翟利敏, 李文通, 馮政, 李華, 裴楊莉*

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院, 廣東省動物分子設計與精準育種重點實驗室, 廣東普通高校動物分子設計與精準育種重點實驗室, 廣東佛山 528225；2.中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所, 廣東深圳 518120）

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物, 豬肉是人類獲得蛋白質營養(yǎng)的主要途徑之一。優(yōu)良的生產(chǎn)性狀可為養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。豬與人的氨基酸同源性高達84.1%, 同時, 豬的解剖學、生理學及遺傳背景、疾病特征、營養(yǎng)代謝等方面與人類極為相似[1], 且成本低、擴繁快、不涉及倫理學問題。因此, 豬在人類疾病模型、異種器官移植等醫(yī)學領域也具有廣闊的應用前景。隨著基因編輯(gene editing)技術的快速發(fā)展, 出現(xiàn)了越來越多易操作、運用廣泛且安全的新型編輯技術, 特別是規(guī)律性重復短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/cas endonucleases 9,CRISPR/Cas9)技術, 可以快速完成單堿基編輯、基因敲除或敲入編輯, 得到編輯細胞后再借助體細胞克隆等技術制備基因編輯豬, 其在豬的生產(chǎn)性狀改良及人類疾病模型、藥用人源蛋白生產(chǎn)、器官移植供體等領域發(fā)揮重大作用。本文綜述了基因編輯豬的制備及在農(nóng)業(yè)領域、醫(yī)學領域中的研究進展, 以期為豬的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)性狀改良和醫(yī)學研究提供參考。

1 基因編輯豬的制備方法

基因編輯技術能精確地對生物體基因組特定目標基因進行修飾。通過基因編輯技術可以刪除和替換內(nèi)源基因、插入外源基因等[2]。依據(jù)所用可編輯核酸酶的不同, 目前主流的基因編輯技術主要有3種：鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)、類轉錄啟動因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和規(guī)律性重復短回文序列簇(CRISPR/Cas9), 這3種技術均能高效地靶向基因并將多等位基因修飾引入體細胞。構建基因修飾豬常用的方法有體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)、原 核 注 射(pronuclear injection)、慢 病 毒 轉 染(lentivirus transfection)和精子介導(sperm-mediated gene transfer)等。

1.1 SCNT法

SCNT法介導的基因編輯動物制備技術是將經(jīng)基因編輯后的體細胞注入已去核的卵母細胞中形成重構胚, 再將重構胚移植到代孕母畜子宮內(nèi)生產(chǎn)基因編輯后代。SCNT法是構建基因編輯豬最常用的方法, 主要步驟如下：①基因編輯的供體細胞制備與篩選；②體外成熟卵細胞的去核；③將供體細胞注入卵母細胞核；④重構胚的融合與激活；⑤重構胚的體外培養(yǎng)；⑥重構胚移植入代孕母豬子宮內(nèi)獲得基因編輯后代[3]。該方法的基因修飾在核移植供體細胞制備階段, 得到陽性細胞便可用于核移植制備基因編輯豬, 無需漫長的繁殖試驗便可獲得多基因編輯豬[4-7]。

1.2 原核注射法

原核注射法是借助光學顯微鏡和顯微操作儀, 將線性化外源DNA直接注入動物原核期胚胎的1或2個原核(通常為雄原核)內(nèi)來制作基因編輯動物。通過原核注射法制備基因編輯豬的主要步驟如下：①外源基因表達載體的構建和用于注射DNA溶液的準備；②注射用胚胎準備；③顯微注射；④注射胚胎的體外培養(yǎng)；⑤移植到受體輸卵管或子宮角處；⑥對出生的幼仔進行基因型檢測。豬卵母細胞的胞質內(nèi)富含脂質, 顯微鏡下卵母細胞呈黑色, 不利于原核注射, 通常需要將卵母細胞高速離心, 使脂質沉積到一側以暴露原核, 但這一操作對胚胎有損傷, 降低了胚胎的發(fā)育能力[2]。

1.3 其他方法

除了SCNT及顯微注射外, 慢病毒轉染法、精子載體法也能用來制備基因編輯豬。但由于慢病毒載體具有毒性且對實驗室條件要求較高, 而精子載體法的重復性低、技術不穩(wěn)定, 同時該法受精子質量、孵育條件和授精操作影響較大, 因此應用不廣泛。另外, CRISPR/Cas9系統(tǒng)在胚胎發(fā)生過程可通過電穿孔法傳遞大分子物質。電穿孔法被廣泛應用于小鼠基因編輯[8], 也被用于豬的基因編輯。電穿孔介導的基因編輯不需要專門的設備, 而且操作簡單, 且合子存活率高。一般來說, 電穿孔進入細胞的分子攝取與場強、脈沖長度和脈沖個數(shù)成正比。與小鼠不同, 豬的體外受精卵/胚胎對電壓敏感, 高電壓對受精卵/胚胎有害[9-10]。因此, 在豬受精卵/胚胎上單獨通過電穿孔導入大分子物質有困難。

2 基因編輯用于豬生產(chǎn)性狀改良

中國地方豬具有飼料報酬低、貯脂力強、瘦肉率低等特點, 采用傳統(tǒng)育種手段培育具有理想經(jīng)濟性狀特征的群體所需周期很長, 需要耗費大量的人力、物力、財力, 同時性狀改良的程度還受豬的品種特性及基因型的影響, 限制了我國豬種的遺傳改良。隨著基因編輯技術的飛速發(fā)展, 這一高效便捷的分子育種方式為快速改良或提高豬的生長率、背膘厚、瘦肉率、肉品質、抗病能力等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)性狀提供了有效的解決措施。

2.1 高生產(chǎn)性能豬制備

提高豬的產(chǎn)肉量及胴體瘦肉率仍是目前豬育種的重要目標之一, 而口感好、營養(yǎng)健康的豬肉也越來越受消費者的青睞。研究發(fā)現(xiàn), 胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和肌肉抑制素(myostatin,MSTN)均能參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育與脂肪沉積[11-12]。2018年, 中國科學院周琪院士團隊利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對IGF2基因的第3個內(nèi)含子進行編輯, 獲得了IGF2基因編輯巴馬豬, 該豬的產(chǎn)肉量和瘦肉率均顯著提高[13], 首次證實編輯基因的非編碼區(qū)也可以改善豬的經(jīng)濟性狀。2019年, 中山大學陳瑤生教授團隊獲得了IGF2雙等位基因缺失的編輯豬, 該豬同樣具有較高的瘦肉率[12]。針對MSTN基因編輯豬的研究較IGF2更多。2015年, 中國農(nóng)業(yè)科學院Qian等[14]制備出MSTN編輯的梅山豬, 該豬瘦肉率顯著提高。同年, 吉林大學Wang等[15]利用無選擇標記的Cas9/gRNA編輯成纖維細胞上的MSTN, 再通過體細胞核移植獲得了MSTN雙等位基因突變的8頭克隆小豬, 這些豬肌纖維數(shù)目顯著增加, 并呈現(xiàn)“雙肌臀”現(xiàn)象。2016年, 湖北農(nóng)業(yè)科學院鄭新民團隊運用CRISPR/Cas9和Cre-LoxP重組酶技術制備了無選擇標記的MSTN基因編輯豬[16]。利用CRISPR/Cas9介導的DNA雙鏈斷裂隨機修復, 在豬MSTN基因編碼區(qū)僅插入單個核苷酸, 引發(fā)移碼突變并完全破壞MSTN功能, 成功獲得MSTN功能缺失的巴馬香豬, 6月齡時其生長速度提高9.6%, 肌纖維數(shù)量提高23.1%, 表現(xiàn)出“雙肌性狀”[17]。2020年, Ren等[18]制備了MSTN敲除的梅山豬, 而且還發(fā)現(xiàn)MSTN通過MEF2C/miR222/SCD5級聯(lián)調(diào)控豬皮下脂肪脂肪酸去飽和脂肪沉積。2021年, 彭定威等[19]利用CRISRP/Cas9技術對MSTN的第3外顯子進行編輯, 破壞半胱氨酸節(jié)基元, 編輯后的MSTN失去對靶基因的抑制作用；制備的MSTN基因編輯豬(兩廣小花豬)雜合子的肩部和臀部肌肉較發(fā)達, 肌纖維橫截面積顯著減少, 肌纖維數(shù)量顯著增多。中國農(nóng)業(yè)科學院李奎教授團隊在對MSTN長達10余年的研究中, 采用現(xiàn)代基因編輯技術結合育種技術, 針對MSTN的不同位點和不同豬品種, 開展了編輯豬的制備和多層次全方位的性能評估：大群體、長期且全面的性能測定揭示了MSTN基因缺失不僅可以大幅度提高瘦肉產(chǎn)量, 同時提升了豬肉的嫩度；并且不同品種提高瘦肉產(chǎn)量的模式明顯不同；為育種工作者引進商業(yè)品種和個性化遺傳改良本土地方品種提供了新策略；在豬肉營養(yǎng)方面, MSTN基因缺失豬具有高蛋白、低脂肪的特性, 還提高了有益多不飽和脂肪酸的比例, 不僅可以滿足心腦血管疾病易發(fā)人群的特殊飲食需要, 也為消費者提供了全新的選擇[11]。

豬肉中含有大量的飽和脂肪酸, 過量食用易引發(fā)高血壓、高血脂、高膽固醇、動脈粥樣硬化等疾病, 為了吃得更健康, 科學家在改變豬肉成分上開展研究。秀麗線蟲的Fat-1(fatty acid desaturases-1)基因可編碼ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶, 該酶能將ω-6多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)轉化成為相應的ω-3 PUFAs, ω-3 PUFAs具有改善血管功能、抑制血小板凝集、抑制慢性炎癥、降低血糖、促進腦細胞發(fā)育、提高記憶力等有益功能[20]。哺乳動物體內(nèi)并無將ω-6 PUFAs轉化成ω-3 PUFAs的酶, 因此, 多個研究團隊將秀麗線蟲的Fat-1基因整合至豬基因組中, 成功獲得轉ω-3脂肪酸去飽和酶基因的轉基因豬, 豬肉中ω-3量大大提高, 進而提升了豬肉的營養(yǎng)價值[21-24]。2019年, 華南農(nóng)業(yè)大學吳珍芳教授團隊成果制備出同時表達Fat-1和Fat-2的轉基因豬, 該豬肌肉、脂肪等組織中的ω-3和ω-6 PUFAs含量顯著提高[25]。

2.2 豬抗病育種中的應用

豬的各種傳染性疾病給生豬產(chǎn)業(yè)會造成巨大的經(jīng)濟損失。包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、非洲豬瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)等, 嚴重影響了國民經(jīng)濟、人類健康及動物福利和生產(chǎn)力。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由PRRSV引起的高致病性傳染病, 嚴重危害養(yǎng)豬業(yè), 對種豬危害較大, 該病以妊娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等生殖功能衰竭以及仔豬呼吸困難、敗血癥、死亡率高等為主要特征[26]。豬肺泡巨噬細胞上的清道夫受體蛋白CD163是豬呼吸與繁殖綜合征病毒的主要受體。2016年, 美國密蘇里大學Randall S Prather團隊制備了CD163第7外顯子編輯豬, 該豬可以抵抗NVSL97-7895病毒株的攻擊[27]。同年, 密蘇里大學與堪薩斯州立大學合作將豬CD163基因的SRCR5結構域替換為人CD163基因的SRCR8結構域, 該編輯豬可抵抗PRRSVⅠ型毒株[28]。2018年, 吳珍芳教授團隊成功制備出CD163敲除豬, 該豬能完全抵抗高致病型藍耳病毒株(HP-PRRSV)[29]。2020年, 中國農(nóng)業(yè)科學院李奎教授團隊同時編輯了CD163基因第7外顯子和豬氨基肽酶(porcine aminopeptidase,pAPN)基因的第2外顯子, 成功制備了CD163和pAPN同時失活的雙基因編輯大白豬[30]。該豬可同時抵抗PRRSV和傳染性胃腸炎病毒感染, 并明顯地抑制了豬德爾塔冠狀病毒的感染, 這是全球首例抗3種重大疫病豬育種材料, 且該豬生長發(fā)育正常, 為開辟同時抗多種疾病豬的制備提供了參考。

非洲豬瘟(ASF)是由ASFV感染家豬和野豬而引起的一種急性、烈性、高度接觸性的傳染病, 對全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。甚至導致部分地方豬種的滅絕。目前針對ASFV的各種疫苗仍不具良好的保護效率[31]。2016年, Lillico等[32]發(fā)現(xiàn), 非洲疣豬攜帶ASFV但不發(fā)病, 而家豬感染ASFV后, 死亡率卻高達100%；分析2品種豬的基因組測序結果發(fā)現(xiàn), 家豬與非洲疣豬的RELA基因(NF-κB轉錄因子的1個亞基, 在調(diào)節(jié)對感染的免疫反應中起關鍵作用)上存在3個SNP位點的差異。他們利用基因編輯技術將家豬RELA的SNP位點精確替換為非洲疣豬的SNP, 成功獲得基因編輯豬；后續(xù)攻毒實驗顯示, 改變2個位點的家豬臨床、病毒學和病理參數(shù)與普通家豬無顯著差異；而改變3個位點全編輯的家豬, 在部分編輯豬中觀察到感染ASFV后臨床癥狀出現(xiàn)延遲, 血液樣本和鼻腔分泌物中病毒DNA較少[33], 這給抗非洲豬瘟豬的制備帶來了希望, 不過后續(xù)還需找出更有效的編輯位點。

另外, 2020年, Xie等[34]利用CRISPR/Cas9技將豬RSAD2(pRSAD2)基因插入豬ROSA26位點, 并成功制備了組成性過表達pRSAD2的敲入豬(pRSAD2-KI), 病毒攻擊實驗表明, 從pRSAD2-KI豬分離的成纖維細胞減少了典型豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)感染。同年, Huang等[35]利用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系統(tǒng)產(chǎn)生無標記豬β-防御素2(porcine beta-defensin 2,PBD-2)敲入豬, 提高了豬體內(nèi)PBD-2蛋白的水平。而PBD-2是多功能陽離子肽, 在豬的不同組織中表達, 具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)和促生長等作用, 高表達PBD-2的豬也許具有更強的抗病能力, 這一模型豬為抗病豬選育提供新材料。

若采用基因編輯技術獲得同時抗PRRSV、ASF、流行性腹瀉等一系列病, 且瘦肉率高、口感好、營養(yǎng)健康的豬育種新材料, 這將極大推動家畜抗病研究, 改善養(yǎng)殖過程中的動物福利。

3 基因編輯豬在醫(yī)學研究的應用

豬的基因組、疾病特征、器官大小等方面與人類非常相似, 在醫(yī)學方面是比較理想的大動物模型。隨著基因編輯技術的飛速發(fā)展, 基因編輯豬在醫(yī)學領域的應用也越來越廣泛, 利用基因編輯技術對豬的基因進行改造, 基因編輯豬可以作為人類疾病模型、異種器官移植供體, 還可作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白, 基因編輯豬具有很好醫(yī)學研究價值, 對人類的醫(yī)學研究起到了很大的推動作用。

3.1 豬在醫(yī)學研究中的優(yōu)勢

豬的大部分組織器官在結構和生理上與人類相似[36], 包括心臟和循環(huán)系統(tǒng)、腎臟、胰腺、肝臟、肺及皮膚, 其中皮膚與人類皮膚幾乎無差別。很多能誘發(fā)人類疾病的基因和蛋白變異在豬上同樣存在, 例如阿爾茨海默病、帕金森氏癥以及肥胖癥[37], 因此, 豬可作為人類疾病研究模型。

豬也是人類器官移植的合適供體之一, 但最適于醫(yī)學研究的豬品種仍無定論, 其中能否做供體的標準是器官達到特定大小時的豬齡。很多實驗室用家豬來改造成潛在異種移植供體, 但家豬成年時體重與人類正常體重相差甚遠, 大約1歲后家豬的器官體積便過大, 無法用于人類器官移植。相比之下, 小型豬的體重與人類體重相似, 因此它們的器官在任何年齡都有潛在的應用前景。盡管目前尚不清楚移植后器官的生長潛能與供體和受受體器官大小的控制程度, 但將普通家豬的腎臟移植到小型豬體內(nèi), 3個月后移植的腎臟體積為初始體積的3.7倍, 而相同時間內(nèi)正常的小型豬腎臟的體積為初始體積的1.2倍[38]。同樣的情況也發(fā)生在肺移植豬上, 肺的生長比率增加, 導致器官功能受損。將家豬的器官異種移植到狒狒體內(nèi)后, 器官快速生長, 最終導致皮質壞死[39]。因此, 小型豬更適合作為器官供體。

豬的繁殖特性也使豬有利于基因編輯動物的獲得。它們產(chǎn)仔量大、性成熟早(5個月)、孕周短(114 d)、發(fā)情周期頻繁(每3周1次)[40]。因此, 可以在較短的時間內(nèi)生產(chǎn)出基因編輯純合子豬。

動物界中非人靈長類動物與人類的親緣關系最近, 其解剖學、生理學、營養(yǎng)代謝、疾病特征等與人類相似度最高, 但是非人靈長類動物資源匱乏、成本高, 對其進行基因修飾及胚胎操作難度較大, 而且相關試驗會受倫理限制。而豬群體大、飼養(yǎng)成本低、基因編輯及胚胎操作技術成熟, 作為醫(yī)學動物模型受到的倫理爭議較非人靈長類動物少。

鑒于豬的器官大小、繁殖性能、生理特性、成本低、倫理爭議少等特點, 豬在人類疾病模型、藥物開發(fā)、生產(chǎn)人源蛋白、器官移植供體等方面很具有應用前景。

3.2 疾病模型豬

豬是目前生物醫(yī)學研究中重要的大型模式動物之一。豬有許多人類疾病, 如心血管疾病、肥胖癥和糖尿病等。通過模式動物可以研究那些自然發(fā)生或者由于基因突變引起的疾病的發(fā)病機制?；诨虿僮魇侄潍@得的人類疾病模型豬對研究人類疾病的發(fā)病機理、開發(fā)醫(yī)療診斷新技術等具有重要意義。豬作為人類疾病研究的模型動物可追溯到1998年[41]。目前, 研究人員已經(jīng)成功建立了大量的人類疾病模型豬, 包括心血管疾病[42]、免疫疾病[43-44]、神經(jīng)退行性疾病[45-46]、遺傳性疾病[47]、癌癥[48]、代謝病[49]、腎病[50]等, 這些模型對于揭示疾病發(fā)生的機制、尋找藥物靶點、開展藥物篩查和藥效評價、探索治療及診斷疾病的方法等均具有重要意義[51]。

由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)席卷全球。當前新冠病毒變種在全球流行的范圍更廣, 針對COVID-19的動物模型會顯著加快SARS-CoV-2/COVID-19的臨床救治和藥物、疫苗研發(fā)等相關研究進展。目前已有多團隊已經(jīng)制備了人血管緊張素轉換酶2(human angiotensin converting enzyme 2,hACE2)轉基因小鼠及恒河猴動物模型, 但它們感染SARS-CoV-2后, 只是體重減輕, 出現(xiàn)肺炎的跡象, 但癥狀并不嚴重[52-54], 與人類的病理過程相差甚遠。2021年, 中國農(nóng)業(yè)大學吳森教授領銜多團隊制備了新冠肺炎豬模型, 該豬的ACE2被hACE2取代, 從hACE2人源化豬模型的肺和腎中分離出來的原代上皮細胞對SARS-CoV-2的感染高度敏感, 并表現(xiàn)出明顯的細胞病變效應和對病毒N蛋白的高免疫熒光信號[55]。但該模型并未開展活體攻毒實驗, 是否更適合用于COVID-19相關研究有待更多實驗的驗證。

營養(yǎng)和能量過剩會導致身體處于慢性低度炎癥狀態(tài), 引發(fā)代謝性炎癥性疾病,含肥胖、2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化[56]。2021年, 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊述林研究員帶領團隊成功構建了人類代謝性炎癥模型豬, 他們利用多基因定點整合技術, 將人類3種代謝性疾病易感基因(GIPRdn、hIAPP和PNPLA3I148M)轉入豬基因組, 并由組織特異性啟動子調(diào)控GIPRdn和hIAPP在胰島β細胞表達, 調(diào)控人PNPLA3I148M在肝臟中表達, 該豬模型表現(xiàn)出葡萄糖耐量受損、脂肪性胰腺、脂肪和肝臟慢性炎癥等病理特征。該豬模型脂肪和肝臟代謝炎癥觸發(fā)及級聯(lián)分子特征與人類高度相似, 適宜作為臨床轉化醫(yī)學研究的實驗材料[57]。

豬在研究心血管疾病、免疫缺陷模型、脂代謝異常疾病模型、癌癥模型、神經(jīng)退行性疾病、遺傳疾病等方面都作出卓越貢獻[58]。隨著研究的不斷深入, 發(fā)現(xiàn)很多疾病并不是由單一基因控制, 豬與人雖然相識度很高, 但還是存在一定的差異, 即使編輯了人類的某些關鍵基因, 但模型豬有可能體現(xiàn)不出人類的疾病特征[59]。因此, 要得到更完美的疾病模型豬, 一方面需要尋找更關鍵的致病基因, 另一方面要制備多基因編輯豬。

3.3 器官移植供體豬應用難關

器官移植是終末期器官衰竭患者的最佳治療手段, 目前慢性疾病的患病率仍在緩慢提高, 但器官捐獻數(shù)量有限, 器官供體存在很大的缺口。異種器官移植被認為是緩解人類供體器官短缺的重要途徑[60]。豬的解剖特征、生理指標、血型抗原等都與人的極其相似[61],是很好的異種器官移植供體。然而, 安全有效地開展豬器官異種移植還存在兩大障礙：①免疫排斥；②豬攜帶的內(nèi)源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retroviruses,PERVs)具跨物種傳播風險[62]。而針對特定基因進行修飾的基因編輯豬, 能成功翻越這些障礙。

3.3.1 降低移植后宿主免疫排除反應 移植免疫排斥反應是器官移植后宿主機體對移植物通過特異性免疫應答使其破壞的過程[61]。器官移植異種排斥包括先天性免疫(innate immunity)與適應性免疫(adaptive immunity)應答。參與先天性免疫的有單核細胞(monocytes)、巨噬細胞(macrophages)[63]、自然殺傷(natural killer, NK)細胞[64], 補體及凝血級聯(lián)途徑[64]。另外, 天然抗體(natural antibodies,NAbs)通常也被定義為先天免疫的成分之一。天然抗體最重要的作用是識別α-1,3-galactose(Gal)。Gal是一種碳水化合物, 存在豬和大多數(shù)哺乳動物(人類和東半球猴子除外)細胞表面的糖蛋白和糖脂上, 而人類祖先在進化過程中1,3-半乳糖基轉移酶(α-1,3-galactosyltransferase,Gal T)發(fā)生了移位突變, 使得細胞表面不再存在Gal。因此, 引起免疫排斥的主要因素是人的天然異種抗體識別豬細胞表面的異種抗原Gal表位。2002年, Lai等[65]成功獲得了α-1,3-半乳糖基轉移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除豬, 能阻斷Gal表位生成, 克服了異種器官免疫排斥問題。2011年, Hauschild等[66]通過ZFN編輯技術敲除GGTA1雙等位基因, 并成功制備了α-1,3-半乳糖基因敲除豬。后續(xù)研究顯示, 敲除GGTA1能成功避開發(fā)生在移植后幾小時內(nèi)發(fā)生的超急性排斥反應(hyperacute rejection,HAR), 但在術后幾天至幾周會發(fā)生延遲性異種移植排斥反應(delayed xenograft rejection,DXR)；而這主要是由另外2種免疫抗原-單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophosphate-nacetylneuraminic acid hydroxylase, CMAH)基因編碼的β-1,4-N乙酰半乳糖氨基轉移酶2(β-1,4-Nacetylgalactosaminyl transferase 2,b4GALNT2)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-g1yco1-ylneuraminicacid,Neu5Gc)引起的[67-69]。2017年, Gao等[70]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬胎兒成纖維細胞(porcine embryonic fibroblasts,PFFs)中同時敲除GGTA1和CMAH基因, 并成功獲得了11頭具有相同表型的雙等位基因GGTA1/CMAH DKO仔豬；與來自GGTA1基因敲除豬的細胞相比, 來自GGTA1/CMAH DKO豬的細胞中人抗體結合和抗體介導的補體依賴性細胞毒性顯著降低, 這說明編輯豬在異種移植后體液排斥反應減輕。

針對早期抗體介導的異種移植排斥反應, 科學家也對其他基因進行了編輯。①人血紅素氧化酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)基因。HO-1通過抗炎、抗凋亡、抗增殖等作用, 幫助細胞免受氧化損傷[71]。②人腫瘤壞死因子(human tumor necrosis factor,TNF)基因hA20。其編碼鋅指蛋白酶, 可以抑制核因子κB(nuclear factorκB)的活化和TNF介導的細胞凋亡。該基因僅在豬的心臟表達, 能部分抑制缺血-灌注損傷, 但不能增加器官存活率。③在內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)表面表達的抗凝血蛋白人血栓調(diào)節(jié)蛋白(human thrombomodulin)基因CD141。對豬心臟進行該基因修飾后有助于受體狒狒的長期存活[72-73]。④豬血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)基因的修飾。vWF是一種糖蛋白, 通過與穩(wěn)定因子Ⅷ結合, 誘導血小板在血管損傷部位黏附。希望改良豬能減輕靈長類動物血液與豬ECs的凝血誘導。這種保護作用已在體外得到證實, 但其對異種移植物存活的影響尚未確定。⑤外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1, entpd1或hCD39)基因。其編碼的酶將三磷酸腺苷和二磷酸腺苷水解為一磷酸腺苷, 隨后水解為腺苷, 具有抗血栓和心血管保護作用, hCD39轉基因已應用至多種豬移植模型中[74]。

在移植后, T細胞可直接攻擊移植物, 還可促進B和NK細胞反應[75-76]。在豬-猴異種移植中, 免疫抑制治療并不能完全控制T細胞反應, 包括細胞毒性、細胞因子產(chǎn)生以及固有細胞毒性細胞的募集和活化[77-78]。利用基因編輯技術來消除T細胞的免疫應答, 使異種器官不受免疫攻擊也備受關注。科學家已試著將Fas配體[79]、CTLA4Ig[80]和抗CD2單克隆抗體[81]引入源豬體內(nèi), 旨在實現(xiàn)移植后的抑制局部免疫反應。轉CTLA4Ig基因的豬會出現(xiàn)全身免疫抑制, 這些豬已被證明具有繁殖能力[80], 從它們身上移植的角膜在非人靈長類動物中顯示出更高的存活率[82]。然而, 異種移植免疫逃避會破壞移植后個體的免疫保護能力, 還需要通過深入研究引入更好的方式。

3.2.2 清除豬內(nèi)源性逆轉錄病毒 除了豬與人的免疫相容性問題外, 豬攜帶的內(nèi)源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retroviruses, PERVs)也阻礙了異種器官移植的臨床應用。PERVs是嵌在豬基因組的病毒, 在豬體內(nèi)不具毒性, 但當豬細胞和人細胞接觸時, 這種病毒會從豬基因組“跳”至人基因組中, 對人形成毒性。Yang等[29]證明了在永生化豬細胞系中滅活PERVs活性的可行性, 2017年, 哈佛大學醫(yī)學院遺傳學教授Boeke等[83]在Science雜志上宣布培育出世界首批不攜帶內(nèi)源性逆轉錄病毒的“豬1.0”, 從根本上解決PERVs可能導致病毒跨物種傳播的風險。2018年, 該團隊的“豬2.0”誕生, 又進一步解決了異種器官移植免疫排斥問題[84]。小豬3.0在PERVs敲除的小豬體內(nèi)進一步移除了3個激活免疫反應的基因, 插入了6個移植人體免疫反應的基因和3個調(diào)節(jié)免疫反應的基因。這些小豬細胞與人類抗體結合率降低了90%, 人體免疫排斥反應將大大減輕, 而且這些小豬都很健康, 生育能力強勁, 器官功能正常。這些基因編輯豬, 為實現(xiàn)異種器官移植提供了關鍵的材料, 也是后續(xù)開展移植實驗的基礎。

4 基因編輯豬存在的問題及發(fā)展趨勢

結合基因編輯及體細胞克隆技術制備的基因編輯豬, 在豬的經(jīng)濟性狀改良、抗病性能提高及人類疾病病理和異種器官移植研究等方面應用前景巨大。但是基因編輯豬的產(chǎn)業(yè)化應用仍存在很多問題：首先, 基因編輯過程中借助同源定向修復的精確敲入(knock in,KI)及定點突變效率較低；其次, 基因編輯技術仍有明顯的脫靶效應, 給基因編輯豬的制備帶來了不確定性, 在很大程度上限制了基因編輯豬的產(chǎn)業(yè)化；第三, 通過體細胞克隆技術制備基因編輯豬的效率低；另外, 優(yōu)良的性狀或人類疾病的精確模擬大多數(shù)受多基因的控制, 因此是需要針對多基因進行編輯的。

針對存在的問題, 可以從以下幾個方面改進：①改良基因編輯技術, 提高基因組定點修飾效率, 降低其脫靶效應；②尋找提高克隆豬生產(chǎn)效率的更佳方法；③優(yōu)化多基因編輯豬制備流程, 實現(xiàn)豬的多性能改良, 最大程度地降低免疫排斥及徹底清除PERVs, 更準確地模擬人類疾??；④優(yōu)化基因編輯豬的每個環(huán)節(jié), 降低制備成本；⑤基因編輯豬市場化相關法律條例的頒布也迫在眉睫?；蚓庉嬝i的相關研究無疑將為農(nóng)業(yè)性狀改良、生物醫(yī)學的快速發(fā)展提供動力。

5 結語

目前, 已有一系列編輯豬模型問世, 但基因編輯豬的產(chǎn)業(yè)化應用仍有諸多困難。如基因編輯技術目前仍存在體內(nèi)導入效率低、基因編輯效率低、潛在脫靶效應等缺點；目前建立的疾病模型還不能精確地模擬人類疾病特征；進一步降低異種器官移植后宿主對外源器官的免疫排斥；徹底清除豬體內(nèi)攜帶的內(nèi)源性病毒；在改良生長性狀時, 最好是基因結構改變小、不影響基因其他功能的編輯方法。盡管如此, 基因編輯豬的研究無疑能在生物醫(yī)學及農(nóng)業(yè)領域發(fā)揮巨大作用。因此, 未來的發(fā)展要加大原創(chuàng)性的研發(fā)力度, 規(guī)?；夹g體系, 實現(xiàn)更高效、更精細、更便捷、多層次、多基因編輯, 推進相關法律標準的制定, 使基因編輯豬能盡快的進入市場。