楊怡 綜述 牛陽 袁玲 審校

1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004

人角膜基質(zhì)細(xì)胞(human corneal stromal cells，HCSCs)是正常角膜基質(zhì)層中的主要細(xì)胞成分，存在于平行排列的膠原纖維之間，通過細(xì)胞突起頂部的間隙進(jìn)行相鄰細(xì)胞間物質(zhì)信息傳遞[1]；其具有合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分，如膠原蛋白、糖胺聚糖、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)以及受到刺激后向角膜細(xì)胞修復(fù)表型轉(zhuǎn)化的功能，在維持角膜結(jié)構(gòu)完整性和創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[2]。

人角膜基質(zhì)創(chuàng)傷愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，當(dāng)角膜基質(zhì)層受到創(chuàng)傷、感染或手術(shù)后，處于靜息狀態(tài)的HCSCs被刺激，轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞(human corneal keratocytes，HCK)，繼而發(fā)生死亡或轉(zhuǎn)化為修復(fù)表型，引起角膜基質(zhì)混濁，角膜深層出現(xiàn)新生血管、持續(xù)性炎癥反應(yīng)、纖維化甚至是不同程度的角膜瘢痕，導(dǎo)致畏光和視力下降等臨床癥狀[3]。感染性角膜潰瘍、免疫紊亂(如圓錐角膜等)以及目前臨床應(yīng)用激光矯正視力角膜手術(shù)(如準(zhǔn)分子激光手術(shù)、激光光學(xué)角膜切削術(shù)等)均能引起角膜基質(zhì)混濁和瘢痕[4]。同時(shí)HCSCs的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化可導(dǎo)致角膜的透明度降低，使視力受到損害。因此，深入研究HCSCs表型的轉(zhuǎn)化過程以及其調(diào)控機(jī)制，不僅有助于了解角膜損傷修復(fù)的發(fā)展過程，而且對(duì)于發(fā)現(xiàn)、預(yù)防和治療角膜基質(zhì)纖維化、減少瘢痕形成，甚至逆轉(zhuǎn)瘢痕損傷程度，具有重要的臨床意義。本文就HCSCs表型、標(biāo)志物、表型的轉(zhuǎn)化及其體外轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為發(fā)現(xiàn)新的臨床治療手段提供思路。

1 HCSCs表型

1.1 HCSCs

HCSCs是位于角膜的纖維母細(xì)胞，是一種正常角膜細(xì)胞表型，其能合成并沉積膠原蛋白和硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖(keratan-sulfate proteoglycans，KSPG)等成分，調(diào)節(jié)基質(zhì)組織，有助于提高角膜的機(jī)械強(qiáng)度和光學(xué)清晰度。正常狀態(tài)下，HCSCs在細(xì)胞周期的G0期處于靜息狀態(tài)，呈扁平、樹突狀，隨著哺乳動(dòng)物胚胎的發(fā)育，HCSCs合成并分泌I型膠原蛋白(collagenⅠ，Col Ⅰ)、Col Ⅲ、Col Ⅴ和Col Ⅵ等ECM成分，其中Col Ⅰ最為豐富，Col Ⅴ是膠原纖維組裝的重要調(diào)控因子[5]。HCSCs所分泌的硫酸角質(zhì)素、硫酸軟骨素等蛋白多糖及晶狀體蛋白等(例如乙醛脫氫酶)具有減少角膜細(xì)胞光散射的作用，其中晶狀體蛋白也可以降低視軸中其他眼部細(xì)胞(如晶狀體上皮細(xì)胞)的光散射[6-7]，同時(shí)HCSCs能夠合成和降解膠原分子，還能產(chǎn)生MMP，在ECM重構(gòu)、細(xì)胞基質(zhì)相互作用、炎癥細(xì)胞募集和細(xì)胞因子激活等維持基質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。

1.2 人角膜成纖維細(xì)胞

人角膜成纖維細(xì)胞由激活狀態(tài)的HCK轉(zhuǎn)化而來，轉(zhuǎn)化發(fā)生在傷口邊緣的脫細(xì)胞區(qū)。人角膜成纖維細(xì)胞呈梭形或紡錘形，胞體細(xì)長(zhǎng)并具有多個(gè)核仁，與成纖維細(xì)胞相似，因而被稱為角膜成纖維細(xì)胞[9]。在角膜受到創(chuàng)傷、手術(shù)或感染刺激時(shí)，HCK迅速發(fā)生凋亡，并轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，這些修復(fù)表型的細(xì)胞參與纖維性創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，通過改變環(huán)境條件調(diào)節(jié)基因表達(dá)、收縮性和基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生等[10]，促進(jìn)角膜再生或誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維化瘢痕，有助于創(chuàng)傷修復(fù)。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)瘢痕和角膜營(yíng)養(yǎng)不良等類型的角膜混濁主要是由活化后的HCK光散射增加引起的[11]。

人角膜成纖維細(xì)胞在角膜基質(zhì)損傷修復(fù)過程中不斷合成各種ECM成分和蛋白酶，重塑基質(zhì)層，在維持角膜透明度和機(jī)械穩(wěn)定性方面起著重要的作用[12]。在細(xì)菌侵入角膜基質(zhì)層誘發(fā)白細(xì)胞浸潤(rùn)和潰瘍時(shí)，角膜成纖維細(xì)胞在炎癥因子的刺激下產(chǎn)生多種化學(xué)物質(zhì)和黏附因子，從而促進(jìn)角膜損傷的修復(fù)，在角膜的防御系統(tǒng)及角膜的創(chuàng)傷愈合過程中起至關(guān)重要的作用[13]。

1.3 人角膜肌成纖維細(xì)胞

人角膜肌成纖維細(xì)胞可由人角膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是角膜手術(shù)、損傷和感染后在角膜基質(zhì)中觀察到的另一種修復(fù)表型，也是成纖維細(xì)胞被激活后的一個(gè)具有較大外形的細(xì)胞亞群。在正常未受傷的角膜中未檢測(cè)到肌成纖維細(xì)胞[14]。人角膜肌成纖維細(xì)胞是具有平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和生理特性的成纖維細(xì)胞，具有收縮傷口、分泌ECM并與周圍基底產(chǎn)生黏附結(jié)構(gòu)的能力。因此，人角膜肌成纖維細(xì)胞可能在創(chuàng)傷性角膜撕裂后恢復(fù)眼部完整性的過程中發(fā)揮重要作用。

2 HCSCs表型的標(biāo)志物

2.1 HCSCs標(biāo)志物

HCSCs是一種來源于神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細(xì)胞，其典型特征是存在某些細(xì)胞表面標(biāo)志物和中間纖維。CD34和CD133是體內(nèi)靜息狀態(tài)HCSCs的典型標(biāo)志物，在角膜創(chuàng)傷后，CD34表達(dá)迅速消失，HCSCs被激活，傷口附近的HCK分化為成纖維細(xì)胞表型[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)HCK在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下，角蛋白、核心蛋白聚糖等富含亮氨酸的小蛋白多糖以及乙醛脫氫酶1A1(acetaldehyde dehydrogenase 1A1，ALDH1A1)和ALDH3A1亞型等角膜晶狀體蛋白的表達(dá)迅速消失[7，10]，同時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞也失去HCK特有的樹突狀結(jié)構(gòu)，具有了成纖維細(xì)胞的特性[17-20]。

2.2 人角膜成纖維細(xì)胞標(biāo)志物

角膜創(chuàng)傷導(dǎo)致與傷口相鄰的HCK向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生高表達(dá)的纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、整合素α5β1、MMP-1、MMP-3和MMP-9，并分泌膠原蛋白和蛋白多糖[21]。研究還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的人角膜成纖維細(xì)胞中可以檢測(cè)到CD90 mRNA和蛋白，但在新鮮分離的HCK中未檢測(cè)到，因此認(rèn)為CD90的表達(dá)是由HCK轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞引起的[22]。角膜成纖維細(xì)胞也是基質(zhì)混濁、角膜晶狀體蛋白減少和ECM表達(dá)改變的來源[23]。

2.3 人角膜肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物

肌成纖維細(xì)胞特定生化標(biāo)志物是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，該肌動(dòng)蛋白是肌成纖維細(xì)胞特征性表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，也具有增強(qiáng)角膜組織收縮的功能，在組織纖維化、傷口愈合及瘢痕形成中起著重要作用[24-25]。有研究表明角膜肌成纖維細(xì)胞最早的基質(zhì)前體表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)α-SMA或結(jié)蛋白，α-SMA是細(xì)胞發(fā)育成熟的后期標(biāo)志物[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，角膜創(chuàng)傷愈合后形成的瘢痕中含有大量的纖維粘連蛋白EDA片段和Col Ⅲ，而在角膜發(fā)育過程中幾乎看不到這2種蛋白，認(rèn)為這2種蛋白可作為纖維化標(biāo)志物[5]。與α-SMA和Col Ⅲ一樣，血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)在健康人的HCSCs中不表達(dá)，在損傷后的細(xì)胞中有表達(dá)[27]。TSP-1是在傷口愈合過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的重要激活因子[28]。

Nishtala等[31]利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與HCK相比，角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中的整合素信號(hào)傳導(dǎo)、SLIT-ROBO通路(PFN1、CAPR1、PSMA5)以及ECM蛋白(SERPINH1、SPARC、ITGβ1、CRTAP)表達(dá)增強(qiáng)，表明其在傷口愈合過程中發(fā)揮作用。

3 HCSCs表型的轉(zhuǎn)化

3.1 體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程

當(dāng)角膜受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、手術(shù)或感染后，損傷區(qū)域周圍的HCK通過凋亡來防止修復(fù)過程引起的對(duì)組織結(jié)構(gòu)不利的變化。損傷約6 h后，相鄰的靜息狀態(tài)HCSCs被激活，細(xì)胞大小和細(xì)胞器含量均增加，并在24 h內(nèi)向損傷處遷移，開始從HCK向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)和血小板衍生生長(zhǎng)因子BB、TGF-β等生長(zhǎng)因子介導(dǎo)[32-33]，與細(xì)胞FN和機(jī)械張力共同調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)，從而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。轉(zhuǎn)化后的角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增生期并向損傷部位遷移，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)和功能均發(fā)生改變，能夠識(shí)別、清除死亡細(xì)胞[10]。創(chuàng)傷后48 h細(xì)胞抵達(dá)損傷處，表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征，包括梭形、多核仁和缺乏胞質(zhì)顆粒[34]。這些成纖維細(xì)胞通過肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑，從星狀變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)狀并獲得應(yīng)力[35]。TGF-β調(diào)節(jié)靜息狀態(tài)HCSCs轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，上調(diào)ECM物質(zhì)分泌，并在細(xì)胞遷移至創(chuàng)面后誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、結(jié)蛋白和波形蛋白的表達(dá)并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[34]。

在角膜損傷后1～2周，具有收縮特性的肌成纖維細(xì)胞進(jìn)入損傷區(qū)并參與基質(zhì)重建，控制創(chuàng)面收縮以及異常ECM沉積，是導(dǎo)致基質(zhì)瘢痕/纖維化和混濁的主要病理過程[36-37]。當(dāng)組織修復(fù)達(dá)到一定程度時(shí)，成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，數(shù)量緩慢減少，肌成纖維細(xì)胞開始侵襲并充滿創(chuàng)傷處，最終形成成熟的瘢痕[38]。經(jīng)過數(shù)月或數(shù)年的修復(fù)，上皮基底膜完全再生，規(guī)則的角膜ECM逐漸取代肌成纖維細(xì)胞及其產(chǎn)生的混濁基質(zhì)，該過程中肌成纖維細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞相互競(jìng)爭(zhēng)，異常的ECM被重吸收，角膜細(xì)胞重新組成前基質(zhì)，角膜透明度逐漸恢復(fù)[37]。

角膜瘢痕的形成導(dǎo)致角膜透明度降低并損害視力，因此，研究角膜傷口愈合過程，探討預(yù)防纖維化和新生血管并發(fā)癥發(fā)生的機(jī)制和方法具有重要的臨床意義。有研究表明，活化的角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞不是終末分化表型，而是可以彼此相互轉(zhuǎn)化的[39]。利用這一點(diǎn)可以針對(duì)HCSCs被激活后的表型轉(zhuǎn)化進(jìn)行體外研究，以預(yù)防瘢痕對(duì)角膜透明度及視力的影響。

3.2 體外轉(zhuǎn)化過程

3.2.1HCK轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞 當(dāng)在體外無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，HCK會(huì)保持樹突狀，通過添加血清、TGF-β或某些生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)其向成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Sharma等[40]將人角膜基質(zhì)切成小塊置于培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中并在37 ℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周或以上，得到角膜成纖維細(xì)胞，然后置于含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，在其融合度達(dá)到60%～70%后改用含10%血清的DMEM培養(yǎng)，在8～12 h后換至含有TGF-β1(1 ng/ml)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～7 d，每24 h更換新鮮不含血清的TGF-β1培養(yǎng)基，成功得到肌成纖維細(xì)胞。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，添加血小板衍生生長(zhǎng)因子BB后，細(xì)胞聚集并形成細(xì)長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞表型[41]。FGF-2具有促進(jìn)細(xì)胞分化、增生、維持成纖維細(xì)胞表型的作用，而堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可通過增加細(xì)胞增生來抑制肌成纖維細(xì)胞分化，從而加速傷口閉合[9]。Soniecka 等[29]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入維生素C和TGF-β1可以誘導(dǎo)角膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

角膜瘢痕形成的關(guān)鍵是TGF-β誘導(dǎo)HCK分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，抑制該分化過程可能對(duì)角膜瘢痕形成具有抑制作用。誘導(dǎo)HCK纖維化的關(guān)鍵因子TGF-β有3個(gè)亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1是角膜創(chuàng)傷愈合過程中釋放的主要亞型，與TGF-β2共同誘導(dǎo)纖連蛋白的合成以及黏著斑的聚集、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、瘢痕收縮和ECM沉積[42]；TGF-β1還可促進(jìn)α-SMA的表達(dá)，在角膜瘢痕形成中起至關(guān)重要的作用。與TGF-β1相似，TGF-β3也可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)細(xì)胞Col Ⅲ和α-SMA表達(dá)增加[41，43]。但也有研究表明TGF-β3能夠刺激角膜成纖維細(xì)胞分泌大量ECM，可以逆轉(zhuǎn)纖維化標(biāo)志物Col Ⅲ的表達(dá)，具有抗纖維化特性，推測(cè)IL-10和TGF-β3是治療角膜修復(fù)和預(yù)防纖維化的潛在靶點(diǎn)[26-27]。

3.2.2成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為HCK 針對(duì)角膜創(chuàng)傷后愈合過程中纖維化表型對(duì)角膜透明度的影響，亟需探索逆轉(zhuǎn)纖維化的方法。體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，在無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、視黃酸、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒、IGF-1和3-異丁基-1甲基黃嘌呤可部分恢復(fù)靜息狀態(tài)的HCSCs的樹突形態(tài)，增加HCK標(biāo)志物ALDH3A1和CD34的表達(dá)，阻止HCK向肌成纖維細(xì)胞分化，可恢復(fù)部分細(xì)胞為HCK表型[41]。Miyagi等[44]將人角膜成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在含有TGF-β1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)α-SMA mRNA表達(dá)量與TGF-β1濃度表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，并證明了HGF可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞表型分化過程，結(jié)果顯示HGF通過減少角膜纖維化來改善傷口愈合。

目前大多數(shù)針對(duì)角膜纖維化的研究?jī)H能抑制該過程。Park等[45]發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的角膜成纖維細(xì)胞中α-SMA表達(dá)上調(diào)，增加細(xì)胞中角蛋白和ALDH1A1的表達(dá)，具有維持HCK表型、抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。研究發(fā)現(xiàn)將含10%胎牛血清的DMEM/Ham培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代HCK置于不同濃度光敏劑Ce6下，670 nm光照13 min，HCK向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化在短期內(nèi)似乎被抑制，但對(duì)CD34陽性的HCK激活沒有影響[46]。Mohan等[47]研究發(fā)現(xiàn)核心蛋白聚糖基因轉(zhuǎn)移可有效抑制TGF-β誘導(dǎo)的HCK轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體蛋白(insulin-like growth factor 2 receptor，IGF2R)可調(diào)節(jié)人角膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制IGF2R的合成可減少成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并可用于控制角膜纖維化[48]。有研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿也可以在體外人角膜纖維化模型中抑制角膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出抗纖維化作用[29]。Angunawela等[49]對(duì)比研究了添加TGF-β1和6-磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate，M6P)的含血清培養(yǎng)基與僅添加TGF-β1的含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HCK，發(fā)現(xiàn)M6P可抑制TGF-β1介導(dǎo)的人角膜成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。體外研究顯示，富含生長(zhǎng)因子的血漿(plasma rich in growth factor，PRGF)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有逆轉(zhuǎn)作用，可降低與成纖維細(xì)胞分化相關(guān)的所有細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，表明PRGF可能促進(jìn)角膜傷口愈合再生并抑制瘢痕的形成[50-51]。

在體外模型中，將聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)-DNA納米顆粒介導(dǎo)可溶性TGF-β2受體的胞外區(qū)基因?qū)肴私悄こ衫w維細(xì)胞中可抑制肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[40]。Nicholas等[26]使用建立的人角膜成纖維細(xì)胞3D體外模型，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)的外源性刺激可使α-SMA表達(dá)下調(diào)，并抑制了角膜成纖維細(xì)胞的遷移，提示S1P可能具有抗角膜纖維化能力。近年來，雷帕霉素被發(fā)現(xiàn)具有抗纖維化和抗新生血管的作用，對(duì)堿損傷也具有保護(hù)作用，并可抑制堿損傷后成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化過程[52]。

4 HCSCs的體外轉(zhuǎn)化機(jī)制

角膜創(chuàng)傷愈合后的瘢痕形成和透明度降低是影響視力的關(guān)鍵因素，深入了解該過程中涉及的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和信號(hào)傳導(dǎo)中間體，尋找有效干預(yù)角膜愈合中瘢痕形成的方法，可為臨床防治角膜創(chuàng)傷愈合過程所帶來不利影響提供理論指導(dǎo)。

4.1 PI3K/Akt-1和RhoA/ROCK信號(hào)通路

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)與細(xì)胞表面的EGF受體結(jié)合，激活酪氨酸激酶，并生成ECM分子，可促進(jìn)細(xì)胞增生。研究發(fā)現(xiàn)EGF通過激活EGF受體和PI3K/Akt-1信號(hào)通路，協(xié)同TGF-β1誘導(dǎo)HCK向肌成纖維細(xì)胞分化和增生，增加FN的分泌，使ECM成分發(fā)生變化[53]。

分布于神經(jīng)纖維內(nèi)的一種神經(jīng)肽P物質(zhì)(SP)參與角膜創(chuàng)傷的愈合過程，Soniecka 等[54]研究利用體外培養(yǎng)的人角膜纖維化模型發(fā)現(xiàn)SP具有誘導(dǎo)角膜細(xì)胞收縮，上調(diào)Col Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Lumican基因表達(dá)的作用，可以促進(jìn)纖維化標(biāo)志物α-SMA和FN的分泌和表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)SP可通過激活PI3K/Rac1/RhoA通路和IL-8增強(qiáng)角膜細(xì)胞遷移，激活RhoA/ROCK通路誘導(dǎo)HCK發(fā)生纖維化改變，從而促進(jìn)角膜創(chuàng)面愈合。

4.2 TGF-β/Smad信號(hào)通路

TGF-β是角膜瘢痕形成過程中的關(guān)鍵因子，由TGF-β超家族成員特異性激活的Smad蛋白作為TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游重要的信號(hào)分子，在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增生、遷移和分化。Smad信號(hào)傳導(dǎo)是典型的TGF-β信號(hào)通路，可直接或與其他通路協(xié)同將TGF-β通路的信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控TGF-β在細(xì)胞水平介導(dǎo)的多種生物學(xué)效應(yīng)[55]。TGF-β與其受體的結(jié)合可以誘導(dǎo)Smad受體磷酸化，導(dǎo)致通過與Smad結(jié)合并易位至細(xì)胞核內(nèi)與其他共激活因子、DNA結(jié)合并活化啟動(dòng)子。

Sarenac等[56]采用IGF-1干預(yù)HCK，發(fā)現(xiàn)其可以減弱TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制HCK向肌成纖維細(xì)胞的分化，因此認(rèn)為IGF-1是抗纖維化治療的有效輔助手段。而Izumi等[57]則發(fā)現(xiàn)IGF-1可以有效刺激TGF-β2誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增生，而不會(huì)逆轉(zhuǎn)纖維化。Guo等[58]發(fā)現(xiàn)一種特異性阻斷TGF-β/Smad的抑制劑Trx-SARA，其可通過阻斷Smad途徑抑制角膜成纖維細(xì)胞的增生，還能阻斷TGF-β1刺激角膜成纖維細(xì)胞中FN的表達(dá)，這也表明FN受到TGF-β1的調(diào)節(jié)。Chen等[59]發(fā)現(xiàn)葡萄糖胺可以靶向誘導(dǎo)角膜成纖維細(xì)胞中KLF4因子的表達(dá)，抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)，并通過抑制Smad2磷酸化和ERK依賴性信號(hào)傳導(dǎo)，降低細(xì)胞中膠原蛋白收縮能力，表明成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少。

4.3 TGF-β/p38信號(hào)通路

TGF-β受體激活下游的信號(hào)分子似乎對(duì)角膜成纖維細(xì)胞中α-SMA和ECM成分的合成起不同的調(diào)節(jié)作用，其中TGF-β1可有效刺激p38誘導(dǎo)的磷酸化，在角膜纖維化傷口修復(fù)中p38蛋白是TGF的重要中間體[60]。Guo等[61]在TGF-β1刺激的人角膜成纖維細(xì)胞中添加p38抑制劑，發(fā)現(xiàn)α-SMA和其他纖維化基因(FN、TSP-1和Col Ⅲ)表達(dá)顯著降低，表明p38抑制劑可能會(huì)降低角膜傷口愈合過程中ECM中的纖維化蛋白沉積，從而阻止基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞；研究還發(fā)現(xiàn)阻斷p38途徑可使肌成纖維細(xì)胞變回成纖維細(xì)胞，表明p38抑制劑可能是一種潛在的預(yù)防或治療人角膜纖維化的藥物。

4.4 miRNA相關(guān)信號(hào)通路

角膜基質(zhì)細(xì)胞纖維化的發(fā)生及發(fā)展涉及多種相關(guān)調(diào)節(jié)因子，是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。有研究發(fā)現(xiàn)特異性地上調(diào)HCSCs內(nèi)miR-29a-3p的含量，可以抑制HCSCs向成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，或可抑制或延緩角膜組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展[62]。與健康角膜細(xì)胞相比，人角膜瘢痕組織和TGF-β1誘導(dǎo)的角膜肌成纖維細(xì)胞中miR-145的表達(dá)增加了13倍。TGF-β1可以促進(jìn)miR-145的表達(dá)，通過下調(diào)KLF4(一種已知的α-SMA的負(fù)調(diào)節(jié)因子)間接誘導(dǎo)α-SMA表達(dá)，抑制miR-145顯著降低了TGF-β1分泌和肌成纖維細(xì)胞的收縮力。因此，miR-145在TGF-β1刺激的角膜肌成纖維細(xì)胞分化和活化中起重要作用，有望用于預(yù)防或治療角膜纖維化引起的視力喪失[63]。

與靜息狀態(tài)的HCSCs相比，角膜肌成纖維細(xì)胞中的LINC00963表達(dá)量減少一半，LINC00963的過表達(dá)抑制角膜肌成纖維細(xì)胞的形成。研究發(fā)現(xiàn)LINC00963可以通過下調(diào)miR-143-3p的表達(dá)來抑制角膜成纖維細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)。此外，無論是促進(jìn)LINC00963還是抑制miR-143-3p的表達(dá)都可以顯著降低肌成纖維細(xì)胞收縮性以及Col Ⅰ和Ⅲ的分泌，這是導(dǎo)致角膜纖維化的關(guān)鍵[64]。

綜上所述，HCSCs的表型轉(zhuǎn)化對(duì)于人角膜損傷修復(fù)過程所引起的瘢痕組織形成和角膜透明度降低等方面具有至關(guān)重要的作用。因此，深入研究HCSCs表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制及干預(yù)角膜瘢痕形成的調(diào)控機(jī)制，有助于臨床防治患者角膜纖維化和術(shù)后角膜混濁，為發(fā)現(xiàn)新的臨床治療手段提供理論指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝本文得到了美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Schepens研究所Zieske實(shí)驗(yàn)室和Ciolino實(shí)驗(yàn)室的共同指導(dǎo)和幫助