吳佳輝， 何 瀟， 熊紫微， 譚 婷， 馮育林,， 楊世林， 溫 泉*， 陳道峰,3

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；2.創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

鴉膽子Bruceajavanica(L.)Merr.是鴉膽子屬苦木科常綠灌木或者小喬木，廣泛分布于我國廣東、廣西、云南及東南亞地區(qū)[1]，其干燥成熟果實(shí)鴉膽子是傳統(tǒng)中藥，其性苦味寒，有小毒[2]。已有240多種化合物從鴉膽子的種子和果實(shí)中分離得到，其中大約120 種為苦木素類化合物[3]，苦木素類化合物作為鴉膽子的主要成分，具有多種生物活性，如抗癌[4]、抗炎[5]、抗病毒[6]、抗原蟲[7]等。

補(bǔ)體是經(jīng)活化后具有生物活性，可介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的蛋白。中藥作用于傳染病通常是通過抑制炎癥和退熱，其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活有關(guān)[8-9]，因此補(bǔ)體系統(tǒng)在中藥抑制炎癥過程中起重要作用。鴉膽子苦木素具有抗炎[5]和體外抗補(bǔ)體活性[10]，并且補(bǔ)體系統(tǒng)還參與腫瘤細(xì)胞的殺傷和監(jiān)視作用[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)對具有抗補(bǔ)體活性的化合物3、8進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，結(jié)果顯示對HepG2細(xì)胞具有良好的殺傷作用。

1 材料

HP20大孔吸附樹脂(日本三菱公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；100～200目硅膠柱、GF254型薄層色譜(青島海洋化工廠)；YMC-Pack ODS-A HPLC(250 mm×20 mm，5 μm；250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；Global Chromatography色譜柱(4.6 mm×250 mm，蘇州環(huán)球色譜有限責(zé)任公司)。

小鼠單核巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)、小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(MH-S)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)、Cell Counting kit-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海翌圣生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、EDTA-胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基均購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司；一氧化碳(NO)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

鴉膽子于2018年采自廣西，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國躍教授鑒定為正品，憑證標(biāo)本(YDZ20181107)保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)本草標(biāo)本館。

2 方法

2.1 提取分離 取鴉膽子20 kg，粉碎后石油醚脫脂3次，揮干石油醚后用95%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液，濾過，減壓濃縮至無醇味，得粗浸膏，浸膏加適量甲醇溶解，硅膠拌樣，上樣硅膠柱，以二氯甲烷-甲醇(100∶1、20∶1、2∶1、0∶1)洗脫，得到4個流分Fr.A～Fr.D。Fr.B(260 g)用適量水溶解，上樣HP-20大孔吸附樹脂，依次以30%、60%、95%甲醇洗脫，得30%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-1，98 g)、60%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-2，77 g)、95%甲醇洗脫部位浸膏(Fr.B-3，108 g)。Fr.B-1加適量甲醇溶解，拌樣，采用硅膠柱(100～200目)分離，以二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、0∶1)梯度洗脫，合并相似成分，得到5個流分Fr.B-1-1～ Fr.B-1-5，F(xiàn)r.B-1-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，合并相似成分，得到6個流分Fr.B-1-2-1～ Fr.B-1-2-6，在254 nm波長處，F(xiàn)r.B-1-2-2經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，22∶78)，得化合物7(24.1 mg)、3(41.6 mg)；Fr.B-1-2-4經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，27∶73)，得化合物5(22.9 mg)、8(43.2 mg)。Fr.B-2加適量甲醇溶解，拌樣，采用硅膠柱(100～200目)分離，以二氯甲烷-甲醇(50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1)梯度洗脫，合并相似成分，得到6個流分Fr.B-2-1～Fr.B-2-6，F(xiàn)r.B-2-4后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，合并相似成分，得到8個流分Fr.B-2-4-1～Fr.B-2-4-8，在254 nm波長處，F(xiàn)r.B-2-4-3經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，35∶65)，得化合物10(66.8 mg)、2(63.2 mg)、1(13.2 mg)；Fr.B-2-4-6經(jīng)半制備HPLC分離(乙腈-0.1%甲酸，38∶62)，得化合物6(37.5 mg)、9(46.2 mg)、4(47.8 mg)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7、HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素(PS)、高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MH-S細(xì)胞在含10%FBS、1%PS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件均為37 ℃、5%CO2。

2.3 細(xì)胞存活率檢測 在96孔板中接種對數(shù)生長的RAW264.7(每孔1×104/100 μL)、MH-S(每孔8×103/100 μL)、HepG2(每孔6×103/100 μL)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，棄上清，加入化合物1～10(80、40、20、10、5 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加入100 μL 10%CCK-8，孵育2 h至未處理對照組顏色變?yōu)槌壬?，?450 nm波長處測定吸光度。

2.4 NO水平檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔1×105/200 μL)，培養(yǎng)24 h，設(shè)置對照組(DMEM)、LPS組(2 μg/mL LPS)、不同濃度給藥組(40、20、10 μmol/L化合物1～10，預(yù)處理2 h，加入2 μg/mL LPS的培養(yǎng)基)，每組設(shè)置3個重復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集上清液，采用Griess法檢測NO水平。

2.5 補(bǔ)體經(jīng)典途徑實(shí)驗(yàn) 將化合物1～10與肝素鈉(陽性對照)溶于二甲基亞砜(DMSO)中，PBS緩沖液稀釋成不同濃度，加入臨界濃度的補(bǔ)體(1∶10稀釋的豚鼠血清)、溶血素、2%SRBC，在37 ℃下水浴30 min，離心后取上清液，在405 nm波長處測定吸光度，設(shè)置對照組和全溶血組，測定溶血抑制率。

2.6 HepG2細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC凋亡試劑盒，將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中，在37 ℃下孵育24 h，加入化合物3、8(20、10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，400 μL 1×buffer緩沖液重新混懸，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶，室溫避光孵育15 min，通過流式儀檢測，F(xiàn)lowJo 7.6軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1：無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：705.2 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：3.33(1H，d，J=15.5 Hz，H-1α)，2.57(1H，d，J=15.5 Hz，H-1β)，3.01(1H，d，J=3.7 Hz，H-9)，4.91(1H，brs，H-11)，5.13(1H，brs，H-12)，4.01(1H，brd，J=11.0 Hz，H-14)，6.48(1H，brs，H-15)，2.50(3H，s，H-18)，1.80(3H，s，H-19)，5.03(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.64(3H，s，OCH3)，5.68(1H，s，H-2′)，1.59(3H，s，H-4′)，2.11(3H，s，H-5′)，5.43(1H，d，J=7.7 Hz，H-1″)，4.20(1H，dd，J=8.7，7.7 Hz，H-2″)，4.30(1H，dd，J=9.2，8.7 Hz，H-3″)，4.37(1H，t，J=9.2 Hz，H-4″)，4.18(1H，m，H-5″)，4.46(1H，dd，J=11.7，4.0 Hz，H-6″α)，4.57(1H，dd，J=11.7，2.7 Hz，H-6″β)，6.62(1H，brs，11-OH)，8.25(1H，brs，12-OH)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.0(C-1)，193.8(C-2)，146.8(C-3)，147.7(C-4)，48.1(C-5)，27.6(C-6)，83.8(C-7)，46.2(C-8)，31.9(C-9)，39.7(C-10)，73.3(C-11)，76.3(C-12)，82.7(C-13)，48.8(C-14)，68.4(C-15)，167.0(C-16)，16.7(C-18)，26.5(C-19)，73.5(C-20)，170.5(C-21)，52.3(-OCH3)，165.5(C-1′)，116.4(C-2′)，158.8(C-3′)，26.5(C-4′)，20.5(C-5′)，104.9(C-1″)，75.6(C-2″)，78.1(C-3″)，71.1(C-4″)，77.9(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，鑒定為javanicoside A。

化合物2：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：685.2 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.55(1H，s，H-1)，2.48(1H，m，H-4)，2.12(1H，d，J=7.1 Hz，H-5)，1.92(1H，m，H-6α)，1.74(1H，d，J=4.0 Hz，H-6β)，4.92(1H，d，J=4.0 Hz，H-7)，4.30(1H，brs，H-11)，4.16(1H，brs，H-12)，1.04(3H，d，J=6.7 Hz，H-18)，1.48(3H，s，H-19)，4.52(1H，d，J=7.2 Hz，H-20α)，3.64(1H，d，J=7.2 Hz，H-20β)，3.70(3H，s，-OCH3)，2.17(2H，d，J=7.1 Hz，H-2′)，1.98(1H，m，H-3′)，0.91(6H，m，H-4′，5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：132.3(C-1)，150.3(C-2)，198.1(C-3)，41.9(C-4)，44.9(C-5)，30.6(C-6)，84.6(C-7)，47.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，83.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，170.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，73.6(C-20)，177.0(C-21)，53.1(-OCH3)，172.0(C-1′)，43.9(C-2′)，26.7(C-3′)，22.8(C-4′)，22.7(C-5′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，77.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside A。

化合物3：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：769.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.54(1H，s，H-1)，2.48(1H，m，H-4)，2.01(1H，brd，J=5.0 Hz，H-5)，1.93(1H，m，H-6α)，1.77(1H，m，H-6β)，4.30(1H，s，H-11)，4.16(1H，s，H-12)，6.81(1H，d，J=13.0 Hz，H-15)，1.17(3H，d，J=6.0 Hz，H-18)，1.64(1H，s，H-19)，4.53(1H，d，J=7.3 Hz，H-20a)，3.68(1H，d，J=7.3 Hz，H-20b)，3.64(3H，s，-OCH3)，6.06(1H，s，H-2′)，2.26(3H，s，H-5′)，1.42(3H，s，H-6′)，1.46(3H，s，H-7′)1.95(3H，s，H-9′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：130.3(C-1)，149.3(C-2)，198.1(C-3)，41.9(C-4)，44.9(C-5)，30.6(C-6)，84.6(C-7)，47.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，83.3(C-13)，49.5(C-14)，71.3(C-15)，167.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，74.6(C-20)，172.0(C-21)，53.1(-OCH3)，166.0(C-1′)，113.5(C-2′)，169.4(C-3′)，82.8(C-4′)，14.5(C-5′)，26.6(C-6′)，26.5(C-7′)，162.0(C-8′)，21.6(C-9′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，77.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside G。

化合物4：白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：701.4 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.27(1H，s，H-1)，2.01(1H，brd，J=15.0 Hz，H-5)，5.18(1H，brs，H-7)，2.52(1H，d，J=5.1 Hz，H-9)，4.94(1H，brs，H-11)，5.13(1H，brs，H-12)，1.16(3H，d，J=6.6 Hz，H-18)，1.64(3H，s，H-19)，3.90(1H，d，J=7.7 Hz，H-20α)，5.07(1H，d，J=7.8 Hz，H-20β)，3.80(3H，s，-OCH3)，2.88(1H，d，J=13.7 Hz，H-2′a)，2.94(1H，d，J=13.7 Hz，H-2′b)，1.61(6H，s，H-4′，5′)，5.35(1H，d，J=7.3 Hz，H-1″)，4.48(1H，brd，J=10.3 Hz，H-6″)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：130.3(C-1)，148.3(C-2)，195.1(C-3)，43.9(C-4)，40.9(C-5)，30.6(C-6)，83.6(C-7)，46.4(C-8)，41.1(C-9)，40.2(C-10)，73.9(C-11)，76.3(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，168.2(C-16)，12.8(C-18)，17.8(C-19)，73.6(C-20)，171.2(C-21)，52.1(-OCH3)，170.3(C-1′)，48.5(C-2′)，69.4(C-3′)，29.8(C-4′)，29.5(C-5′)，102.9(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，鑒定為yadanzioside J。

化合物5：白色無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：434.5 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：4.20(1H，s，H-1)，6.15(1H，s，H-3)，3.15(1H，brd，H-5)，2.16(1H，d，H-6a)，1.54(1H，d，H-6b)，2.75(1H，brs，H-9)，6.01(1H，brs，H-11)，4.43(1H，brs，H-12)，6.13(1H，brs，H-15)，1.75(3H，s，H-18)，1.57(3H，s，H-19)，2.09(3H，s，H-20)，2.06(3H，s，H-21)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：85.3(C-1)，199.3(C-2)，125.1(C-3)，164.9(C-4)，42.9(C-5)，25.6(C-6)，79.6(C-7)，43.4(C-8)，44.7(C-9)，49.2(C-10)，75.9(C-11)，78.9(C-12)，78.3(C-13)，78.5(C-14)，68.9(C-15)，174.2(C-16)，22.8(C-18)，11.8(C-19)，20.6(C-20)，25.8(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，鑒定為yadanziolide S。

化合物6：白色粉末狀固體(甲醇)，ESI-MSm/z：529.2 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.53(1H，d，J=16.0 Hz，H-1α)，2.84(1H，d，J=16.0 Hz，H-1β)，2.99 (1H，d，J=13.0 Hz，H-5)，2.30(1H，dt，J=14.5，2.0 Hz，H-6α)，1.88(1H，J=14.5，13.5，2.0 Hz，H-6β)，4.91(1H，s，H-7)，2.21(1H，s，H-9)，4.17(1H，d，J=4.0 Hz，H-11)，4.14(1H，s，H-12)，3.24(1H，m，H-14)，6.17(1H，brs，H-15)，1.84(3H，d，J=1.5 Hz，H-18)，1.37(3H，s，H-19)，4.70(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.74(1H，brs，H-20b)，5.68(1H，s，H-2′)，1.92(3H，s，H-4′)，2.15(3H，s，H-5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.4(C-1)，194.4(C-2)，145.8(C-3)，130.4(C-4)，43.1(C-5)，30.1(C-6)，84.8(C-7)，46.2(C-8)，42.7(C-9)，42.2(C-10)，70.9(C-11)，78.6(C-12)，83.4(C-13)，49.8(C-14)，66.9(C-15)，169.7(C-16)，13.4(C-18)，16.0(C-19)，71.5(C-20)，174.5(C-21)，166.5(C-1′)，116.4(C-2′)，159.8(C-3′)，27.5(C-4′)，20.5(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，鑒定為desmethyl-brusatol。

化合物7：白色無定型粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：643.2 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：7.24(1H，s，H-1)，2.40(1H，m，H-4)，2.01(1H，brd，H-6α)，1.63(1H，m，H-6β)，2.49(1H，d，J=4.0 Hz，H-9)，5.16(1H，m，H-11)，6.53(1H，brs，H-15)，1.15(3H，d，J=6.5 Hz，H-18)，1.59(3H，s，H-19)，5.02(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.73(3H，s，-OCH3)，2.06(3H，s，H-2′)，5.31(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：129.3(C-1)，148.9(C-2)，194.5(C-3)，43.8(C-4)，40.5(C-5)，30.0(C-6)，83.6(C-7)，46.4(C-8)，41.7(C-9)，39.2(C-10)，72.9(C-11)，76.9(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.9(C-15)，168.2(C-16)，18.8(C-18)，12.8(C-19)，73.6(C-20)，171.8(C-21)，52.9(-OCH3)，169.6(C-1′)，20.6(C-2′)，102.0(C-1″)，74.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside F。

化合物8：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：685.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：4.42(1H，m，H-2)，5.69(1H，brs，H-3)，6.76(1H，d，J=13.0 Hz，H-15)，1.43(3H，brs，H-18)，1.45(3H，s，H-19)，3.72(3H，s，-OCH3)，5.82(1H，brs，H-2′)，1.67(3H，s，H-4′)，2.14(3H，s，H-5′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：84.8(C-1)，84.3(C-2)，124.1(C-3)，135.9(C-4)，43.2(C-5)，28.6(C-6)，81.6(C-7)，46.4(C-8)，42.9(C-9)，44.4(C-10)，75.9(C-11)，75.9(C-12)，82.3(C-13)，50.5(C-14)，68.3(C-15)，168.2(C-16)，20.8(C-18)，12.1(C-19)，73.6(C-20)，171.4(C-21)，52.1(-OCH3)，165.3(C-1′)，116.3(C-2′)，158.7(C-3′)，27.8(C-4′)，20.7(C-5′)，106.9(C-1″)，75.9(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.6(C-5″)，62.7(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道基本一致，鑒定為yadanzioside E。

化合物9：無色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：705.3 [M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：2.51(1H，d，J=16.2 Hz，H-1a)，3.27(1H，d，J=16.2 Hz，H-1b)，3.06(1H，brd，J=12.0 Hz，H-5)，2.28(1H，d，J=14.6 Hz，H-6α)，1.74(1H，ddd，J=14.6，12.8，2.1 Hz，H-6β)，5.11(1H，brs，H-7)，2.62(1H，d，J=4.2 Hz，H-9)，4.78(1H，brs，H-11)，5.06(1H，brs，H-12)，4.10(1H，brd，J=12.8 Hz，H-14)，2.08(1H，s，H-18)，1.75(1H，s，H-19)，5.13(1H，d，J=7.5 Hz，H-20a)，3.97(1H，d，J=7.5 Hz，H-20b)，3.54(3H，s，-OCH3)，8.23(1H，d，J=7.5 Hz，H-3′，7′)，7.50(1H，d，J=7.7 Hz，H-4′，6′)，7.37(1H，d，J=7.7 Hz，H-5′)，5.46(1H，d，J=7.0 Hz，H-1″)，3.89(1H，m，H-5″)，4.46(1H，d，J=10.2 Hz，H-6″a)，4.34(1H，m，H-6″b)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：51.0(C-1)，193.6(C-2)，146.6(C-3)，147.9(C-4)，43.3(C-5)，29.3(C-6)，83.8(C-7)，46.2(C-8)，42.2(C-9)，40.8(C-10)，73.0(C-11)，75.7(C-12)，82.7(C-13)，50.8(C-14)，69.4(C-15)，168.0(C-16)，15.3(C-18)，15.8(C-19)，73.5(C-20)，171.5(C-21)，52.3(-OCH3)，165.5(C-1′)，130.4(C-2′)，130.1(C-3′)，128.8(C-4′)，133.6(C-5′)，128.8(C-6′)，130.1(C-7′)，104.9(C-1″)，76.1(C-2″)，78.9(C-3″)，71.1(C-4″)，78.4(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道基本一致，鑒定為javanicoside J。

化合物10：非晶形粉末(甲醇)，ESI-MSm/z：707.4 [M+Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ：6.08(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，2.02(1H，dd，J=11.9，3.0 Hz，H-6α)，1.54(1H，t，J=12.8 Hz，H-6β)，4.84(1H，s，H-7)，2.91(1H，d，J=4.2 Hz，H-9)，6.16(1H，d，J=5.0 Hz，H-11)，6.92(1H，brs，H-15)，0.86(1H，d，J=6.8 Hz，H-18)，1.83(1H，s，H-19)，5.08(1H，d，J=7.4 Hz，H-20a)，3.87(1H，d，J=7.4 Hz，H-20b)，3.84(3H，s，-OCH3)，2.36(1H，d，J=6.6 Hz，H-2′)，0.99(3H，s，H-4′)，0.96(3H，s，H-5′)，5.44(1H，d，J=7.2 Hz，H-1″)，3.98(1H，m，H-5″)，4.54(2H，d，J=12.0 Hz，H-6″)，6.32(1H，d，J=5.6 Hz，11-OH)，7.88(1H，brs，12-OH)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：199.7(C-1)，146.3(C-2)，124.8(C-3)，31.4(C-4)，44.0(C-5)，28.6(C-6)，82.8(C-7)，46.6(C-8)，36.9(C-9)，48.7(C-10)，75.3(C-11)，76.3(C-12)，82.7(C-13)，50.8(C-14)，68.4(C-15)，168.0(C-16)，18.7(C-18)，14.5(C-19)，73.5(C-20)，171.5(C-21)，52.3(-OCH3)，171.9(C-1′)，43.4(C-2′)，25.9(C-3′)，22.5(C-4′)，22.4(C-5′)，100.9(C-1″)，74.6(C-2″)，78.9(C-3″)，71.1(C-4″)，78.9(C-5″)，62.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，鑒定為javanicoside B。

3.2 細(xì)胞毒性 由表1 可知，化合物1～10濃度在 50 μmol/L 時對RAW264.7、MH-S細(xì)胞的毒性較小，存活率高，但化合物3、8對HepG2細(xì)胞毒性較大。

3.3 抗炎活性 由圖1可知，化合物3、8～10對NO生成有抑制作用，其他化合物活性較弱。

表1 化合物1～10 對RAW264.7、MH-S、HepG2細(xì)胞的

注：與對照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 抗補(bǔ)體活性 由圖2可知，化合物3、8對補(bǔ)體激活具有抑制作用，其他化合物無抑制作用。

圖2 化合物3、8抗補(bǔ)體活性

3.5 細(xì)胞凋亡 如圖3所示，隨著化合物3、8濃度增加，HepG2細(xì)胞凋亡率升高。

圖3 化合物3、8對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

4 討論

中藥鴉膽子化學(xué)成分的藥理活性引起了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[19]。補(bǔ)體因子C5a 能激活ERK1/2、MEK1/2、p38MAPK和JNK使其磷酸化[20]，并且補(bǔ)體系統(tǒng)激活會產(chǎn)生過量的TNF-α 、IL-1β、IL-6等炎癥因子，造成局部增生損害[21]，因此補(bǔ)體系統(tǒng)可能是炎癥反應(yīng)的上游路徑，有抗補(bǔ)體活性的化合物具有抗炎活性。因此有文獻(xiàn)導(dǎo)向分離鑒定具有抗補(bǔ)體活性的主要成分進(jìn)行抗炎活性研究[22]。本研究通過對化合物1～10進(jìn)行抗炎活性的篩選，用具有抗炎活性的化合物進(jìn)行補(bǔ)體經(jīng)典途徑實(shí)驗(yàn)，證明化合物3和8具有良好的抗補(bǔ)體活性。鴉膽子苦木素廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療，但都通過細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行研究[23]。本研究初步證明具有良好抗補(bǔ)體活性的化合物3和8對人肝癌細(xì)胞具有殺傷作用，為鴉膽子苦木素抗腫瘤活性研究提供參考。