來促進(jìn)植物生長，或者通過調(diào)節(jié)宿主植物的生長類激素相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐逆性[39]。菌株DGL1與燕麥互作后，燕麥色氨酸代謝途徑中Aux/IAA編碼基因上調(diào)表達(dá)，Aux/IAA編碼的蛋白能夠與生長素響應(yīng)因子ARF結(jié)合，調(diào)節(jié)植物生長素編碼基因的表達(dá)[40]，促進(jìn)燕麥的生長發(fā)育。在茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，COI1基因在4個處理組均上調(diào)表達(dá)，COI1蛋白是茉莉素受體復(fù)合體核心成員，具有調(diào)控植物發(fā)育與誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的重要作用，該蛋白的缺失及突變將導(dǎo)致茉莉酸轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的受阻[41]。王文靜等發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜COI1蛋白功能缺失將導(dǎo)致花絲、花藥發(fā)育受損，出現(xiàn)雄性不育系的表型[42]。菌株DGL1還能夠激活燕麥葉部細(xì)胞中類胡蘿卜素代謝通路，通過合成光和色素促進(jìn)燕麥對光能的吸收、傳遞及轉(zhuǎn)化，促進(jìn)燕麥的光合作用，提高生物量。

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，燕麥葉中編碼銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因AMT在4個處理組中均上調(diào)表達(dá)，可通過表達(dá)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提高燕麥對外界環(huán)境中銨態(tài)氮的吸收，增加對氮素的利用率；吳賢鑫等發(fā)現(xiàn)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過促進(jìn)氮同化和乙烯信號傳導(dǎo)來增加水稻對鞘枯病的抵抗力[43]，因此推測基因AMT的上調(diào)表達(dá)，能夠促進(jìn)燕麥對氮素的吸收利用，從而促進(jìn)生長發(fā)育，并提高耐逆境脅迫能力。在次級代謝物的生成途徑中，植物根系能夠分泌經(jīng)苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的次級代謝物改變土壤微生物的菌群生態(tài)，從而促進(jìn)植物生長，提高植物抵抗不利環(huán)境的適應(yīng)能力[44]。經(jīng)過菌株DGL1的處理，燕麥葉部的丙氨酸解氨酶編碼基因PAL在4個處理組均上調(diào)表達(dá)，丙氨酸解氨酶是參與木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，在防御病害、維持植物直立、輸送水分及營養(yǎng)物質(zhì)具有重要的作用，在植物受到低溫脅迫時，丙氨酸解氨酶也能夠誘導(dǎo)黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)生以緩解氧化損傷，從而抵御低溫傷害[45]。在糖類代謝方面，調(diào)控多糖β-葡聚糖合成的CSLH基因、編碼葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的基因glgC均上調(diào)表達(dá)，趙凱琴等報道稱glgc基因轉(zhuǎn)入油菜基因組并成功表達(dá)，能夠促進(jìn)油菜(Brassicanapus)種子中多糖淀粉的積累[46]；崔雪瓊等報道重組glgc基因能夠增加馬鈴薯塊莖中淀粉的含量[47]。推測菌株DGL1通過誘導(dǎo)CSLH，glgc基因的表達(dá)，促進(jìn)燕麥多糖的合成，積累能源物。

通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因顯著富集在光系統(tǒng)、對光刺激反應(yīng)、葉綠素生物合成及葉綠體類囊體膜等與光合作用相關(guān)的途徑中，并發(fā)現(xiàn)在光合作用-天線蛋白通路中光系統(tǒng)Ⅰ中的光合蛋白編碼基因Lhca1，Lhca2，Lhca3，Lhca4，與光系統(tǒng)Ⅱ中的補(bǔ)光色素蛋白編碼基因Lhcb1，Lhca2，Lhcb3，Lhcb4，Lhcb5，Lhcb6均上調(diào)表達(dá)。因此，推測菌株DGL1能夠通過促進(jìn)燕麥葉部的光合作用實現(xiàn)光能的轉(zhuǎn)換，并將無機(jī)物轉(zhuǎn)換為有機(jī)物，促進(jìn)燕麥的生長，這與報道過的芽孢桿菌能夠促進(jìn)植物光合作用的結(jié)論一致，史應(yīng)武等發(fā)現(xiàn)接種芽孢桿菌菌劑S-7后，使得甜菜葉片氣孔導(dǎo)度、凈光合速率、蒸騰速率等指標(biāo)顯著提高[48]。同時有報道稱，有益芽孢桿菌能夠減少葉綠體中活性氧的含量，增加抗氧化酶類含量，減輕植物在逆境脅迫中產(chǎn)生過多的活性氧造成對葉綠體的損傷，以此保護(hù)植物光合效率[49-50]。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過RNA-Seq分析芽孢桿菌DGL1與燕麥不同互作時間燕麥葉部差異表達(dá)基因及相關(guān)代謝通路，探究了芽孢桿菌促進(jìn)燕麥生長的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌參與調(diào)控與燕麥生長、應(yīng)答脅迫反應(yīng)、參與光合作用相關(guān)蛋白的編碼基因，同時營養(yǎng)吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因在不同互作時間發(fā)生了差異表達(dá)，推測菌株DGL1對燕麥的促生機(jī)制是通過促進(jìn)燕麥光合作用、激素代謝、次生代謝物合成、氨基酸代謝等多個途徑相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，本研究為青藏高原極端生境根際促生菌促燕麥生長提供了理論基礎(chǔ)。