于桂芳， 胡軍華， 周 茆， 王星星， 吳 云， 王振中， 肖 偉

(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

參蒲盆炎顆粒由黨參、大血藤等10味藥材組成，具有益氣活血、清利濕熱、通絡(luò)止痛之功效，用于氣滯血瘀，濕熱內(nèi)阻型盆腔炎性疾病后遺癥[1-2]。方中黨參、大血藤、蒲公英、菝葜為君藥，虎杖、皂角刺為臣藥，其余為佐藥，全方藥味較多，成分復(fù)雜，但現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)僅有臣藥、佐藥中的2種成分，不利于對(duì)其工藝及產(chǎn)品進(jìn)行全面評(píng)價(jià)；孫仙玲等[3]在現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了延胡索乙素，并對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了初步探索，但均未涉及參蒲盆炎顆粒多成分含量同時(shí)測(cè)定的方法。

對(duì)于中藥復(fù)方制劑而言，各成分含量的綜合測(cè)定可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮參蒲盆炎顆粒中各藥味活性成分與制劑的相關(guān)性，以及制劑實(shí)際情況，結(jié)合2020年版《中國(guó)藥典》[6]及文獻(xiàn)[7-22]，建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B的含量，可使方中君藥、臣藥、佐藥均得到控制，而操作簡(jiǎn)便快速，對(duì)全面控制該制劑質(zhì)量具有一定的參考意義。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配置DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；XP6型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BSA224S-CW型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-201605，純度90.8%)、丹參素鈉(批號(hào)110855-201614，純度98.1%)、原兒茶酸(批號(hào)110809-201205，純度99.9%)、紅景天苷(批號(hào)110818-201708，純度98.8%)、原兒茶醛(批號(hào)110810-201608，純度99.3%)、綠原酸(批號(hào)110753-201817，純度96.8%)、芍藥苷(批號(hào)110736-201842，純度97.4%)、虎杖苷(批號(hào)111575-201603，純度87.3%)、苯甲酸(批號(hào)100419-201703，純度99.9%)、菊苣酸(批號(hào)111752-201703，純度97.6%)、丹酚酸B(批號(hào)111562-201716，純度94.1%)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。參蒲盆炎顆粒(批號(hào)190701、200501、200502、200503，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)。乙腈為色譜純(美國(guó)Tedia公司)；磷酸、甲醇等均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取沒(méi)食子酸、丹參素鈉、紅景天苷、綠原酸、苯甲酸、菊苣酸對(duì)照品4、8、4、3、3、3 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成貯備液1；分別精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品4、8 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇制成貯備液2。分別精密稱取芍藥苷、虎杖苷、丹酚酸B對(duì)照品4、3、3 mg，置于同一20 mL棕色量瓶中，分別精密加入上述2種貯備液2、1 mL，50%甲醇制成沒(méi)食子酸、丹參素鈉、紅景天苷、綠原酸、苯甲酸、菊苣酸、原兒茶酸、原兒茶醛、芍藥苷、虎杖苷、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為40、80、40、30、30、30、8、15、200、150、150 μg/mL的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取本品10袋，研細(xì)，分別取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 按照處方工藝，分別制備缺相應(yīng)藥材的陰性樣品，同時(shí)查閱文獻(xiàn)[3]發(fā)現(xiàn)，大血藤、菝葜、蒲公英中均含有綠原酸，故還需制備同時(shí)缺該3味藥材的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Waters Atlantis T3C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.15%磷酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～7%A；15～37 min，7%～21%A；37～47 min，21%～25%A；47～60 min，25%～36%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm(沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、芍藥苷、苯甲酸、丹酚酸B)、325 nm(綠原酸、虎杖苷、菊苣酸)；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品溶液中11個(gè)色譜峰與相鄰峰均可達(dá)到基線分離；缺赤芍的陰性樣品溶液在1號(hào)(沒(méi)食子酸)、7號(hào)(芍藥苷)、9號(hào)(苯甲酸)峰的相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明三者主要來(lái)自赤芍，并且陰性無(wú)干擾；缺丹參的陰性樣品溶液在2號(hào)(丹參素鈉)、5號(hào)(原兒茶醛)、11號(hào)(丹酚酸B)峰相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明三者主要來(lái)自丹參，并且陰性無(wú)干擾；缺大血藤的陰性樣品溶液在3號(hào)(原兒茶酸)、4號(hào)(紅景天苷)峰相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明兩者主要來(lái)自大血藤，并且陰性無(wú)干擾；缺虎杖的陰性樣品溶液在8號(hào)(虎杖苷)峰相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明該成分主要來(lái)自虎杖，并且陰性無(wú)干擾；缺蒲公英的陰性樣品溶液在10號(hào)(菊苣酸)峰相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明該成分主要來(lái)自蒲公英，并且陰性無(wú)干擾。前期報(bào)道，大血藤、菝葜、蒲公英中均含有綠原酸，并且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示缺各單味藥的陰性樣品溶液在6號(hào)(綠原酸)峰相應(yīng)位置均可見(jiàn)色譜峰，而缺大血藤、菝葜、蒲公英的陰性樣品溶液在相應(yīng)位置未見(jiàn)色譜峰，表明該成分共同來(lái)自這3味藥材，并且陰性無(wú)干擾。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密稱取各對(duì)照品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制成每1 mL沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為390.53、709.56、82.33、366.15、124.55、247.68、1 484.47、1 007.62、244.32、237.08、1 026.54 μg的對(duì)照品溶液B7，逐級(jí)稀釋，得到B6、B5、B4、B3、B2、B1。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，并以信噪比S/N=10為定量限，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液B1、B4、B7及供試品溶液適量，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得對(duì)照品溶液中沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面積RSD為0.07%～2.50%，供試品溶液中分別為0.32%、0.32%、7.39%、0.78%、1.44%、0.72%、1.84%、0.22%、0.38%、0.31%、0.31%，可知除原兒茶酸外均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液B4，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.54%、0.49%、0.82%、0.66%、0.59%、0.43%、0.34%、0.36%、0.42%、0.36%、0.24%，表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

取同一份供試品溶液，于0、3、6、9、12、18、24、27、33 h在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.23%、0.28%、6.84%、0.50%、1.39%、0.53%、1.65%、0.11%、0.52%、0.21%、0.23%，可知除原兒茶酸外均小于2%，表明供試品溶液在33 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)190701)適量，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B含量RSD分別為0.36%、0.30%、5.88%、0.58%、1.17%、0.55%、1.64%、0.16%、0.46%、0.32%、0.36%，可知除原兒茶酸外均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的樣品(批號(hào)190701)約0.5 g，精密稱定，平行9份，每3份1組，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品溶液(每1 mL分別含沒(méi)食子酸、單參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B 0.518 6、0.917 7、0.093 4、0.522 6、0.161 5、0.347 6、2.132 0、1.769 0、0.359 1、0.374 8、1.526 4 mg)0.5、1.0、1.5 mL，加70%甲醇至25 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B平均加樣回收率(RSD)分別為96.14%(1.65%)、103.45%(1.36%)、96.57%(6.92%)、94.02%(1.89%)、97.66%(2.39%)、99.21%(1.32%)、92.23%(1.97%)、98.57%(1.18%)、93.33%(1.12%)、97.09%(1.29%)、101.06%(1.80%)，可知除原兒茶酸外均小于3%。

2.7 樣品含量測(cè)定 取本品4批(批號(hào)190701、20200501、20200502、20200503)，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，不同批次樣品中沒(méi)食子酸、原兒茶酸、丹參素鈉、紅景天苷、芍藥苷、丹酚酸B含量差異較大，其原因可能為所用藥材批間質(zhì)量有明顯不同。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=4)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)參蒲盆炎顆粒中每味藥材的主要成分及藥理作用，并結(jié)合制劑工藝特點(diǎn)及實(shí)際情況，最終確定紅景天苷、原兒茶酸、綠原酸作為君藥大血藤活性物質(zhì)，綠原酸、菊苣酸作為君藥蒲公英活性物質(zhì)，虎杖苷作為臣藥虎杖活性物質(zhì)，沒(méi)食子酸、芍藥苷、苯甲酸作為佐藥赤芍活性物質(zhì)，丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛作為佐藥丹參活性物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收峰主要集中在230、270、325 nm處，其中230 nm處色譜峰信息量較大。綜合考慮吸收值及檢測(cè)方便，最終確定綠原酸、虎杖苷、菊苣酸檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，其余成分為230 nm。

3.3 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了Kromasil、Phenomenex Luna、Waters Symmetry、Waters Atlantis T3C18色譜柱，考慮到參蒲盆炎顆粒藥味多，成分復(fù)雜，流動(dòng)相中水相的初始比例較高，最終確定為耐水的Waters Atlantis T3C18色譜柱，并發(fā)現(xiàn)其耐用性良好。

3.4 磷酸體積分?jǐn)?shù)選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了0.05%～0.2%磷酸，發(fā)現(xiàn)其體積分?jǐn)?shù)在0.12%～0.2%時(shí)各成分均達(dá)到理想的分離效果，最終確定為0.15%磷酸。

3.5 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑種類和用量，最終確定為25 mL 70%甲醇超聲提取30 min，此時(shí)供試品溶液中各成分含量基本均達(dá)到最高，色譜峰峰形對(duì)稱，并且操作方便。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定參蒲盆炎顆粒中沒(méi)食子酸、丹參素鈉、原兒茶酸、紅景天苷、原兒茶醛、綠原酸、芍藥苷、虎杖苷、苯甲酸、菊苣酸、丹酚酸B的含量，其中原兒茶酸可能由于處方藥味較多，組成復(fù)雜，樣品背景干擾大，含量較低，導(dǎo)致其精密度、重復(fù)性、回收率不理想，今后將作進(jìn)一步優(yōu)化，而其他成分上述指標(biāo)均良好。該方法操作簡(jiǎn)便，可較全面地控制參蒲盆炎顆粒質(zhì)量，具有一定實(shí)用價(jià)值，也能為今后相關(guān)開(kāi)發(fā)利用提供借鑒。